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Aspetti generali della Trasduzione del Segnale Concetti chiave Specificità Amplificazione Integrazione Interruttori On-Off Feedback.

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1 Aspetti generali della Trasduzione del Segnale Concetti chiave Specificità Amplificazione Integrazione Interruttori On-Off Feedback

2 Gli organismi multicellulari e in particolare i neuroni hanno GROSSI problemi di comunicazione ? Hei tu – I tuoi outputs sono troppo deboli!!! Oi! Abbiamo bisogno di inputs! Avanti N. 7, adesso devi spegnerti! Per piacere, vuoi smettere di inviare segnali?

3 I Problemi del Signalling Le cellule in generale, e i neuroni in particolare, sono esposti a una moltitudine di segnali inclusi quelli provenienti da altre cellule (p.es. segnali derivati da lipidi, piccole molecole organiche o peptidi) così come stimoli ambientali (p.es. luce, calore o variazioni dellosmolarità) Selezionare i segnali rilevanti da quelli irrilevanti Captare segnali di bassa intensità Tradurre segnali diversi in un comune linguaggio intracellulare

4 Le soluzioni Selezionare i segnali rilevanti da quelli irrilevanti Captare segnali di bassa intensità (ad es. a basse concentrazioni) Tradurre segnali diversi in un comune linguaggio intracellulare Recettori con un alto grado di specificità Recettori ad alta affinità accoppiati ad un sistema di amplificazione Attivazione di vie di signalling disegnate attorno a un limitato numero di processi comuni

5 Cosa fanno I segnali Le cellule rispondono ai segnali in una varietà di modi Alterazione del metabolismo p.es. Alterazione del metabolismo del glicogeno in risposta allinsulina Eccitamento p.es. propagazione dellimpulso nervoso in risposta a neurotrasmettitori Crescita e Divisione (mitosi) in risposta a fattori di crescita Morte cellulare programmata causata da specifici fattori di morte o dalla rimozione di alcuni fattori essenziali Espressione genica alterata – p.es. Sintesi di nuove proteine di membrana in risposta ad un incremento dellattività sinaptica (plasticità sinaptica)

6 Far attraversare il segnale Molti segnalatori (p.es. neurotrasmettitori) non possono attraversare la membrana ploasmatica. Le cellule risolvono questo problema utilizzando recettori transmembrana. Questi sono proteine posizionate in membrana con il sito attivo per il ligando* sul lato extracellulare e un dominio intracellulare che si accoppia al passo successivo nella catena di trasduzione del segnale * Ligando – una molecola che si lega ed è riconosciuta da un recettore Dominio di legame extracellulare Dominio intracellulare – si accoppia al passo successivo (può avere attività enzimatica) Dominio transmembrana Membrana plasmatica esterno iinterno

7 Definizione di Recettore Affinchè una proteina possa essere classificata come recettore (e non una semplice proteina di legame) devono essere soddisfatti diversi criteri Specificità – un recettore deve essere in grado di distinguere tra segnali spesso strettamente correlati Alta affinità – Le molecole segnalatrici sono spesso presenti a basse concentrazioni – I recettori possono spesso captare concentrazioni tra nM e pM Saturabilità – una cellula ha un numero finito di recettori, quindi vi è un limite al numero di molecole di ligando che una cellula può legare Reversibilità – lassociazione ligando-recettore non è covalente – quando la concentrazione del ligando diminuisce il complesso può dissociarsi Accoppiamento – il recettore trasferisce un segnale dal ligando alla cellula É questultima caratteristica, più di ogni altra che contraddistingue un recettore da una proteina di legame

8 Curva di attivazione - Saturazione (A) Se varia il numero dei recettori presenti si modifica il livello di saturazione della curva (B) Se varia laffinità del recettore per il messaggero la curva trasla sullasse delle concentrazioni senza che si modifichi il livello di saturazione. k1k1 k2k2 k3k3

9 Risposta sigmoideRisposta iperbolica Una risposta sigmoide denota cooperatività e insorge ogni qual volta un recettore (o un enzima) presenta n siti di binding per il ligando s (ncoefficiente di Hill è un numero intero >1) Risposte iperboliche e sigmoidi Le risposte sigmoidi sono caratteristiche di molte cascate di signaling, e rappresentano ciò che i biologi chiamano una risposta ultrasensibile ad un input. Una risposta iperbolica insorge ogni qual volta un recettore (o un enzima) presenta un unico sito di binding per il ligando s

10 Una doppia fosforilazione come causa di ultrasensibiltà Le cascate di MAP kinasi spesso ricevono inputs da molecole di signaling presenti in membrana in risposta a stimoli extracellulari. Come mai sono utilizzate tre kinasi invece di una? raf Erk1 Mek1 ATP ADP ATP ADP MAP chinasi chinasi MAP chinasi Fattore di Crescita MAP chinasi chinasi

