La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

ANIMALI TRANSGENICI. Per animali transgenici si intendono quegli animali ottenuti attraverso una manipolazione del genoma, inserendo uno o più geni, appartenenti.

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "ANIMALI TRANSGENICI. Per animali transgenici si intendono quegli animali ottenuti attraverso una manipolazione del genoma, inserendo uno o più geni, appartenenti."— Transcript della presentazione:

1 ANIMALI TRANSGENICI

2 Per animali transgenici si intendono quegli animali ottenuti attraverso una manipolazione del genoma, inserendo uno o più geni, appartenenti alla stessa specie, o più spesso ad altre specie.

3 MICROINIEZIONE DI DNA INIEZIONE DI DNA nel pronucleo maschile di un oocita appena fecondato. Più precisamente, si depositano con una microsiringa 1-2 picolitri di DNA che contengono circa copie del gene da inserire. A monte del gene ( cDNA ) da trasferire nel pronucleo si utilizza una sequenza promotore che conferisce al gene la specificità di espressione in un particolare tessuto

4 MICROINIEZIONE DI DNA E PRODUZIONE DI TOPI TRANSGENICI Il gene inserito viene integrato nel genoma della cellula uovo che viene trapiantata in una madre adottiva, che darà origine alla nascita di un topino chimera ( mosaico di cellule con patrimoni genetici diversi). Nella fase successiva si effettua un incrocio riproduttivo tra il topino chimera e un topo normale con la nascita di topini con i nuovi geni ma eterozigotici ; solo nellincrocio successivo tra i precedenti avremo la nascita di topini omozigotici per il gene introdotto

5 MICROINIEZIONE DI DNA E PRODUZIONE DI TOPI TRANSGENICI

6 Dennis Roop and c-Myc Myc è un oncogene che attiva la trascrizione dei geni di stimolo di sviluppo;quando viene espresso altera la funzione usuale dello sviluppo e della proliferazione di controllo delle cellule

7 Studio del ruolo di c-Myc nella carcinogenesi Creazione di topi transgenici Inserimento di c-Myc umano in topo Overexpression di c-Myc nellepidermide Risultati esperimento: -aumento di crescita cellulare -inibizione della differenziazione

8 TOPI KNOCK–OUT I topi knock–out sono divenuti molto utili nel contribuire a capire il genoma umano ed il relativo ruolo nelle malattie. Generando un knock-out è stato dimostrato che è possibile mirare linserimento del gene in una posizione precisa del genoma del topo; ciò dà la possibilità di eliminare un gene specifico con un allele inattivo o mutato. Di conseguenza gli animali Knock-out sono considerati una tecnica investigativa che tiene conto delleliminazione di un gene in particolare, nel tentativo di definire che effetto ha nellorganismo

9 CLONAGGIO DEL DNA

10 PLASMIDI I Plasmidi sono elementi genetici extra- cromosomici che si replicano nelle cellule batteriche autonomamente. Il loro DNA è circolare e a doppia elica.I plasmidi usati negli esperimenti di clonaggio derivano tutti da plasmidi trovati in natura che sono stati ingegnerizzati in modo da presentare caratteristiche che facilitino il clonaggio di geni. I più usati sono i plasmidi di E.Coli.

11 Caratteristiche dei plasmidi Una sequenza ORI che permette al plasmide di replicarsi nelle cellule di E.Coli in quanto viene riconosciuta dagli enzimi di replicazione della cellula ospite Deve avere un marcatore selettivo, che renda le cellule di E.Coli contenenti il plasmide, facilmente distinguibili dalle cellule che non lo contengono; uno dei marcatori più usati è il gene amp che conferisce la resistenza allampicillina Deve avere anche un sito di taglio per un enzima di restrizione in modo che lo si possa aprire per inserire il frammento di DNA esogeno

