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ESERCIZI di BIOLOGIA MOLECOLARE A.A 2004-2005. ESERCIZIO n°1 Il plasmide pNEB è una molecola di DNA circolare di 2713 bp. La soluzione ottenuta dopo il.

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1 ESERCIZI di BIOLOGIA MOLECOLARE A.A

2 ESERCIZIO n°1 Il plasmide pNEB è una molecola di DNA circolare di 2713 bp. La soluzione ottenuta dopo il processo di purificazione presenta il seguente spettro di assorbimento nellUV visibile: A (nm) 0,25

3 1)Qual è la concentrazione MOLARE della soluzione?(d=cammino ottico=0,3 cm) [C=30,7 X 10 –9 M=30,7 nM] 2) Qual è la concentrazione in ng\ l? [C=55 ng\ l] 1)Considerando che per la misura allo spettrofotometro, 5 l della soluzione originaria sono stati diluiti in 95 l di acqua, qual è la concentrazione molare della soluzione originaria? [C=614 X 10 –9 M=614 nM; C=1,1 g\ l] 1)Quale sarebbe stata lAssorbanza osservata se la misura fosse stata eseguita sulla soluzione originaria? [ A = 4,99] 2)Considerando che il volume della soluzione originaria rimasta è 30 l, quanti g totali di DNA abbiamo? [DNA TOT = 33 g]

4 ESERCIZIO n°2 Avendo 815 ·10 -6 g. di u oligonucleotide a singolo filamento (primer) lungo 24 nt, in quanti l di acqua è necessario scioglierli per ottenere una soluzione 100 M? [V=1029 l=1,3 ml] Diluiamo 1 l della soluzione in 99 l di acqua. Quale risulterà lassorbanza a nm di tale soluzione? [ A=0,24] ESERCIZIO n°3 Il Servizio di Sequenziamento richiede per eseguire la reazione -500 ng. di campione da sequenziare -6,4 pmol delloligonucleotide utilizzato come primer. 1)Quanti l di una soluzione 125 nM di un plasmidio lungo 3215 bp da sequenziare devo inviare? [ 1,88 l ] 2)Quanti l di oligonucleotide 10 M? [ 0,64 l ]

5 ESERCIZIO n°4 Quanto misura la lunghezza in nm di una molecola di DNA lineare in forma B costituita da 9824 bp? [ L=3340,16 nm=3,34 m ] Quanti giri di elica contiene? [n°giri=982] Se la stessa molecola viene posta in alcool, quindi in condizioni di scarsa umidità, quale modificazione strutturale interviene? [forma A] Di quanto varieranno lunghezza in nm e numero di giri dellelica? [L=2515 nm=2,515 m ; n° giri=893] ESERCIZIO n°5 Qual è il peso molecolare (PM) di una molecola di DNA ds (double strand)di 3421 bp? [PM= Da] Quale invece il peso molecolare di un singolo filamento di DNA di 1750 nucleotidi? [PM= Da] ESERCIZIO n°6 Se una soluzione contenente tre frammenti di DNA lunghi rispettivamente 1600 bp, 650 bp e 1105 bp, viene sottoposta ad elettroforesi su gel di agarosio, quale sarà, a partire dal polo positivo, lordine delle bande osservate al termine della corsa?

6 Il peso molecolare di una molecola di DNA a doppio filamento è: PM= 660 x nro bp DA DOVE DERIVA IL VALORE 660? -è il peso molecolare di una coppia di basi, quindi la metà, 330, corrisponde al peso molecolare di un nucleotide. -Poiché il DNA è costituito da quattro nucleotidi diversi, tale valore rappresenta un VALORE MEDIO C 5 H 10 O 4 PM=130 PO 3 PM=78 PM=111 PM=126PM=135PM=150 PM medio BASI=130 PM medio NUCLEOTIDE 330

7 ESERCIZIO n°7 Un plasmide di 3000 bp viene sottoposto ad una serie di restrizioni analitiche che danno i seguenti risultati visualizzati con gel-elettroforesi: Kb EcoRI BamHI EcoRI BamHI 1)Quanti siti di restrizione ha EcoRI? [2] 2)Quanti siti di restrizione ha BamHI? [2] 3)Quali sono le distanze reciproche tra i siti? Disegnare la mappa di restrizione.

8 ESERCIZIO n°8 Un plasmide di 6000 bp viene sottoposto ad una serie di restrizioni analitiche che danno i seguenti risultati visualizzati con gel-elettroforesi: Kb PvuIIEcoRI BamHISapI Digestioni singole 1)Quanti siti di restrizione ha PvuII?A quale distanza reciproca? [ 3 siti posti a 2000 bp uno dallaltro] 2) Quanti siti di restrizione ha EcoRI? [1] 3) Quanti siti di restrizione ha BamHI? [1] 4) Quanti siti di restrizione ha SapI? [1]

9 Digestioni doppie Kb PvuII EcoRI BamHI PvuII SapI EcoRI PvuII SapI BamHI 1)Quali sono le distanze reciproche tra i siti di restrizione? Disegnare la mappa di restrizione.