11 Un importante aspetto del comportamento allo stato stazionario di un sistema di signaling è la forma della curva stimolo-risposta del sistema. Un enzima che mostra sensibilità iperbolica richiede un incremento dello stimolo di input di 81 volte per essere portato dal 10% al 90% di attivazione massima. Al contrario, alcuni enzimi e sistemi di signaling mostrano curve stimolo-risposta sigmoidi, che spesso sono ben approssimate dallequazione di Hill: y = x nH /(EC50 + x nH ) Un esempio molto comune di sistemi che mostrano curve stimolo-risposta sigmoidi è rappresentato dagli enzimi cooperativi. Un sistema ultrasensibile richiede un incremento inferiore ad 81 volte nello stimolo di input per guidarlo dal 10% al 90% di massima attivazione % di S-P allo stato-stazionario [kinasi] in multipli di EC50

12 La cascata delle MAP kinasi esibisce una risposta marcatamente ultrasensibile La risposta è marcatamente ripida; mentre un enzima con risposta iperbolica richiede un incremento di 81 volte dello stimolo di input per guidarlo dal 10% al 90% di attivazione massima, Erk2 (una MAPK) richiede un aumento di circa 2.5 volte Pertanto, cè qualcosa nel meccanismo a cascata che genera una risposta ad interruttore partendo da stimoli graduali. Attività di Erk2 allo stato-stazionario [Mos] (nM) Erk2=MAPK Mos=MAPKKK

13 a)La MAPKK fosforilata si dissocia dalla MAPKKK b)La seconda fosforilazione richiede una seconda collisione allora la velocità di conversione della MAPKK fosforilata a doppiamente fosforilata aumenterà con il quadrato della concentrazione dello stimolo La reazione del secondo ordine si traduce in una curva stimolo-risposta ultrasensibile con un coefficiente di Hill di 2. Recenti studi indicano che la MAPK è fosforilata mediante un meccanismo a doppia collisione. PMAPKKP MAPKKK PPMAPKKPMAPKK-P MAPKKK La doppia fosforilazione avviene mediante una doppia collisione

14 Lattivazione delle MAPK dipende dalla fosforilazione di due siti nella MAPK. Anche la completa attivazione di MAPKK richiede la fosforilazione di due siti. Qui si assume che le MAPKKK sono attivate e inattivate da enzimi denominati El e E2. MAPKKK* rappresenta la MAPKKK attivata. MAPKK-P e MAPKK-PP rappresentano MAPKK singolarmente e doppiamente fosforilate, rispettivamente. MAPK-P e MAPK-PP rappresentano MAPK singolarmente e doppiamente fosforilate, rispettivamente. P'ase rappresenta una fosfatasi. Schema di una cascata di MAPK

15 Vero ordine zero per v=V max Vero primo ordine a)v in funzione di [S], per un ampio range di [S] b)v in funzione di [S], per un ridotto range di [S] dove [S] << K m (~cinetica del 1° ordine) c)v in funzione di [S], per un range di [S] dove [S] > K m (~cinetica di ordine zero) Per semplicità si è plottato [S], dove [S]=[S]/K m Cinetiche di ordine 1 e zero

16 Velocità di reazione S-P come % di S + S-P totale %40%60%80%100% [kinasi] Derivazione grafica delle curve stimolo-risposta Sensibilità iperbolica Un semplice sistema di fosforilazione-defosforilazione: un substrato S è fosforilato da una kinasi per ottenere S-P, che può essere defosforilato da una fosfatasi per riottenere S. kinasi fosfatasi Si assume che la kinasi e la fosfatasi siano lontani dalla saturazione. Allora la velocità della reazione verso destra (linea continua) diminuirà e quella verso sinistra (linea tratteggiata) aumenterà, entrambe linearmente (reazione del primo ordine) allaumentare della percentuale di substrato fosforilato Nel punto di intersezione delle linee tratteggiata e continua il sistema è allo stato stazionario. Raddoppiando la concentrazione della kinasi: la pendenza della linea della reazione verso destra raddoppia:

17 Derivazione grafica delle curve stimolo-risposta Sensibilità iperbolica [kinasi] Velocità di reazione S-P come % di S + S-P totale kinasi fosfatasi Raddoppiando la concentrazione della kinasi la pendenza della linea della reazione verso destra raddoppia. Adesso la velocità della reazione verso destra sarà superiore a quella della reazione inversa, e il livello di S-P aumenterà. Però, aumentando S-P la velocità della reazione verso destra decadrà e la velocità della reazione inverse aumenterà. Verrà eventualmente raggiunto un nuovo stato stazionario, con il punto di intersezione e la percentuale di S-P allo stato stazionario spostati a destra.