12 INSERIMENTO DEL DNA DA CLONARE

13 CELLULE ES Le cellule ES sono cellule embrionali totipotenti, infatti possono dare origine a cellule di tessuti differenti. Le cellule ES vengono prelevate dalla massa cellulare interna della blastocisti(cellula embrionale indifferenziata) e mantenute in coltura in presenza di cellule o fattori che ne impediscono il differenziamento. In queste condizioni le cellule ES mantengono intatta la loro capacità di differenziarsi in modo appropriato in qualunque tessuto, una volta reintrodotte in un embrione

14 RICOMBINAZIONE OMOLOGA

15 INIEZIONE DEL DNA RICOMBINATO Le cellule staminali che hanno integrato nel loro genoma il DNA ricombinato, vengono iniettate in un embrione isolato in stadio precoce di sviluppo. Lembrione precoce, composto parzialmente da cellule ES, viene introdotto nellutero di una femmina pseudogravida. Il topo chimera che si sviluppa da questo embrione conterrà alcune cellule somatiche portatrici del gene alterato e conterrà anche cellule della linea germinale che portano il gene modificato.

16 TOPO CHIMERA INCROCIATO CON TOPO NORMALE 1. Il topo chimera verrà incrociato con un topo normale e alcuni discendenti (2 su dieci) avranno un gene modificato in tutte le loro cellule ( eterozigosi). 2. Incrociando tra loro questi topi portatori del gene modificato si ottiene qualcuno dei discendenti contenente 2 geni alterati in tutte le sue cellule (omozigosi ). 3. Se lalterazione genica originale inattiva completamente la funzione genica si avranno allora dei topi ad eliminazione (Knock-out) cioè ceppi di topi che hanno un certo gene inattivato definitivamente.

17 TECNICA KNOCK - OUT

18 USO DEL KNOCK-OUT NELLA COLORAZIONE DEL PELO DI TOPO Le cellule ES utilizzate hanno uno STRAIN con pelo di colore bianco Dopo che tali cellule sono state inserite in una blastocisti, esse si divideranno in molti tessuti differenti. Se il risultato è un topo che il pelo con macchie bianche e macchie nere vuol dire che liniezione di cellule ES è riuscita. Dopo lindividuazione dei topi che hanno avuto contributi da entrambi i tipi di cellule, si ha la trasmissione della germ-line per cui dallincrocio di questi topi eterozigoti con il pelo a chiazze avremo la nascita di topi Knock-out con il pelo nero ( quindi genotipo omozigote)

19 TECNICA CONDITIONAL KNOCK-OUT Lo scopo dei Knock-out condizionali è eliminare un gene in un tessuto, in un organo o in una fase particolare di sviluppo. VANTAGGI: - topi Knock-out conditional sopravvivono più a lungo -i metodi sono anche più precisi

20 Il sistema di Recombinase Cre-Lox Metodo knock-out conditional piu usato. Si basa sullazione del recombinase che è un enzima che funziona come le forbici tagliando un frammento di DNA inserito fra due siti LOX recombinase specifici. Poiché questo enzima è espresso soltanto in determinati tipi cellulari, il gene designato sarà eliminato soltanto da tali cellule. Quindi questa metodica è basata su uninattivazione tessuto- specifica del gene bersaglio. In una prima fase avviene la descrizione del luogo dinteresse :il frammento di DNA compreso tra siti Lox. Successivamente avviene la costruzione del vettore bersaglio, la ricombinazione omologa in cellule ES, liniezione nellembrione ad uno stadio precoce e la generazione del topo chimera. Questultimo, contenete i siti Lox recombinase-specifici, verrà incrociato con un topo CRE positivo, cioè che esprime lenzima recombinase in un tessuto specifico. Lespressione tessuto-specifica del recombinase permette linattivazione del gene dinteresse soltanto nel tessuto in cui la recombinase è espressa.


Scaricare ppt "ANIMALI TRANSGENICI. Per animali transgenici si intendono quegli animali ottenuti attraverso una manipolazione del genoma, inserendo uno o più geni, appartenenti."

Presentazioni simili


Annunci Google