10 ESERCIZIO n°9 Un frammento di DNA lineare lungo 5000 bp viene sottoposto ad una serie di restrizioni analitiche che danno i seguenti risultati visualizzati con gel-elettroforesi: Kb EcoRI BamHI EcoRI BamHI 1)Quanti siti di restrizione ha EcoRI? [1] 2)Quanti siti di restrizione ha BamHI? [1] 3)Quali sono le distanze reciproche tra i siti? Disegnare la mappa di restrizione del frammento.

11 ESERCIZIO n°10 Il plasmide A, lungo 4000 bp viene tagliato con BamHI e il risultato della restrizione viene visualizzato tramite gel- elettroforesi: Kb BamHI 1)Quanti siti di restrizione ha BamHI? [2] 2)Qual è la loro posizione reciproca? [1000 bp di distanza] Supponiamo di recuperare e purificare il frammento di restrizione più lungo. Avendo digerito 4 g di plasmide A, se al termine della purificazione del frammento di 3000 bp, la soluzione ottenuta presenta una A 260nm =0,4, quanti ng di DNA sono stati persi nei vari passaggi rispetto alla resa teorica? [ DNA perduto=1260 ng]

12 Il frammento di 3000 bp viene utilizzato come vettore di clonaggio per linserzione di un frammento di DNA di 178 bp ottenuto a sua volta da un secondo plasmide per restrizione BamHI-NdeI. 1) Quale sarà la lunghezza in bp del nuovo costrutto? [3178 bp] 2) Quale sarà il risultato di una successiva digestione del nuovo costrutto con BamHI? [il costrutto circolare viene linearizzato] 3)Nella reazione di ligazione, vettore e inserto devono essere miscelati in rapporto molare 1:3; utilizzando 100 ng di vettore, quanti ng di inserto sono necessari? [quantità inserto=17,62 ng] Se la soluzione dellinserto di 178 bp a disposizione presenta lo spettro di assorbimento nellUV visibile rappresentato in figura, quanti l ne devono essere utilizzati? [V= 0,5 l] A (nm) 0,15

13 ESERCIZIO n°11 Dobbiamo preparare 50 ml di un buffer di trascrizione(10X) così costituito: 500 mM KCl 200 ml Tris-HCl 50 mM MgCl 2 Avendo a disposizione i seguenti stock concentrati Tris-Hcl 1M KCl 2M MgCl 2 1M Quanti ml di ciascuno stock devono essere utilizzati?[KCl 12,5 ml;Tris-HCl 10 ml; MgCl 2 2,5 ml; si aggiungono 25ml di acqua] Considerando che il volume di ciascuno stock è 25 ml e che le tre sostanze hanno i seguenti PM KCL PM=74,56 uma MgCl 2 PM= uma Tris-HCl PM= uma quanti g. di ciascuna sostanza sono stati pesati per preparare i tre stock? [KCl g. 3,728;MgCl 2 g. 5,083;Tris-HCl g. 3,941] Quanti g. di ciascuna sostanza sarebbero serviti per preparare il buffer direttamente dalle polveri?[KCl g.1,864;MgCl 2 g. 0,5; Tris-HCl g. 1,576]

14 ESERCIZIO n°12 Per ottenere un frammento di DNA di 850 bp, esso viene amplificatotramite PCR e gel purificato. Si allestiscono 4 reazioni di PCR, ciascuna avente un Volume di 50 l. Considerando che a PCR ultimata la concentrazione di DNA n soluzione è in ciascun tubo 10 ng\ l e che lefficienza della procedura di gel purificazione è del70 %, quale sarà la concentrazione molare dei 50 l di soluzione finale ottenuti?Quanti g. totali di DNA si ottengono?[c=50x M =50 nM; g.DNA 1,4]

15 ESERCIZIO n°13 La corsa elettroforetica di tre campioni contenenti frammenti di DNA ha fornito il seguente risultato: Determinare la lunghezza in bp e il peso molecolare dei frammenti contenuti in ciascun campione. [1:544bp; 2:1480 bp ;3: 221 bp] 123 La corsa elettroforetica di molecole si dimensioni diverse va linearmente con il LOGARITMO del peso molecolare

16 n° bpln n°bp Distanza (mm) 18577,50, ,962,7 9296,833,2 3835,946, ,799,05


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