18 Derivazione grafica delle curve stimolo-risposta Sensibilità iperbolica Plottando i livelli di S-P allo stato stazionario del precedente grafico in funzione della [kinasi] si ottiene una curva stimolo-risposta iperbolica Il sistema è massimamente sensibile (la curva stimolo-risposta ha la massima pendenza) a bassi livelli di stimolo, e diventa progressivamente meno sensibile allaumentare dello stimolo. % di S-P allo stato-stazionario [kinasi] in multipli di EC50

19 Derivazione grafica delle curve stimolo-risposta Ultrasensibilità a steps multipli kinasi fosfatasi La curva stimolo-risposta è sigmoide (linea continua), con nH=2. La curva sigmoide ha maggiore pendenza di quella iperbolica (linea tratteggiata) per stimoli intorno alla EC50, ma è meno ripida per stimoli molto piccoli e molto grandi. [kinasi] Velocità di reazione S-P come % di S + S-P totale % di S-P allo stato-stazionario [kinasi] in multipli di EC50 In una reazione di doppia fosforilazione a due steps la velocità della reazione verso destra aumenta con il quadrato dellammontare di kinasi presente. La pendenza della linea della reazione verso destra varia con il quadrato della concentrazione della kinasi presente

20 Ultrasensibilità con cinetica di ordine zero Lultrasensibilità può anche insorgere quando la kinasi e la fosfatasi operano vicino alla saturazione. In effetti le MAPK sono fisiologicamente presenti a concentrazioni sufficientemente elevate da saturare parzialmente le MAPKK. Se la kinasi e la fosfatasi sono parzialmente saturati, le loro velocità non variano linearmente allaumentare di S-P: le rette sono sostituite con curve iperboliche. La curva stimolo-risposta è sigmoide (linea continua), con nH=2.5. La curva iperbolica è rappresentata dalla linea tratteggiata. [kinasi] Velocità di reazione S-P come % di S + S-P totale % di S-P allo stato-stazionario [kinasi] in multipli di EC50

21 Interruttori di accensione e spegnimento La maggior parte dei segnali è transitoria e pure la risposta dovrebbe essere transitoria. Se si accende un segnale, cè anche bisogno di una via per spegnerlo. Per esempio, il mancato spegnimento di un segnale che fa aumentare la [Ca 2+ ] nel citosol è una delle cause che induce la morte cellulare. Pertanto, ciò che andiamo cercando sono dei sistemi biochimici in grado di passare rapidamente tra due stati: acceso (on) e spento (off). In molti sistemi di signalling accensione e spegnimento sono operati da proteine G e/o da proteine di fosforilazione

22 Interruttori On-Off –Proteine G eterotrimeriche Il ciclo di base di legame del GTP/GDP nele proteine G eterotrimeriche. è lo stesso di quello delle proteine G monomeriche. GDP GTP PiPi GDP ATTIVA INATTIVA Scambio del GDP legato col GTP La subunità attiva può interagire con lo step successivo della catena di ì signalling e attivarlo La subunità si dissocia da Attività GTPasica della subunità GTP GDP+P i La subunità si riassocia a

23 Interruttori On-Off – Proteine G monomeriche Ras (p21 ras ) è un buon esempio per questo tipo di switch. Ras è una piccola (21 kDa) proteina monomerica che lega il GTP o il GDP e ha unattività GTPasica intrinseca p21 ras GDP p21 ras GTP p21 ras GDP On Off GTP PiPi GDP ATTIVA INATTIVA Il fattore di scambio del nucleotide guanidinico (GEF) interagisce con ras Ciò causa lo scambio del GDP legato con il GTP Lattività GTPasica intrinseca idrolizza il GTP a GDP e P i Ras GTPasi stimolata dallassociazione con la GTPase-activating protein (GAP) ras attivata interagisce con il componente successivo della catena di signalling e lo attiva

24 Attivatori di ras G-protein Exchange Factors (GEF) SOS (Son of Sevenless) - Un GEF importante nella regolazione della via della crescita cellulare MAPK/ERK. eIF-2b (Eukaryotic Initiation Factor 2) è richiesto per dare inizio alla sintesi proteica. Ras-GRF1. Recettori per fattori di crescita. ras raf ras GTP Risposta Cascata delle MAP chinasi Lattivazione di ras da parte della CaMKII attiva la via delle MAP chinasi CaMKII

25 Interruttori On-Off – Proteine di fosforilazione/defosforilazione Protein Kinasi – trasferiscono un fosfato dallATP ad amino acidi specifici C CCO O H NH Serina C CCO O NH OP O-O- O-O- O-fosfoserina Kinasi ATP ADP Protein Fosfatasi – rimuovono un fosfato da specifici amino acidi C CCO O H NH Serina C CCO O NH OP O-O- O-O- Fosfatasi PiPi FosforilazioneDefosforilazione O-fosfoserina

26 Interruttori On-Off – Proteine di fosforilazione Kinasi e Fosfatasi fosforilano/defosforilano specifici amino acidi Amino AcidoKinasiFosfatasi Ser & ThrProtein kinasi C MAP kinasi PP1 PP2A TyrRecettore per lEGF pp60 c-src CD45 Thr & Tyr (Doppia specificità) MAP kinasi kinasiAtDsPTP1

27 Meccanismi di Trasferimento dellInformazione Un cambiamento nello stato di attività di un componente a monte porta ad un cambiamento dellattività di un componente a valle. Il cambiamento può essere attivante o inibente. Esso è interazione-specifico. (p.es. La fosforilazione del target può aumentarne o diminuirne lattività)

