Analisi degli alimenti (LMC-6: PACKAGING) Giorgio Bonaga

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1 Analisi degli alimenti (LMC-6: PACKAGING) Giorgio Bonaga
Anno Accademico 2010/ Laurea Magistrale in CHIMICA Analisi degli alimenti (LMC-6: PACKAGING) Giorgio Bonaga 1

2 ANALISI DEI CONTAMINANTI DA PACKAGING
2

3 Bisphenol A (BPA) is 2,2-bis(4-hydroxyphenyl)propane.
Bisfenolo A (BPA) Bisphenol A (BPA) is 2,2-bis(4-hydroxyphenyl)propane. Sintetizzato per la prima volta dal chimico russo A.P. Dianin nel 1891, attualmente viene preparato per condensazione dell’acetone (da cui deriva la lettera A) con due equivalenti di fenolo. La reazione è catalizzata da una acido o da una resina di poliestere sulfonato.

4 precursore di ritardatori
USI DEL BPA polisteri precursore di ritardatori di fiamma BPA policarbonati polisulfonati inibitore polimerizzazione PVC chetoni polieteri

5 BADGE is an acronym for Bisphenol A diglycidyl ether

6 BADGE E DERIVATI REGOLAMENTATI
BADGE. HCl BADGE.H2O BADGE.2HCl BADGE.2H2O BADGE.HCl.H2O

7 RESINE EPOSSIDICHE resina pigmenti solventi agenti di cross-linking
epossidica

8 Struttura di resina epossidica:
Sintesi di resina epossidica: + epichlorhydrine bisphenol A NaOH n

9 EPOXY EQUIVALENT WEIGHT (EEW) = quantità di resina espressa in grammi che contiene un grammo-equivalente di gruppo epossidico. L’equivalente epossidico determina anche lo stato fisico e la reattività della resina. EEW  300 resine liquide la cui reattività dipende dall’elevata concentrazione di gruppi epossidici. EEW > resine solide la cui reattività è anche legata alla presenza di ossidrili secondari, la cui rilevanza aumenta con l’incremento del peso molecolare.

10 VANTAGGI E SVANTAGGI DELLE RESINE EPOSSIDICHE
i film hanno una notevole resistenza verso i principali agenti chimici; eccellente resistenza all’abrasione e all’urto; eccezionale adesione a superfici di diversa natura; termostabilità nell’intervallo da -70°C a +100°C; quelle a basso peso molecolare non richiedono solventi per la loro sintesi. SVANTAGGI: i film sono abbastanza costosi; possono ingiallire ed opacizzare in presenza di radiazioni UV e a contatto con l’ossigeno atmosferico; in condizioni spinte possono diventare fragili e il film si polverizza.

11 RESINE EPOSSI-FENOLICHE
Sono sintetizzate a partire da resine epossidiche e resine fenoliche. Le resine fenoliche sono polimeri generalmente termoindurenti, ottenuti dalla reazione del fenolo con la formaldeide. La reazione è una sostituzione elettrofila nella quale tre molecole di formaldeide sostituiscono gli atomi di idrogeno nelle posizioni orto e para del fenolo. Il 2,2,4-tris(idrossimetil)fenolo che, a sua volta, reagisce con altre molecole di fenolo con eliminazione di una molecola di acqua in ciascuna reazione. Il risultato netto è la condensazione di molecole di fenolo attraverso gruppi metilenici in posizione orto e para. + 3

12 RESINE EPOSSI-FENOLICHE
epossidiche catalizzatori pigmenti resine fenoliche resine epossi-fenoliche

13 La parte fenolica della resina conferisce le proprietà di resistenza verso acidi e solventi, mentre la pesina epossidica conferisce flessibilità, adesione e durezza. Per queste ragioni le resine epossi-fenoliche sono usate come rivestimento interno di cisterne, contenitori metallici e silos industriali.

