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Serie di operazioni che conduce all’eliminazione dei microrganismi e si applica sia alle sostanze che agli ambienti dove questi vengono manipolate. I metodi.

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1 Serie di operazioni che conduce all’eliminazione dei microrganismi e si applica sia alle sostanze che agli ambienti dove questi vengono manipolate. I metodi con cui viene realizzata si possono classificare a secondo del procedimento utilizzato in fisici e chimici.

2 Metodi Fisici  Separazione meccanica  Filtrazione  Flusso Laminare  Termici  Calore Secco (Fiamma diretta; Aria calda)  Calore Umido (Ebollizione, Vapore saturo in pressione; Vapore fluente; Tindalizzazione; Sistemi particolari)  Luce Ultravioletta  Radiazioni ionizzanti (Raggi  ;  o  )  Ultrasuoni

3 Metodi Chimici  Sostanze battericide  Gas o vapori  Formaldeide    -Propiolattone  Ossido di etilene

4 Separazione Meccanica La separazione meccanica di elementi può essere effettuata con i filtri di profondità, a schermo e anche mediante flusso laminare. Metodi Termici La sterilizzazione con il calore può essere ottenuta sia a secco che in presenza di umidità (a vapore). La scelta viene dettata dalla stabilità dei prodotti da trattare.

5 Sterilizzazione con calore secco Il materale viene sottoposto al riscaldamento a temperature e tempi definiti in funzione dei diversi batteri e spore da distruggere in apparecchiature costituite da stufe o autoclavi. Fiamma diretta: usata nei laboratori di microbiologia per sterilizzare piccoli oggetti. Irradiazione con aria calda: usata per i contenitori in vetro e metallo e vetreria da laboratorio

6 Sterilizzazione con calore Umido Il materiale viene sottoposto all’azione combinata di calore e umidità che consente la distruzione dei microrganismi a temperature più basse impiegate con la tecnica con calore secco. Le membrane dei microrganismi risultano più sensibili in presenza di H 2 O. Anche in questo caso il materiale viene sottoposto al riscaldamento a temperature e tempi definiti, in funzione dei diversi batteri e spore da distruggere, in apparecchiature costituite da stufe o autoclavi.

7 Ebollizione: usata nei laboratori per sterilizzare piccoli volumi di soluzioni che non contengono sostanze termolabili. Vapore fluente: usata per sterilizzare soluzioni acquose contenenti battericidi e batteriostatici (per un’azione combinata). Si impiega vapore a 100°C che non uccide alcuni tipi di spore (quali il Clostridium Botulinum). Tindalizzazione: consiste in un ciclo di sterilizzazione a riscaldamento frazionato. La sostanza da sterilizzare viene sottoposta a calore umido a 100°C in autoclave per due o tre volte ogni 24 durante le quali il materiale viene mantenuto a Temperatura Ambiente o in una incubatrice. Si alternano dei cicli di distruzione e di germinazione delle forme vegetative.

8 Vapore saturo sotto pressione: consiste nel sottoporre la sostanza da sterilizzare all’azione del vapore saturo e compresso in ambienti ermeticamente chiusi ed a perfetta tenuta. (N.B. la pressione di 0.75 e 1 atm corrispondono a 115 e 121°C rispettivamente). È impiegato per sostanze non termolabili. È rapido ed economico. Il vapore impiegato presenta i seguenti vantaggi:  Cede le calorie di condensazione a T costante (527Kcal/kg a 121°C);  Si può ottenere da fonti relativamente economiche (olio combustibile o metano);  È inodore, insapore, atossico e non sporca i materiali;  Quando cede le sue calorie si riduce drasticamente di volume attirando altro vapore attorno al materiale (1 m 3 a 121°C si trasforma in 1,1 l di H 2 O)

9 Sistemi Particolari: vengono impiegati per i materiali che non possono essere sterilizzati con i metodi convenzionali come ad esempio i recipienti in plastica. Metodo Subacquale La camera dell’autoclave viene riempita quasi completamente d’acqua in modo da coprire i recipienti. Dal basso viene immesso del vapore che riscalda l’acqua mantenuta in agitazione, nel frattempo viene praticato una sovrapressione all’interno dei recipienti. Metodo con miscela omogenea di vapore e aria Si realizza immettendo entro la camera di un’autoclave una determinata quantità di vapor d’acqua e di aria in pressione mantenuti in agitazione per garantirne l’omogeneità. La pressione parziale del vapore determina la temperatura di sterilizzazione mentre quelle dell’aria regola la pressione totale della miscela.