28 Secondi Messaggeri Tipicamente composti a basso peso molecolare prodotti allinterno della cellula da un enzima stimolato dal legame di un ligando a un recettore Adenilato Ciclasi GTP ATP AMP ciclico 2P i Attiva la Protein Kinasi A Attivata dalla subunità di G s Fosfolipasi C PIP 2 PLC IP 3 DAG Attivata da recettori legati a G q Attiva la Protein Kinasi C Induce un aumento del Ca 2+ citosolico Membrana plasmatica PIP 2 – fosfatidilinositolo difosfato IP 3 – inositolo trifosfato DAG - diacilglicerolo In entrambi questi sistemi il legame di un singolo ligando ad un recettore produrrà un gran numero di molecole di secondo messaggero AMPLIFICAZIONE - un ruolo chiave per i secondi messaggeri

29 Amplificazione 1 recettore attiva più proteine G Ciascun enzima X produce molti secondi messaggeri, ciascun messaggero attiva 1 enzima Y AMPLIFICAZIONE AMPc Kinasi A Enzima Z Prodotti dell enzima Z proteina recettore una molecola di ligando subunità di G s Adenilato ciclasi attivata Ciascuna kinasi A può fosforilare e attivare molte copie di enzima Z Ciascuna copia di enzima Z produce molte molecole di prodotto 1 recettore-ligando 500 Proteine G 500 enzimi ndi messaggeri 250 canali ionici ioni Una molecola di rodopsina assorbe un fotone Sono attivate 500 molecole di trasducina Sono attivate 500 molecole di fosfodiesterasi Sono idrolizzate 10 5 molecole di GMPc 250 canali del Na vengono chiusi Viene prevenuto lingresso nella cellula di ioni Na per secondo per circa un secondo La membrana dei bastoncelli è iperpolarizzata di 1 mV

30 Calcio – il messaggero universale Il Ca 2+ è mantenuto ad una concentrazione estremamente bassa nel citosol (a causa della sua tossicità), tuttavia la concentrazione del Ca 2+ è alta fuori dalla cellula e allinterno di alcuni organelli Lapertura rapida e transitoria di canali permette al Ca 2+ di fluire nel citosol seguendo il suo gradiente di concentrazione e costituisce la base di un sistema di signalling ubiquitario

31 PLC DAG PKC Calcio – il messaggero universale kinasi LIP 3 si lega al recettore per lIP 3 sul reticolo endoplasmatico e apre un canale del Ca 2+ (che fa parte del recettore) Lattivazione della PLC porta alla formazione di IP 3 solubile in acqua Il Ca 2+ rilasciato dal RE si lega alle Calmoduline permettendole di interagire con altre proteine e attivarle La Calmodulina può attivare pompe del Ca 2+ del reticolo endoplasmatico abbassando la [Ca 2+ ] citosolico La Calmodulina può attivare pompe del Ca 2+ sulla membrana plasmatica abbassando la [Ca 2+ ] citosolico La Calmodulina attiva una vasta gamma di proteine, p.es. kinasi calmodulina-dipendenti

32 Vie o Networks Generalmente le vie coinvolgono una serie di reazioni a cascata che portano ad un flusso lineare dellinformazione Esempi di vie 1) Vie delle Proteine G 2) Via di Ras–MAPK I networks (reti) sorgono da interazioni in cui un componente di una via regola lattività di una seconda via

33 La via Gq-PLC-

34 ras raf ras GTP Risposta Cascata delle MAP chinasi Lattivazione di ras da parte della CaMKII attiva la via delle MAP chinasi Chinasi a cascata CaMKII Il Ca 2+ si lega alle calmoduline La Calmodulina attiva una vasta gamma di proteine, p.es la kinasi II calmodulina-dipendenti

35 Meccanismi a feedback, feedforward e cross-talk A volte, molecole non direttamente coinvolte in una reazione enzimatica possono interagire allostericamente con lenzima stesso alterando la conformazione dellenzima e quindi la sua velocità di reazione. Quando sono gli stessi substrato o prodotto dellenzima ad interagire allostericamente con esso, essi possono mediare interazioni a feedback o a feedforward con la via metabolica in cui è coinvolto lenzima, oppure mediare un cross-talk tra vie metaboliche parallele.

36 (A) Feedback negativo in un semplice schema di reazione lineare. Il metabolita X è trasformato in Y, a sua volta trasformato nel prodotto Z. Z inibisce lenzima E1 che catalizza la reazione X Y. (B) Feedback positivo in un semplice schema di reazione lineare. Il metabolita X è trasformato in Y, a sua volta trasformato nel prodotto Z. Z stimolsa lenzima E1 che catalizza la reazione X Y. Meccanismi a feedback In una interazione a feedback, il prodotto di una reazione enzimatica influenza lattività di un altro enzima che lo precede nella via metabolica.

37 Feedforward in uno schema di reazione lineare. Il metabolita X è trasformato in Y, a sua volta trasformato nel prodotto Z. X stimola lenzima E2 che catalizza la reazione Y Z. Meccanismi a feedforward In una interazione a feedforward, il prodotto di una reazione enzimatica influenza lattività di un altro enzima che lo segue nella via metabolica.