14 VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AL BPA
Presso la comunità scientifica le conseguenze dell’esposizione al BPA sono controverse: sulla base delle conoscenze tossicocinetiche del BPA nel sangue umano (rapida biotrasformazione e velocissima escrezione) le modeste concentrazioni di BPA nel sangue umano non sono ritenute significative per la valutazione del rischio tossicologico a causa della rapida e completa escrezione di BPA somministrato per via orale, l’urina è il fluido biologico più idoneo a valutare l’esposizione al BPA. Gli studi sulla tossicità del BPA risalgono circa all’anno 2000, ad eccezione di alcune ricerche sull’estrogenicità del BPA che risalgono agli anni ‘30. il BPA non è genotossico, non è carcerogeno e studi ripetuti sulla dose tossica, che includono test di tossicità sulla riproduzione e crescita con un ampio intervallo di dosi, mostrano che gli effetti nocivi si manifestano soltanto ad una dose > 50 mg/Kg peso corporeo/giorno.

15 RESINE PER RIVESTIMENTI INTERNI DI BARATTOLI, SCATOLE, TUBI
Le resine epossidiche e epossi-fenoliche sono utilizzate come rivestimento interno di contenitori per alimenti. SCATOLE CON RIVESTIMENTO INTERNO SMALTATO BIANCO SCATOLE CON RIVESTIMENTO INTERNO TRASPARENTE prodotti ittici (in acqua) pomodori mais Resine epossidiche + TiO2 prodotti ittici (in olio) ortaggi verdi sciroppi di frutta cibi per animali Resine epossi-fenoliche

16 RESINE EPOSSI-FENOLICHE
Novolacche Con un rapporto aldeide: fenolo < 1 ed una catalisi acida si ottengono le novolacche, polimeri termoplastici perché costituiti da lunghe molecole lineari. Resoli Con un rapporto aldeide:fenolo > 1 ed una catalisi basica si ottengono i resoli, polimeri termoindurenti dalla struttura reticolare assimilabile a quella di una novolacca in cui residui di aldeide fanno da ponte tra due catene lineari.

17 Gli studi relativi agli effetti di BPA a basso dosaggio non sono considerati sufficientemente convincenti per valutare il rischio dell’esposizione al BPA (EFSA, 2006). La dose giornaliera tollerabile (tolerable daily intake = TDI) del BPA, basata sulla dose senza effetti nocivi osservati (no-observed-adverse-effect-level = NOAEL) divisa per un fattore di sicurezza (di incertezza) pari a 100, è stata posta a 0.05 mg/Kg p.c./giorno dall’AFC panel dell’EFSA (2006). La United States Environmental Protection Agency (US EPA) ha calcolato per il BPA una dose di riferimento (reference dose = RfD) pari a 0.05 mg/Kg p.c./giorno, basata sulla riduzione di peso corporeo osservato in ratti alimentati con dosi di 50 mg/Kg p.c./giorno per 103 settimane, applicando un fattore di incertezza pari a 1000 alla dose con il minimo effetto osservato (lowest-observed-effect-level = LOAEL). I. A. Lang et al. (*) hanno condotto il primo studio incrociato sugli effetti sulla salute umana dell’esposizione al BPA. Certi livelli di BPA Sono significativamente correlati a disturbi cardiovascolari, diabete e all’aumento anomalo del livello di alcuni enzimi epatici. (*) I. A. Lang et al.: J. Am. Med. Assoc., 300 (11), (2008).

18 EUROPA - BPA FRANCIA Ottobre 2008: l’Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments (AFSSA) afferma che i contenitori di policarbonato usati nel packaging degli alimenti per l’infanzia non superano i livelli stabiliti dall’EFSA anche quando vengono scaldati in forno a microonde per meno di 10 minuti. Marzo 2009: il Ministro francese della Sanità, Roselyne Bachelot-Narquin, in disaccordo con le conclusioni dell’AFSSA dichiara che “la decisone delle autorità Canadesi di vietare l’uso del BPA nella produzione delle babies bottles non è dovuta all’opinione pubblica, ma ai risultati di indagini scientifcamente attendibili”. GERMANIA Settembre 2008: il Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), cioè l’ Istituto Federale Tedesco per la valutazione del rischio, afferma che in considerazione delle ricerche di Lang, non ci sono ragioni significative per modificare la valutazione del rischio dell’esposizione al BPA.

