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STIMA DELLINCERTEZZA DI MISURA DA STUDI DI VALIDAZIONE CONDOTTI IN LABORATORIO. DETERMINAZIONE DI AFLATOSSINA M1 NEL LATTE CON METODICA HPLC DOPO PURIFICAZIONE.

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1 STIMA DELLINCERTEZZA DI MISURA DA STUDI DI VALIDAZIONE CONDOTTI IN LABORATORIO. DETERMINAZIONE DI AFLATOSSINA M1 NEL LATTE CON METODICA HPLC DOPO PURIFICAZIONE CON COLONNE DI IMMUNOAFFINITA MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE ° MEETING DEI RESPONSABILI E TECNICI DI LABORATORIO DEL SETTORE LATTIERO-CASEARIO A.Caria, M.Cabiddu, I.Ibba, C.Cicalò

2 OBIETTIVO DEL METODO Determinare la quantità di aflatossina M1 nel latte impiegando un procedimento di estrazione con colonna di immunoaffinità e misurazione con HPLC con rivelatore a fluorescenza MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

3 UNI CEI ENV 13005:2000 § 3.4 CONSIDERAZIONI PRATICHE 3.4.8……lincertezza non può sostituirsi al pensiero critico, allonestà intellettuale ed alla capacità professionale. La valutazione dellincertezza non è né un compito di routine né un esercizio puramente matematico, ma dipende dalla conoscenza approfondita della natura del misurando e della misurazione. La qualità e lutilità dellincertezza attribuita al risultato di una misurazione dipendono pertanto, in definitiva dallapprofondimento, dallanalisi critica e dallintegrità morale di chi contribuisce ad assegnare il valore. MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

4 IL PROCEDIMENTO PER LA STIMA DELLINCERTEZZA INIZIO 1. SPECIFICARE IL MISURANDO FINE 2. IDENTIFICARE LE FONTI DINCERTEZZA 3. SEMPLIFICARE RAGGRUPPANDO LE FONTI PER LE QUALI VI SONO DATI ESISTENTI 4. QUANTIFICARE LE COMPONENTI RAGGRUPPATE 5. QUANTIFICARE LE COMPONENTI RESIDUE 6. CONVERTIRE LE COMPONENTI IN SCARTI TIPO 7. CALCOLARE L INCERTEZZA TIPO COMPOSTA E LINCERTEZZA ESTESA MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

5 SGRASSATURA ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE ELUIZIONE CONCENTR.ESTRATTO E DILUIZ.A VOLUME MISURAZIONE CON HPLC PREPARAZIONE DEL MATERIALE PER LA TARATURA TARATURA HPLC RISULTATO FASE 1. SPECIFICARE IL MISURANDO MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

6 IL DIAGRAMMA CAUSA EFFETTO Il diagramma causa-effetto è un modo utile per elencare le fonti di incertezza. Mostra le loro reciproche relazioni e indica linfluenza del risultato Serve a evitare di contare alcune fonti più di una volta FASE 2- IDENTIFICARE LE FONTI DI INCERTEZZA MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

7 FASE 2- IDENTIFICARE LE FONTI DI INCERTEZZA IL DIAGRAMMA CAUSA EFFETTO COME SI COSTRUISCE 1. SCRIVERE LEQUAZIONE COMPLETA PER IL RISULTATO. I PARAMETRI DELLEQUAZIONE COSTITUISCONO I RAMI PRINCIPALI DEL DIAGRAMMA. SE APPROPRIATO AGGIUNGERE RAMI CHE RAPPRESENTANO LO SCOSTAMENTO GLOBALE( AD ES. RECUPERO ) 2.CONSIDERARE OGNI FASE DEL METODO E AGGIUNGERE I RELATIVI FATTORI AL DIAGRAMMA A PARTIRE DAGLI EFFETTI PRINCIPALI 3.PER OGNI RAMO AGGIUNGERE I FATTORI CHE CONTRIBUISCONO FINCHE GLI EFFETTI DIVENTANO TRASCURABILI 4. RIDISEGNARE IL DIAGRAMMA RISOLVENDO LE DUPLICAZIONI, RENDENDO ESPLICITI I CONTRIBUTI E ACCORPANDO LE CAUSE COLLEGATE. METTERE I TERMINI RELATIVI ALLA PRECISIONE IN UN RAMO SEPARATO MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