10 Apparecchiature per la Sterilizzazione: Stufe a secco e Autoclavi A scopo industrale si utilizzano le stufe ed autoclavi per sterilizzare col calore secco, mentre per il calore umido si utilizzano le autoclavi. Stufe a secco Sono attrezzature nelle quali si ha una circolazione forzata di aria calda che può avvenire per convezione normale o forzata. Essiccatori a calore diretto: Essiccatori a circolazione d’aria (a letto statico, vassoi a turbolenza) Essiccatori a cilindro rotante Essiccatori a letto fluido Essiccatori per nebulizzazione (atomizzazione) Essiccatori a calore indiretto Essiccatori a cilindri rotanti Essiccatori a pressione ridotta Essiccatori a calore radiale (riscaldamento con raggi IR)

11 Tutte le apparecchiature sono corredate di strumentazioni che consentono il controllo dei tempi e delle temperatura nelle varie fasi di utilizzo: Riscaldamento Sterilizzazione Raffreddamento

12 Sono camere metalliche a forma di cilindro o parallelepipedo, chiuse ermeticamente, resistenti a pressioni superiori a quella atmosferica o a depressioni entro cui viene posto il materiale da sterilizzare. Nella camera viene immesso del vapore alla temperatura stabilita e per un determinato periodo di tempo, che successivamente viene scaricato.

13 Modalità costruttive Camere in acciaio inossidabile (AISI 316) rinforzata per aumentarne la resistenza alle variazioni di pressione. Dotate di una o due porte che possono essere a libro o scorrevoli. È fornita anche di due dispositivi di sicurezza: Uno meccanico per impedire l’apertura della porta se è presente una pressione elevata Uno elettrico per impedire l’avvio del programma di sterilizzazione se la porta è aperta o chiusa male. Schematicamente si può rappresentare con una camera dove avviene la sterilizzazione circondata da un’intercapedine dove è introdotto il vapore per il riscaldamento dell’autoclave.

14 Fasi della sterilizzazione La prima operazione dopo aver caricato l’autoclave e chiuso ermeticamente i portelli è l’eliminazione dell’aria. È una operazione importante perché l’aria presente pregiudica l’omogeneità della temperatura; si possono stratificare sacche d’aria nelle zone più basse dell’autoclave nelle quali la temperatura è diversa. L’allontanamento dell’aria può essere ottenuta nei seguenti modi.: Spostamento per gravità l’aria viene scaricata dal basso dopo immissione di vapore che si dispone nella parte superiore. È un metodo non più utilizzato. Vuoto iniziale spinto L’aria viene aspirata praticando il vuoto. È una tecnica difficile in quanto comporta l’allontanamento di grosse quantità d’aria ricca di umidità. Vuoto pulsante Consiste nel realizzare una fase di vuoto moderato seguita da immissione di vapore; questa operazione viene ripetuta in genere tre volte.

15 Vuoto con contemporanea immissione di vapore Consiste nell’effettuare il vuoto nella camera a mezzo di una pompa, iniettando contemporaneamente una moderata quantità di vapore acqueo. Nella camera si verificano le seguenti fasi:  L’aria esce sia perché aspirata dalla pompa, sia perché spinta dal vapore, sia per gravità.  Il vapore riscalda in parte il materiale grazie al suo calore sensibile.  Le pareti della camera trasmettono calore al materiale utilizzando come agente di trasmissione il vapore stesso che si riscalda sulle pareti e si raffredda sul materiale.

16 Riscaldamento e sterilizzazione Dopo aver eliminato l’aria si inizia la fase di riscaldamento fino alla T prefissata e poi si procede alla sterilizzazione vera e propria a T costante. Tutte le operazioni vengono controllate automaticamente: ingresso e uscita dei vapori; tempi; temperature ecc. Raffreddamento Scaduto il periodo di sterilizzazione (≤60 minuti) inizia la fase di raffreddamento sostituendo il vapore presente nell’intercapedine con acqua fredda. Con tale sistema a causa dello scarto termico si possono verificare delle contrazioni termiche che possono deformare la camera irreparabilmente. Si ovvia a questo problema nebulizzando all’interno della camera acqua demineralizzata che raffredda il materiale perché provoca una rapida caduta della pressione e della temperatura del vapore.