19 PAESI BASSI Novembre 2008: la Dutch Food and Consumer Product Safety Authority (VWA) afferma che le babies bottles di policarbonato non cedono livelli misurabili di BPA e, pertanyo, vanno considerate sicure. SVIZZERA Febbraio 2009: sulla base dei risultati di agenzie sanitarie pubbliche, il Swiss Federal Office for the Public Health afferma che l’assunzione di BPA attraverso gli alimenti e le bevande non rappresenta un rischio per i consumatori, compresi i neonati e i bambini. Nonostante ciò l’ufficio federale suggerisce un uso corretto delle babise bottles di policarbonato e fornisce un elenco di soluzioni alternative. ITALIA Novembre 2008: vengono considerati sicuri i livelli di BPA riportati da Lang e pertanto non vengono modificati i limiti della resina negli alimenti.

20 EFSA - BPA (European Food Safety Authority)
Novembre 2006: TDI (BPA) = mg/Kg p.c./giorno Luglio 2008: per gli adulti e i neonati l’esposizione al BPA ≤ alla TDI Ottobre 2008: il parere dell’EFSA sulle ricerche di I. A. Lang stabilisce la mancanza di evidenze sulla relazione tra BPA e le patologie prese in considerazione. Di conseguenza l’EFSA non modifica la TDI 20

21 EFSA – BADGE ( E DERIVATI REGOLAMENTATI)
Luglio 2004: TDI(BADGE): 0.15 mg/Kg p.c./giorno BADGE e cloridrin-derivati (BADGE.2HCl, BADGE.HCl e BADGE.H2O.HCl) non sono considerati pericolosi rispetto la cancerogenicità e la genotossicità in vivo. Viene confermato il limite di 1.0 mg/Kg alimento.

22 MIGRAZIONE - NORMATIVA
Direttiva CE 82/711 SML(s) = Limite di Migrazione Specifica (singolo) Limite di migrazione specifica negli alimenti o nei liquidi simulanti, se non diversamente specificato. SML(T) = Limite di Migrazione Specifica (Totale) Limite di migrazione specifica negli alimenti o nei liquidi simulanti, espresso come totale del gruppo di sostanze indicate.

23 MIGRAZIONE - NORMATIVA
TIPO DI PRODOTTO SIMULANTE ABBREVIAZIONE alimenti acquosi (con pH > 4.5) acqua distillata o acqua di qualità equivalente Simulante A alimenti acidi (con pH  4.5) soluzione di acido acetico al 3% (p/v) Simulante B prodotti alcolici soluzione di etanolo al 10% (v/v) Simulante C alimenti a base di olio olio di oliva rettificato o altri simulanti oleosi Simulante D alimenti secchi no

24 MIGRAZIONE - NORMATIVA
CONDIZIONI DI CONTATTO NEI CASI PIU’ CRITICI CONDIZIONI TEST DURATA DEL CONTATTO TEMPO t  5 min VEDERE CONDIZIONI CRITICHE 5 min < t  0.5 h 0.5 h 0.5 h < t  1 h 1 h 1 h < t  2 h 2 h 2 h < t  4 h 4 h 4 h < t  24 h 24 h t > 24 h 10 days TEMPERATURA DI CONTATTO(°C) TEMPERATUTA (°C) T  5 5 5 < T  20 20 20 < T  40 40 40 < T  70 70 70 < T  100 o temperatura di reflusso 100 < T  121 (*) 121 < T  130 130 < T  150 T > 150 (*) questa temperatura è usata solo con il simulante D. Per i simulanti A, B e C il test può essere sostituito con una prova condotta a 100°C o a temperatura di reflusso, per un periodo di tempo che è quattro volte maggiore di quello stabilito dalle norme generali.