38 Reti di signaling e comunicazione incrociata (cross-talk) Una ipotetica rete di signaling. La rete consiste in sei recettori e tre protein kinasi citosoliche. Ciascun recettore attiva (frecce verdi) o inibisce (linea nera) la kinasi 1 o la 2 o entrambe con un meccanismo non specificato. Poichè i segnali convergono sulla kinasi 3 (la kinasi di output), questa rete si attiverà massimalmente solo quando saranno presenti combinazioni specifiche di stimoli extracellulari. molecole della matrice fattori di crescita kinasi 1kinasi 2 kinasi 3 Nel cross-talk il metabolita di una via influenza lattività dellenzima di unaltra via.

39 Segnali multipli – Crosstalk di recettori Immaginate che una cellula riceva due segnali. Il segnale A inibisce la proliferazione, mentre il segnale B stimola la proliferazione… AB chinasi Il segnale A attiva una chinasi… …che fosforila e inattiva il recettore per il segnale B - risultato – nessuna proliferazione Se il crosstalk lavora solo in una direzione (ad es. da A a B) allora il segnale A sarà dominante Se il crosstalk lavora in entrambe le direzioni, ciò che accadrà dipenderà da diversi fattori p.es. Timing della percezione del segnale Densità relativa dei recettori Ampiezza relativa del segnale -

40 Un crosstalk tra vie del signaling neuronale può influenzare cambiamenti sinaptici indotti da stimoli

41 B (basale) stabile T (soglia) metastabile A (attivo) stabile MAPK vs PKC PKC vs MAPK Il punto A rappresenta uno stato di attività alta sia per la PKC che per la MAPK, mentre il punto B rappresenta uno stato di bassa attività. Entrambi i punti rappresentano livelli diversi di stati stazionari. Un sistema dI questo tipo è definito bistabile. Il punto di biforcazione T è importante perché definisce la soglia di biforcazione. Con A viene innescato un loop a feedback positivo che diventa indipendente dallattivazione del recettore. In particolare, la capacità della PKC di regolare la MAPK e della MAPK di regolare la PKC porta ad una interazione tra le due vie (feedback pos.)

42 Quasi tutte le isoforme di adenilato ciclasi (AC) sono regolate dalla via della PLC. LAC è intimamente associata a siti di ingresso del Ca 2+ nella cellula. Oscillazioni nei livelli di AMPc intracellulare insorgono a causa di una inibizione a feedback dellAC Ca 2+ -dipendente. Quindi il signalling dellAMPc si interseca con il Ca 2+ intracellulare ed estende le sue modalità di regolazione. Feedback negativo ed oscillazioni

43 Il modello mette in relazione i livelli di AMPc e lingresso di Ca 2+. LAMPc attiva canali del Ca 2+ (Y). Lingresso di Ca 2+ aumenta. Il Ca 2+ intracellulare inibisce ladenilato ciclasi (AC). Leffetto complessivo è un loop a feedback negativo in cui lAMPc inibisce la sua stessa produzione. Oscillazioni nellAMPc e nel Ca 2+ sono sostenute dal loop a feedback negativo. cAMPAMP )PDE(b )AC(a int f e ext Ca 22 O d c C YY *AC g h

44 Feedback positivo Problema: come può essere immagazzinata informazione, ad es. nel sistema nervoso, partendo da molecole instabili? Consideriamo ad es. il processo di fosforilazione come un meccanismo di immagazzinamento di informazione. La fosforilazione è un meccanismo comune per attivare/disattivare enzimi. Supponiamo che un bit di informazione sia stato immagazzinato in un neurone in seguito alla fosforilazione di un enzima chiave attivandolo. In assenza di una fosfatasi defosforilante lo stato acceso (on) dellenzima potrebbe durare a lungo.

45 Difficoltà: In realtà, lemivita della proteina fosforilata è limitata e quindi anche lo stato on dellenzima. Quesito centrale È possibile costruire interruttori molecolari stabili? Secondo questo articolo è possibile costruire interruttori molecolari in grado di immagazzinare informazione indefinitamente, utilizzando reazioni enzimatiche ben note e in maniera estremamente semplice.

46 Reazioni in un interruttore bistabile. Linterruttore è costituito da due proteine: la kinasi-1, che può esistere in uno stato inattivo (K 1 ) o in uno stato attivo (K * 1p ), e una fosfatasi. La transizione tra gli stati inattivo e attivo è dovuta a una reazione di fosforilazione. La fosforilazione può essere catalizzata dalla kinasi-1 attiva (feedback positivo) o dalla kinasi-2 attivata durante una stimolazione neuronale. Interruttori molecolari bistabili

47 In assenza di attività della Kinasi-2, linterruttore è descritto da quattro equazioni: Eq. 1 stabilisce che la derivata prima della concentrazione della Kinasi-1 attiva dK* 1p /dt, è la differenza tra le velocità di reazione della kinasi e della fosfatasi. Eq. 2 è la legge di conservazione per la kinasi-1, dove T è la somma della kinasi-1 attiva e inattiva. Eq. 3 descrive le reazioni della Eq. 1 in termini di cinetiche di Michaelis-Menten, dove K m1 e K m2 sono le costanti di Michaelis per la kinasi-1 e la fosfatasi, rispettivamente; C 1 e C 2 sono i numeri di turnover della kinasi-1 e della fosfatasi, rispettivamente, e P è la concentrazione della fosfatasi. Eq. 4 è ottenuta sostituendo leq.2 nella 3.