17 Sterilizzazione per mezzo di luce ultravioletta Quando la sterilizzazione per mezzo del calore non è applicabile in quanto si rischierebbe di alterare la stabilità del materiale si applica la tecnica di sterilizzazione con raggi UV ai locali di lavorazione. In tali locali l'aria è condizionata e filtrata, sono sottoposti ad una leggera sovrapressione rispetto all'esterno E si irradiano con raggi ultravioletti (lunghezza d'onda ), I RAGGI UV sono dotati di un potente effetto battericida e quindi molto utili per sterilizzare l'aria e le superfici lisce. Penetrano pochissimo nei tessuti organici e sono quasi completamente assorbiti dal vetro, per cui possono essere utilmente impiegati senza danneggiare le persone con cui vengono a contatto. In tal modo, nell'ambiente mantenuto il più possibile sterile, possono continuare a lavorare le persone addette (indossando occhiali di protezione).

18 Sterilizzazione per mezzo di radiazioni ionizzanti In teoria si possono impiegare i seguenti tipi di radiazioni: , , , X, Neutroni. In pratica si utilizzano solo i raggi ,  perché gli altri tipi  presentano degli incovenienti: a) Raggi  : scarso potere di penetrazione; b) Raggi X: parte dell’energia si dissipa nel materiale come calore; c) Neutroni: buona penetrazione ma generano intensa radioattività. Raggi  (elettroni) Le radiazioni emesse da radioisotopi (Sr 90) non vengono impiegate perché hanno scarso potere di penetrazione, mentre quelle emesse da macchine acceleratrici (es. acceleratore statico di Van der Graaf), hanno capacità di penetrazione in funzione della loro energia.

19 Raggi  (elettroni) Sono radiazioni emesse da vibrazioni elettromagnetiche ad altissima frequenza di isotopi radioattivi (Cs 137, Co 60). Trovano applicazioni nel campo dei materiali da medicazione. Con questa tecnica si ha il vantaggio di poter trattare materiali e prodotti già confezionati che non devono subire successive manipolazioni. Impianto di Irradiamento I materiali seguono un percorso a pettine attorno alla sorgente presentando ad essa alternativamente e più volte i due fianchi. L’impianto è totalmente automatizzato e continuo. È costruito spesso in cemento armato.

20 Sterilizzazione per mezzo di ultrasuoni L’impiego degli ultrasuoni nella sterilizzazione è poco diffuso a causa degli effetti collaterali. Possono disgregare la cellula batterica con conseguente liberazione del contenuto cellulare il quale porta alla formazione di tossine. Inoltre possono trasformare l’H 2 O in H 2 O 2.

21 Con i mezzi chimici la sterilizzazione si realizza per contatto delle sostanze chimiche con i microrganismi che si trovano sul materiale da trattare e può avvenire sia per aggiunta di sostanze battericide, sia per azione di gas o vapori. Le sostanze battericide (Sali d’ammonio Quaternari) sono impiegati per sterilizzare o disinfettare macchine o superfici. Sterilizzazione con gas o vapori Si applica a prodotti termolabili. I principali agenti sterilizzanti sono la formaldeide, il  -propiolattone l’ossido di etilene.

22 Formaldeide  È un gas irritante, tossico e poco penetrante e quindi utilizzabile solo come disinfettante di superficie, per sterilizzare oggetti e locali;  Ambienti e prodotti sono investiti da un flusso di vapori di formaldeide, generati per vaporizzazione e successiva nebulizzazione per riscaldamento, entro un’autoclave mantenuta sotto vuoto e riscaldata.  Tipicamente il processo corrisponde ad una temperatura di 80° per 2 ore di tempo.  -Propiolattone (BPL) Attulamente è un agente sterilizzante gassoso di scarse applicazione. È circa 20 volte più attivo della formaldeide e 4000 volte più attivo dell’ossido di etilene. Il suo impiego è limitato a causa della scarsa capacità di penetrazione nei materiali porosi, dell’elevata tossicità e per i costi.