25 MIGRAZIONE- LIMITI NORMATIVI
BPA Direttiva 2004/19/EC del 01/03/2004 SML(T) = 0.6 mg/Kg BADGE Regolamento (CE) N. 1895/2005 del 18/11/2005 SML(T) del BADGE e dei suoi derivati regolamentati: la somma BADGE + BADGE.H2O + BADGE.2H2O non può superare: 9 mg/Kg nei simulanti o nell’alimento 9 mg/6 dm2 la somma BADGE.HCl + BADGE.2HCl + BADGE.HCl.H2O non può superare: 1 mg/Kg nei simulanti o nell’alimento 1 mg/6 dm2

26 MATRICI ALIMENTARI vs SIMULANTI
SCHEMA ANALITICO SML(s) di BPA, BADGE & derivati regolamentati, secondo quanto descritto nella Direttiva CE 82/711 e successive modificazioni, sulle scatole nuove ALIMENTI Simulante D ESTRAZIONE LC-MS/MS RISULTATI Simulanti A & B CONFRONTO MATRICI ALIMENTARI vs SIMULANTI

27 ESTRAZIONE È stata utilizzata soltanto per gli alimenti e il simulante D. Per l’estrazione del BPA, BADGE and i suoi derivati regolamentati l’estrazione solida-liquida-liquida seguita da clean-up con SPE è stata sostituita con il metodo QuEChERS Il metodo QuEChERS è stato realizzato con DisQue Dispersive Sample Preparation Kit, contenente DisQue di estrazione (tubo 1) and DisQue di clean-up (tubo 2).

28 LC-MS/MS API 3200 (Applied Biosystems) triplo quadrupolo MS equipaggiato con Turbo V Ionspray. Agilent (1200 Series), utilizzando una pompa binaria per HPLC Colonna HPLC: Phenomenex® Luna 3 m C18 (2) 100 Å, 150 x 3.00 mm, con precolonna Security-Guard Mass Spectrometry: Multiple Reaction Monitoring (MRM)

29 BPA Sorgente: ESI (ioni negativi)
Fase mobile: Solvente A = 10 mM acetato d’ammonio in ACN Solvente B = 10 mM ammonio acettao in H2O Velocità flusso 0,5 ml/min Tempo totale (min) Flusso (ml/min) A (%) B 0,5 70 30 3 4 90 10 5 8

30 CHROMATOGRAMMA DI BPA STANDARD (500 ppb)

31 BADGE AND ITS REGULATED DERIVATIVES
Sorgente: ESI (ioni positivi) Fase mobile: Solvent A = 0.5% acido formico in ACN Solvent B = 0.5% acido formico in H2O Velocità flusso: 0,5 ml/min Tempo totale (min) Flusso (ml/min) A (%) B 0,0 0,5 50 5,5 9,0 95 5 10,0 10,1 2,.0