48 In assenza di kinasi-1 fosforilata, la velocità di reazione della fosfatasi è zero. Allaumentare di K* 1p, la velocità di reazione della fosfatasi aumenta fino alla saturazione. La velocità della reazione della kinasi- 1 aumenta allaumentare di K* 1p, ma la velocità decresce nuovamente per concentrazioni elevate di K* 1p perchè vi è poca proteina non fosforilata da fosforilare. Velocità (moli/l·10 -8 /s) Fosfatasi Kinasi Le velocità di reazione della kinasi-1 e della fosfatasi dipendono dalla frazione di kinasi-1 attiva Velocità (M/s) delle reazioni della kinasi-1 (termine di sinistra nellEq. 4) e della fosfatasi (termine di destra nellEq. 4) in funzione della frazione dei kinasi-1 attiva (K * 1p /T).

49 Grafico della derivata di K* 1p (Eq. 4) rispetto al tempo in funzione di K* 1p /T. La derivata prima rispetto al tempo della concentrazione di kinasi-1 attiva (dK* pl /dt) è la differenza tra le velocità delle reazioni della kinasi e della fosfatasi. Allo stato stazionario (equilibrio) sara: Affinchè uno stato sia stabile, deve essere dK* 1p /dt = 0 e d 2 K* 1p /dt 2 deve essere negativa. Questa seconda condizione è richiesta affinchè una piccola deviazione da uno stato stabile sia seguita da un ritorno spontaneo a quello stato. In questo esempio i criteri di stabilità sono incontrati in due punti: K* 1p /T = 0 e K* 1p /T 0.74, mentre K* 1p /T 0.22 rappresenta uno stato instabile. Stati stabili stato instabile K* 1p /T 0.22 I punti in corrispondenza di K* 1p /T = 0 e di K* 1p /T 0.74 rappresentano gli stati stabili. Ad esempio: se K* 1p /T > 0 ma < 0.22, dK* 1p /dt è negativa e K* 1p ritornerà velocemente a zero; se K* 1p /T > 0.22 ma < 0.74, dK* 1p /dt è positiva e K* 1p /T aumenterà a 0.74, se K* 1p /T diventa > 0.74, dK* 1p /dt è negativa e K* 1p /T scenderà verso 0.74.

50 dK* 1p /dt d 2 K* 1p /dt 2 Affinchè un punto di equilibrio sia stabile, deve essere: dK* 1p /dt = 0 e d 2 K* 1p /dt 2 <0 In questo esempio i criteri di stabilità sono incontrati nei due punti: K* 1p /T = 0 e K* 1p /T 0.74, mentre K* 1p /T 0.22 rappresenta un punto di equilibrio instabile

51 Tempo (s) [K 1p *]/T Le curve convergono verso i due punti stabili K* 1p /T = 0 e K* 1p /T = 0.74 a seconda che la concentrazione iniziale (normalizzata) di K* 1p sia rispettivamente minore o maggiore di 0.22, che rappresenta il punto di equilibrio instabile. stato stabile (fosforil.) stato stabile (defosforil.) stato instabile Soluzioni dellequazione differenziale: per diverse concentrazioni iniziali di K 1p *

52 Effetto della stimolazione sullinterruttore Stimoli di diversa ampiezza attivano la kinasi-2 in modo graduale. Linterruttore può essere acceso permanentemente da uno stimolo esterno Kinasi Fosfatasi Stimolo Funzione neuronale K* 1p /T K* 2 (nM) Tempo Lattivazione risultante della kinasi-1 è anchessa graduale finchè la sua attivazione diviene rigenerativa. Da quel momento, lattività della kinasi-1 rimane alta anche quando lo stimolo verrà rimosso.

53 Meccanismo molecolare del potenziamento a lungo termine Spina Ramo di un dendrite Assone Terminale presinaptico Terminale postsinaptico Sinapsi PSD

54 La densità postsinaptica o postsynaptic density (PSD) è una zona specializzata densa di proteine attaccate al lato citosolico della membrana postsinaptica. La PSD, caratteristica delle sinapsi eccitatorie del SNC, consiste di recettori ionotropici, proteine di sostegno e del citoscheletro, e molecole di signaling. Tali proteine creano un microdominio di signaling, che traduce inputs presinaptici in risposte postsinaptiche. Due sottotipi di recettori glutamatergici, AMPA ed NMDA, mediano la la trasmissione eccitatoria rapida.