23 Ossido di Etilene  È l’agente capace di sterilizzare a freddo o a basse temperature più usato.  È utilizzato per i materiali che non sono sterilizzabili in autoclave (PVC, polietilene, alcune gomme, ecc.). Come le radiazioni ionizzanti, può essere utilizzato per prodotti sigillati nel loro contenitore definitivo (se permeabile al gas), con il vantaggio di poter essere utilizzato negli stabilimenti farmaceutici e nei centri ospedalieri.  Può formare miscele esplosive con l'aria e quindi viene utilizzato diluito con anidride carbonica o con idrocarburi cloro-fluorurati. Si opera in autoclave a temperature comprese fra 35 e 55°C, tenendo conto che la sua attività sterilizzante aumenta con la temperatura ed il trattamento richiede parecchie ore.

24 Parametri di Sterilizzazione  I principali parametri che influenzano la sterilizzazione con ETO sono: Concentrazione ETO (o pressione assoluta della miscela) La velocità di sterilizzazione dipende dalla concentrazione fino a 50°C, oltre tale temperatura la dipendenza tende ad annullarsi. Temperatura Il tempo di trattamento dipende dalla temperatura di esercizio. In pratica non si raggiungono valori elevati per evitare problemi con le sostanze termolabili. Umidità Valori insufficienti o troppo elevati impediscono o riducono l’efficacia del trattamento. I valori sono scelti in base al materiale da trattare. Tempo Il tempo è collegato alla temperatura d’esercizio e alla concentrazione del gas.

25 Nella sterilizzazione industriale intervengono altri fattori quali: Pulizia delle superfici Occlusione di microrganismi in cristalli Modalità e momento di Umidificazione Velocità di evacuazione della camera

26 Un agente antimicrobico è un composto chimico che uccide i microrganismi o ne inibisce la crescita e può essere sia un composto naturale che un composto chimico di sintesi. Spesso, per designare sostanze dotate di questo tipo di attività, si utilizzano parole composte dal nome del tipo di microrganismo che ne subisce l'azione e dal suffisso -cida o -statico, che indicano rispettivamente se il composto determini la morte o semplicemente inibisca la crescita del microrganismo.

27 Un fungicida è un composto che provoca la morte di funghi, ma non necessariamente di batteri o alghe; Un batteriostatico è un composto che inibisce la crescita di batteri. ma non necessariamente di altri tipi di microrganismi. La distinzione tra la capacità di un composto di determinare la morte o l'inibizione della crescita di microrganismi è spesso arbitraria, in quanto lo stesso composto può essere letale ad alte concentrazioni, mentre, a basse concentrazioni, può limitarsi ad avere effetto inibente. Per essere efficace, un agente inibente la crescita deve essere costantemente presente, poiché se viene rimosso o neutralizzato, il microrganismo che ne subisce l'azione potrebbe, se le condizioni sono favorevoli, ricominciare a crescere.

28 La sterilizzazione consente: la distruzione di tutti i microorganismi (batteri, lieviti, muffe) l'inattivazione degli enzimi, responsabili delle piu gravi alterazioni dei prodotti di origine naturale. L’innalzamento di temperatura del prodotto provocato dalla somministrazione di calore, ha un’azione letale per tutte le forme viventi. Le condizioni per ottenere una sterilità completa o almeno “commerciale” dipendono da vari fattori:  Modalità di trasmissione e somministrazione del calore al sistema  Resistenza dei microorganismi al calore, (a seconda della natura e dello stadio di sviluppo dei microrganismi).  Natura del substrato,  pH  Tenore in umidità A valori di pH inferiori a 3,7 lo sviluppo dei batteri si arresta Effetti rilevanti sulla termoresistenza dei microrganismi sono esercitati anche dagli zuccheri, dai sali, dalle proteine e dalle sostanze grasse

29 Tempi Di Morte Termica (T.M.T.) T.M.T.: tempo necessario perché un microrganismo, in un sistema biologico, ad una data temperatura, venga completamente distrutto. Le curve in grafico riportano i profili che rappresentano l'inattivazione in funzione del tempo nel caso di due diversi microorganismi dotati di differente resistenza. Osservando la figura si può notare che la temperatura adottata risulta chiaramente letale per entrambi i microrganismi, mentre diversi sono i tempi per raggiungere la sterilità. Molto importante è il grado di contaminazione iniziale (valore al tempo zero) Appare evidente la necessità di seguire, anche nel trattamento dei materiali destinati alla sterilizzazione, almeno le norme più elementari di igiene. le condizioni di sterilizzazione sono scelte in modo da garantire la disattivazione anche di quelli più resistenti Le prove di controllo vengono condotte su microrganismi particolarmente resistenti al calore.


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