8 EQUAZIONE DI BASE UTILIZZATA PER IL CALCOLO DEL MISURANDO Tutti i parametri dellequazione possono avere unincertezza associata con il loro valore e quindi sono potenziali fonti di incertezza. Ci possono essere anche altri parametri che pur non comparendo nellequazione influenzano i risultati ( es tempo di estrazione e temperatura ) e quindi sono fonti potenziali di incertezza. La nostra equazione è : W m = [m A ( V f / V i ). 1/V] dove W m = misurando m A = quantità di aflatossina M1 in ng corrispondente allarea del picco di aflatossina M1 del campione V i = volume di campione iniettato in µl V f =volume di ripresa del campione in µl V =quantità del campione iniziale in ml FASE 2- IDENTIFICARE LE SORGENTI DI INCERTEZZA MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

9 FASE 2. IDENTIFICARE LE SORGENTI DI INCERTEZZA DIAGRAMMA CAUSA EFFETTO AREA PICCO CAMPIONE VOLUME INIEZIONE VOLUME FINALE RISULTATO RECUPERO VOLUME INIZIALE CAMPIONE MATERIALE RIFERIMENTO MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

10 FASE 2-IDENTIFICARE LE SORGENTI DI INCERTEZZA DIAGRAMMA CAUSA-EFFETTO AREA DEL PICCO CAMPIONE m A Taratura vetr. T aratura Temperatura QUANTITÀ DI AFLATOSSINA NEL CAMPIONE Inc. mr RECUPERO RAREA PICCO MR VOLUME INIZ CAMP V Temperatura Tarat vetreria Ripetibilità Diluizione Tar.vetr Op. Ripetib. Precisione T aratura HPLC Operatore MAT.RIFER. VOLUME FINALE V f Precisione VOL.INIEZ. Tar.vetr Op. Ripetib. Tar.vetr Op. Ripetib. Diluizione Tar.vetr Op. Ripetib. MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

11 SGRASSATURA ELUIZIONE CON ACETONITRILE CONC.ESTRATTO E DILUIZ.A VOL. MISURAZIONE CON HPLC ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE FASE 2. IDENTIFICARE LE SORGENTI DI INCERTEZZA -CAPACITÀ OPERATORE - QUALITA DELLA COLONNINA -QUALITA VETRERIA -CAPACITÀ OPERATORE -QUALITA REAGENTE -CAPACITA OPERATORE - QUALITA DELLA VETRERIA -CAPACITÀ OPERATORE -INTEGRAZIONE -VOLUME INIEZIONE -CALCOLO RISULTATO -TARATURA -QUALITA DEI REAGENTI -CAPACITÀ OPERATORE PROCESSO ANALITICO PREPARAZIONE DEL MATERIALE PER LA TARATURA TARATURA HPLC - MATER.RIFERIM - CAPACITA OPERAT. - TARATURA PIPETTE - QUALITA VETR. - TEMPERATURA CAPACITA OPERAT. FONTI DI INCERTEZZA FONTI DI INCERTEZZA RISULTATO MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

12 FASE 3 : SEMPLIFICARE RAGGRUPPANDO LE FONTI PER LE QUALI VI SONO DATI ESISTENTI RIPETIBILITA AREA PICCO CAMP m A MAT.RIF. VOLUME FINALE QUANTITÀ DI AFLATOSSINA NEL CAMPIONE RECUPERO RAREA PICCO MR VOLUME INIZ CAMP Temper. Tarat vetreria Taratura HPLC T aratura HPLC Area picco mr Vol fin estratto Vol iniz camp Volume e dil mr Area picco campione diluizione mr Taratura Inc. mr Temper Tarat vetreria DIAGRAMMA CAUSA-EFFETTO VOL. INIEZ Vol iniezione MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

13 RIPETIBILITA (1) AREA PICCO CAMP m A (1) MAT.RIF.(3) VOLUME FINALE (1) QUANTITÀ DI AFLATOSSINA NEL CAMPIONE RECUPERO R (2) AREA PICCO MR (1) VOLUME INIZ CAMP (1) Temper. Tarat vetreria (2) Taratura HPLC (3) T aratura HPLC (3) Area picco mr Vol fin estratto Vol iniz camp Volume e dil mr Area picco campione diluizione mr (1) Taratura (2) Inc. mr (3) Temper Tarat vetreria (2) DIAGRAMMA CAUSA-EFFETTO VOL. INIEZ Vol iniezione FASE 4-5. QUANTIFICARE LE COMPONENTI RAGGRUPPATE (1)Ripetibilità considerata durante lo studio di variabilità del procedimento analitico (2)Considerata durante lo studio dello scostamento sistematico (3)Da considerare durante la valutazione delle altre fonti di incertezza MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