32 CROMATOGRAMA DEI BADGEs (500 ppb)
BADGE.H2O BADGE.2H2O BADGE.2HCl + BADGE.H2O.HCl BADGE.HCl

33 RISULTATI - RECUPERI R E C O V E R I E S % 62.0 ± 1.8 82.1 ± 2.4
COMPOUND LOD (ppb) LOQ (ppb) R E C O V E R I E S % Tuna in water Tuna in olive oil Tomatoes Green Beans Peaches in syrup White Beans Anchovy fillets in olive oil BPA 8 16 55.8 ± 5.8 70.0 ± 8.5 74.3 ± 5.1 78.1 ± 5.3 92.0 ± 2.0 54.7 ± 3.4 68.9 ± 1.4 BADGE.2H2O 4 121.0 ± 6.6 85.7 ± 11.5 87.5 ± 9.7 63.4 ± 11.3 82.0 ± 7.1 72.4 ± 3.7 67.0 ± 1.5 BADGE.HCl.H2O 32 107.9 ± 13.7 107.0 ± 2.5 88.8 ± 6.3 82.2 ± 5.1 95.0 ± 15.1 91.3 ± 5.4 90.3 ± 1.8 BADGE.2HCl 64 102.2 ± 8.5 64.0 ± 4.3 104.5 ± 9.7 73.0 ± 9.0 81.0 ± 4.4 87.2 ± 5.5 144.2 ± 4.4 BADGE.H2O 91.0 ± 5.0 102.0 ± 2.6 86. 7± 6.3 97.6 ± 9.4 90.3 ± 9.6 85.2 ± 6.9 102.0 ± 10.1 BADGE.HCl 88.7 ± 7.8 60.4 ± 8.6 103.0 ± 4.6 92.9 ± 3.6 105.0 ± 4.2 86.1 ± 5.5 87.0 ± 3.2 BADGE 120.0 ± 4.3 72.0 ± 4.3 114.0 ± 1.7 102.7 ± 3.4 110.7 ± 9.0 92.5 ± 3.3 101.0 ± 0.3  COMPOUND RECOVERIES - SIMULANT D % BPA 62.0 ± 1.8 BADGE.2H2O 82.1 ± 2.4 BADGE.HCl.H2O 99.8 ± 1.6 BADGE.2HCl 67.7 ± 4.9 BADGE.H2O 118.0 ± 2.5 BADGE.HCl 80.0 ± 3.7 BADGE 123.0 ± 2.7

34 BADGE + BADGE.H2O + BADGE.2H2O BADGE.HCl + BADGE.2HCl + BADGE.HCl.H2O
FOOD vs SIMULANT A BADGE + BADGE.H2O + BADGE.2H2O BADGE.HCl + BADGE.2HCl + BADGE.HCl.H2O BPA

35 BADGE + BADGE.H2O + BADGE.2H2O BADGE.HCl + BADGE.2HCl + BADGE.HCl.H2O
FOOD vs SIMULANT B BADGE + BADGE.H2O + BADGE.2H2O BADGE.HCl + BADGE.2HCl + BADGE.HCl.H2O BPA

36 BADGE + BADGE.H2O + BADGE.2H2O BADGE.HCl + BADGE.2HCl + BADGE.HCl.H2O
FOOD vs SIMULANT D BADGE + BADGE.H2O + BADGE.2H2O BADGE.HCl + BADGE.2HCl + BADGE.HCl.H2O BPA

37 HPLC - FLD Estrazione con ACN (24 h, T ambiente) di scatole nuove rivestite con resine epossidiche epossi-fenoliche; Analisi degli estratti in ACN e dgli estratti mediante QuEChERS di matrici alimentari; Colonna HPLC: Waters® X Terra, RP18 5 m, 150mm x 4,6 mm Fase mobile: ACN:H2O (50:50, v/v) Velocità flusso: 0,5 ml/min Diluizione del campione: 1:2 con H2O Volume iniettato: 20 µL exc = 275 nm, em = 325 nm

38 ESTRATTO DI RESINE EPOSSIDICHE
? BADGE.2H2O BADGE BADGE. H2O BPA BADGE 2H2O

39 RISULTATI

40 CONCLUSIONI I risultati relativi agli alimenti sono differenti da quelli relativi ai simulanti, con una discordanza significativa in più del 60% dei casi; Il trend di migrazione del BPA è differente da quello dei BADGEs; Il BADGE scompare negli alimenti in relazione alla durata delle sue interazioni con la matrice alimentare; I test di conformità con i simulanti non sembrano essere in grado di valutare la migrazione reale; È necessario realizzare le analisi della migrazione dalle resine sia con i simulanti che con gli alimenti reali.