55 Trasmissione Sinaptica AMPAR Potenziale dazione Glutamato Potenziamento Glutamato AMPAR NMDAR Na + Ca ++ Mg ++ NMDAR Mg ++ I recettori AMPA forniscono la depolarizzazione della membrana postsinaptica, che a sua volta aiuta lapertura dei recettori NMDA a generare lingresso di Ca 2+ che innesca cascate di signaling.

56 Long-term potentiation (LTP): un aumento della forza sinaptica Tempo (min) 0 60 Corrente postsimnaptica Protocollo di LTP che induce un ingresso postsinaptico di Ca 2+ Bliss & Lomo J Physiol, 1973 Il potenziamento a lungo termine o LTP è una forma sinapsi-specifica di plasticità che potrebbe essere correlata ad alcuni tipi di memoria.

57 Long-term potentiation (LTP): un aumento della forza sinaptica Protocollo di LTP che induce un ingresso postsinaptico di Ca 2+ Tempo (min) 0 60 Corrente postsimnaptica con un inibitore della CaMKII non cè LTP Lledo et al PNAS 1995, Giese et al Science 1998

58 *CaMKII a bassa attività: Potenziamento precoce (memoria a breve termine?) Le CaMKII attivate agiscono su proteine preesistenti in attesa di essere attivate. Ad es., fosforilazione di recettori AMPA risposta postsinaptica più intensa a parità di glutammato liberato AMPAR fosforilazione Processi di rilascio *CaMKII NMDAR Ca ++ **CaMKII LTP ** CaMKII ad alta attività: Potenziamento tardivo (memoria a lungo termine?)

59 Premessa La CaMKII è localizzata nella PSD ed è richiesta per linduzione di LTP La protein kinasi II Ca 2+ /calmodulina-dipendene (CaMKII) localizzata nella PSD è in una posizione ideale per giocare un ruolo chiave nellLTP, essendo virtualmente in grado di indurre i processi a valle che potenziano la trasmissione sinaptica. Lingresso transiente di Ca 2+ attraverso canali NMDA, che avviene durante linduzione dellLTP, stimola lautofosforilazione persistente e lattivazione della CaMKII. Lattivazione persistente della CaMKII suggerisce che essa possa agire come un interruttore bistabile responsabile del rafforzamento tutto-o-nulla delle singole sinapsi. Obiettivo Comprendere il meccanismo di accensione della CaMKII e, in particolare, come la CaMKII possa rimanere in uno stato altamente fosforilato nonostante lattività delle fosfatasi endogene.

60 La CaMKII è una proteina multimerica in cui loloenzima è costituito da 8 a 12 subunità, ciascuna delle quali ha unattività kinasica. Ciascuna subunità è fosforilabile e il sito di fosforilazione è rappresentato dalla Thr286. La defosforilazione della CaMKII avviene per azione specifica della PP1 trattenuta nel PSD da proteine strutturali. Un oloenzima = 8/12 subunità Protein Kinasi II Calmodulina-dipendente CATALiTICA AUTO- INIBITORIA CaM ASSOCIAZIONE ALLE SUBUNITA COOH H2NH2N Un dominio autoinibitorio occupa e blocca il sito catalitico. La Ca 2+ /calmodulina rimuove il dominio autoinibitorio dal sito catalitico causando fosforilazione e attivazione. Gli oloenzimi di CaMKII formano una struttura ad anello. Negli oloenzimi di CaMKII, le subunità si assemblano in due anelli coplanari, ciascuno contenente 4/6 subunità. In queste strutture ad anello si realizza lautofosforilazione mediante un processo in cui una subunità fosforila quella accanto.

61 Meccanismi di bistabilitè del sistema CaMKII/PP1 nel PSD La CaMKII può trovarsi quindi in uno stato attivato (on) nel quale la maggior parte delle 8/12 subunità sono fosforilate a livello della Thr286 e in uno stato disattivato (off) nel quale esse sono quasi completamente defosforilate. Come fa un gruppo di molecole CaMKII e PP1 nella PSD ad operare come un interruttore che presenta due diversi stati stabili a concentrazioni basali di Ca 2+ intracellulare? Loperazione di attivazione è basata su tre reazioni che possono avvenire ai livelli basali di Ca 2+. Stato off Stato on

62 (1) Se nessun sito Thr286 in un anello è fosforilato, la prima autofosforilazione richiede il legame di due molecole di Ca 2+ /calmodulina: una per attivare la subunità catalitica della CaMKII, e laltra per esporre la Thr286 della subunità adiacente che funge da substrato. v 1 = velocità di inizio dellautofosforilazione per sito (subunità) k 1 = costante di velocità dello step di autofosforilazione elementare K H1 = [Ca 2+ ] 50 per lattivazione della CaMKII (0.7 μM, Kuret and Schulman, 1984) [Ca 2+ ] i a riposo (100 nM) << K H1 linizio procederà lentamente alla [Ca 2+ ] di riposo. C= complesso Ca 2+ -calmodulina P o =oloenzima non fosforilato P 1 =oloenz. fosforil. una volta PoPo PoCPoCPoC2PoC2 P1C2P1C2 (1) Pertanto, la velocità di autofosforilazione per sito, v 1. dipenderà dalla seconda potenza della [Ca 2+ /calmodulina], che a sua volta dipende dalla quarta potenza della [Ca 2+ ]:

63 Pertanto, la velocità di autofosforilazione per sito, v 2, della CaMKII parzialmente fosforilata sarà superiore a v 1, in quanto dipenderà solo dalla quarta potenza della [Ca 2+ ]: (2) (2) Invece, una volta che una o più subunità sono fosforilate, la velocità di fosforilazione della Thr286 diventerà molto più rapida, nonostante la bassa [Ca 2+ ] in, dal momento che è richiesta solo una molecola di Ca 2+ /calmodulina per esporre la Thr286 della subunità che funge da substrato. P1P1 P1CP1CP2P2

64 Quindi, il compartimento biochimico di rilievo è il volume della PSD allinterno del quale la concentrazione delle subunità della CaMKII è 100–200 μM. Se vi è un numero significativamente elevato di subunità fosforilate della CaMKII, la loro concentrazione sarà molto più alta della K M della fosfatasi (1 μM), e vi sarà saturazione della fosfatasi. (3) I siti della Thr286 della CaMKII vengono defosforilati ad opera esclusivamente della PP1 tenuta nel PSD da proteine di sostegno: il contributo delle altre fosfatasi è minimo in quanto non sono in grado di funzionare nella PSD. La defosforilazione delle subunità procede secondo lo schema di Michaelis-Menten: SP = subunità fosforilata S = subunità defosforilata E = fosfatasi (3) Pertanto, la velocità di defosforilazione per sito della CaMKII parzialmente fosforilata, v 3, sarà: k 2 = costante catalitica della PP1 K M = costante di MM e p = concentrazione di PP1 attiva* P i = concentrazione delloloenzima fosforilato i-volte.

65 Interpretazione intuitiva di come questo sistema chimico può operare da interruttore Quando gli oloenzimi CaMKII sono pochissimo fosforilati, la velocità alla quale i siti disponibili diventano autofosforilati è bassa perchè la reazione (1) è lenta. Al contrario, la PP1 può rapidamente defosforilare ogni sito fosforilato poichè essa non è saturata (vi sono pochi siti sui quali la PP1 deve intervenire). Lo stato off è pertanto stabile poichè la velocità di autofosforilazione della CaMKII per sito è bassa rispetto alla velocità della fosfatasi per sito. Questa situazione è ribaltata nello stato on. In questo caso, la reazione della CaMKII è più veloce (essendo richiesta solo una calmodulina per la reazione (2). Daltro canto, lalta concentrazione di subunità fosforilate satura la fosfatasi, e la velocità alla quale essa può defosforilare le varie subunità è pertanto bassa. Lo stato on è quindi stabile essendo la velocità di autofosforilazione della CaMKII per sito alta rispetto alla velocità della fosfatasi per sito.

66 La simulazione mette in evidenza lesistenza di un sistema bistabile a [Ca 2+ ] in basali che dipende dalle proprietà della fosfatasi presente nel PSD Vi sono due livelli stabili (punti neri) di fosforilazione a [Ca 2+ ] in basali (linea verticale). Il sistema è bistabile in un ampio intervallo di [Ca 2+ ] in (area ombreggiata). Il punto rosso indica la percentuale totale di siti di Thr286 fosforilati dopo che il 20% delloloenzima della CaMKII nello stato on altamente fosforilato è stato rimpiazzato da oloenzimi non fosforilati. Tale perturbazione non è sufficiente a spingere il sistema nello stato off. Il passaggio del sistema allo stato off richiederebbe che la fosforilazione precipitasse al di sotto del livello marcato con il punto giallo (punto di equilibrio instabile). Allo stato stazionario, il livello di fosforilazione delle Thr286 varia con la concentrazione intracellulare di Ca 2+. NOTA BENE: La CaMKII nella PSD può essere defosforilata solo dalla PP1.

67 Un aumento della [Ca 2+ ] in aumenta la frequenza di autofosforilazione. Se la [Ca 2+ ] in è quella basale (bassa), il grado di fosforilazione allo stato stazionario della CaMKII è basso (cerchio nero nel grafico). Successivamente, un ingresso di Ca 2+, causato ad es. da stimolazione elettrica, può muovere transitoriamente la [Ca 2+ ] in verso destra, a valori molto più elevati.

68 Se la [Ca 2+ ] in rimane per un certo tempo elevata, a destra della regione grigia, lautofosforilazione farà saltare stabilmente lattività della CaMKII da un livello basso ad uno alto (cerchio nero nel grafico). Successivamente, quando la [Ca 2+ ] in ritorna a livelli basali, lo stato della CaMKII si riduce, muovendosi verso sinistra. Ma lattività della CaMKII permane comunque ad un livello alto, con sostenuta autofosforilazione. Un aumento della [Ca 2+ ] aumenta la frequenza di autofosforilazione.

69 FINE


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