14 Fasi 4 E 5 QUANTIFICAZIONE DELLE COMPONENTI DELLINCERTEZZA 1.La miglior stima disponibile della variazione globale tra le diverse esecuzioni del processo analitico ( ripetibilità ) 2.La miglior stima disponibile dello scostamento sistematico globale (recupero ) e della sua incertezza 3.La quantificazione di qualsiasi incertezza associata con effetti di cui non si sia tenuto conto in modo completo negli studi delle prestazioni globali MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

15 FASE 6-CONVERTIRE LE COMPONENTI IN SCARTI TIPO STUDIO DI VARIABILITÀ DEL PROCEDIMENTO ANALITICO RIPETIBILITA MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

16 STUDIO DELLO SCOSTAMENTO SISTEMATICO E stato eseguito durante la validazione del metodo mediante prove di recupero ( campioni omogeneizzati divisi in due aliquote, una delle quali addizionata con aflatossina M1 ) Lincertezza tipo è stata calcolata come scarto tipo della media u (REC)= SCARTO TIPO % DEL RECUPERO NUMERO ESPERIMENTI CONDOTTI Valutazione del recupero: verificare se è significativamente uguale a 1 ( 100% ) ; usando un test di significatività( t-test ) t= 1-REC /u (REC) FASE 6-CONVERTIRE LE COMPONENTI IN SCARTI TIPO MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

17 FASE 6-CONVERTIRE LE COMPONENTI IN SCARTI TIPO STUDIO DELLO SCOSTAMENTO SISTEMATICO MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

18 ALTRE FONTI DI INCERTEZZA Incertezza del materiale di riferimento fornita dal produttore u = FASE 6-CONVERTIRE LE COMPONENTI IN SCARTI TIPO MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005 già trasformata in distribuzione rettangolare dividendo per 3

19 FASE 7. CALCOLARE L INCERTEZZA TIPO COMPOSTA u c ( W m )/ W m = somma delle incertezze tipo relative uc (Wm) = ( ) 2 + ( ) 2 + (0,0068) 2 Wm uc (Wm ) = Wm (0.0945) 2 + ( ) 2 +(0.0068) 2 Wm = uc =3,33 INCERTEZZA TIPO RELATIVA DEL CAMPIONE = radice della somma delle incertezze di ripetibilità, del recupero e del materiale di riferimento MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

20 ESPRESSIONE DEL RISULTATO CALCOLARE L INCERTEZZA TIPO ESTESA = 13 Il numero dei gradi di libertà effettivi risulta maggiore di 10 pertanto il fattore di copertura può essere assunto uguale a 2 (v. SINAL DT 0002 ). Calcolo dei gradi di libertà effettivi: Formula di Welch Satterthwaite INCERTEZZA ESTESA U (Wm) U (Wm) = [uc (Wm ) ]. 2 MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

21 FINE ESPRESSIONE DEL RISULTATO CALCOLARE L INCERTEZZA TIPO ESTESA U (Wm) = [ uc (Wm ) ]. 2 Wm = ng/l ± 6,66 k =2 e t = 95% MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

22 Stima dellincertezza in base ai dati di precedenti studi collaborativi per lo sviluppo e la validazione del metodo Lo scarto tipo di riproducibilità ottenuto in uno studio collaborativo può essere assunto come lincertezza del metodo da riportare nel rapporto di prova La riproducibilità del metodo è il parametro completo nella valutazione della precisione; tiene conto di tutte le possibili variabilità allinterno e allesterno dei laboratori MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

23 Stima dellincertezza in base ai dati di precedenti studi collaborativi per lo sviluppo e la validazione del metodo SI ATTRIBUISCE ALLA RIPRODUCIBILITA IL VALORE DELLINCERTEZZA COMPOSTA E SUCCESSIVAMENTE, TRAMITE OPPORTUNO FATTORE DI COPERTURA, SI OTTIENE LINCERTEZZA ESTESA. Wm ± k. S R MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

24 RIFERIMENTI UNI EN ISO/IEC 17025:1999 Requisiti generali per la competenza dei laboratori di prova e taratura Istituto Superiore di Sanità- Quantificazione dellincertezza nelle misure analitiche.Seconda Edizione (2000) della Guida EURACHEM/CITAC CG 4- Rapporti ISTISAN 03/30 SINAL DT-0002 Guida per la dichiarazione dell'incertezza di misura rev 1 UNI CEI ENV – Luglio Guida allespressione dellincertezza di misura De Martin – ARPA-FVG-RGQ Pordenone: Workshop Validazione dei metodi e incertezza di misura nei laboratori di prova: le linee guida delle Agenzie Ambientali-Ottobre 2003


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