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Congelamento Banche di cellule per preservare le nostre cellule sia da contaminazioni che dallinvecchiamento della coltura. Banche di cellule per preservare.

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Presentazione sul tema: "Congelamento Banche di cellule per preservare le nostre cellule sia da contaminazioni che dallinvecchiamento della coltura. Banche di cellule per preservare."— Transcript della presentazione:

1 Congelamento Banche di cellule per preservare le nostre cellule sia da contaminazioni che dallinvecchiamento della coltura. Banche di cellule per preservare le nostre cellule sia da contaminazioni che dallinvecchiamento della coltura. Modo di avere stock allo stesso passaggio. Modo di avere stock allo stesso passaggio. Le cellule si conservano a -196 °C o per pochi mesi a -80 °C. Le cellule si conservano a -196 °C o per pochi mesi a -80 °C.

2 I crioprotettivi Il congelamento deve essere fatto in modo da non danneggiare la cellula. Per questo si deve formare nella cellula del ghiaccio amorfo, non cristallino, che può rompere la membrana. Il congelamento deve essere fatto in modo da non danneggiare la cellula. Per questo si deve formare nella cellula del ghiaccio amorfo, non cristallino, che può rompere la membrana. Per fare questo si deve aumentare la quantita di proteine allinterno della cellula e questo si ottiene con DMSO e unalta concentrazione di siero, e un congelamento lento. Per fare questo si deve aumentare la quantita di proteine allinterno della cellula e questo si ottiene con DMSO e unalta concentrazione di siero, e un congelamento lento.

3 Procedura: Contare le cellule Contare le cellule Centrifugarle a 250 g x 10 min Centrifugarle a 250 g x 10 min Eliminare il sopranatante e risospendere in terreno contenente 10% DMSO e 50 % FCS, alla concentrazione raccomandata per ogni linea cellulare, di solito tra 0,8 e 3 milioni di cell/mL. Eliminare il sopranatante e risospendere in terreno contenente 10% DMSO e 50 % FCS, alla concentrazione raccomandata per ogni linea cellulare, di solito tra 0,8 e 3 milioni di cell/mL. Mettere in fialine da congelamento (cryovials) da 2 mL Mettere in fialine da congelamento (cryovials) da 2 mL Congelare lentamente (1 °C al minuto) Congelare lentamente (1 °C al minuto)

4 Le cellule vengono conservate in dewar di azoto liquido. Le cellule vengono conservate in dewar di azoto liquido.

5 Scongelamento Le cellule vanno scongelate rapidamente immergendole in un bagno a 37 °C. Le cellule vanno scongelate rapidamente immergendole in un bagno a 37 °C. Dato che il DMSO puo essere un agente differenziante, e bene eliminarlo dal terreno di coltura, diluendo il contenuto del cryovials con circa 20 mL di terreno, o PBS: e importante diluire lentamnete, perche ce una grossa differenza nella pressione osmotica (oncotica) del terreno al 50% di siero e quello al 10 %. Dato che il DMSO puo essere un agente differenziante, e bene eliminarlo dal terreno di coltura, diluendo il contenuto del cryovials con circa 20 mL di terreno, o PBS: e importante diluire lentamnete, perche ce una grossa differenza nella pressione osmotica (oncotica) del terreno al 50% di siero e quello al 10 %.

6 Procedura di scongelamento. Scongelare le cellule. Scongelare le cellule. Trasferirle in una Falcon da 15 mL sterile, aggiungere lentamente 10 mL di terreno, risospendere delicatamente. Trasferirle in una Falcon da 15 mL sterile, aggiungere lentamente 10 mL di terreno, risospendere delicatamente. Centrifugare a 250 g x 10 min Centrifugare a 250 g x 10 min Eliminare il sopranatante e risospendere in terreno, in alcuni casi al 20 % di FCS. Eliminare il sopranatante e risospendere in terreno, in alcuni casi al 20 % di FCS.


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