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L.S. in Scienze e tecnologie alimentari Anno Accademico 2008/2009 Corso integrato: Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU) Modulo.

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1 L.S. in Scienze e tecnologie alimentari Anno Accademico 2008/2009 Corso integrato: Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU) Modulo di: Chimica analitica strumentale (4 CFU) Giorgio Bonaga CROMATOGRAFIA LIQUIDA (LC) (CAS-4a) Giorgio Bonaga

2 CROMATOGRAFIA LIQUIDA (LC) FASE MOBILE: liquido Il potere analitico della LC attuale deriva dalla varietà delle proprietà di un grande assortimento di fasi mobili (solventi) e di fasi stazionarie, ma anche dallampia disponibilità di rivelatori. Le tipologie di cromatografia liquida sono classificate secondo il tipo di interazione che si realizza tra la fase stazionaria e i soluti presenti nella fase mobile, anche se sovente la natura dellinterazione è molteplice. CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO (LSC) FASE STAZIONARIA: solido poroso più polare e fase mobile meno polare CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE IN FASE INVERSA (RPC) FASE STAZIONARIA: liquido meno polare e fase mobile più polare CROMATOGRAFIA DI SCANBIO IONICO (IEC) FASE STAZIONARIA: liquido con gruppi ionici legati e fase mobile ionica CROMATOGRAFIA A ESCLUSIONE DIMENSIONALE (SEC) FASE STAZIONARIA: solido poroso e fase mobile con funzione solvente Giorgio Bonaga

3 La cromatografia liquida attuale è fondamentalmente HPLC ( High Performance Liquid Chomatography ) in tutte le varianti dei metodi di separazione. Essa offre una serie di vantaggi rispetto la cromatografia classica su colonna: utilizza colonne di piccolo diametro (1-5 mm contro 1-4 cm) le colonne sono riempite con particelle molto piccole (3-10 m) può contare sul grande sviluppo di nuove fasi stazionarie può sopportare pressioni molto elevate (fino a oltre 1000 atm) consente il minuzioso controllo del flusso della fase mobile può disporre di rivelatori on line di elevata sensibilità offre una strumentazione standardizzata ed automatizzata consente una grande riduzione dei tempi di analisi offre una elevata risoluzione e una notevole sensibilità analitica LHPLC può operare a composizione costante della fase mobile ( eluizione isocratica ) o con miscele di solventi di diversa polarità miscibili in tutte le proporzioni e in rapporti che possono essere variati secondo un programma ( eluizione a gradiente ). Questultima modalità produce separazioni più efficienti e tempi di analisi inferiori.

4 Lo strumento della cromatografia liquida (HPLC) è il cromatografo liquido, le cui parti essenziali sono: 1. serbatoi dei solventi 2. filtro 3. pompa e valvola dosatrice 4. regolatore della pressione (flusso) 5. sistema di introduzione del campione ( injector ) 6. precolonna ( guard colunn ) 7. colonna cromatografica ( analytical column ) 8. rivelatore ( detector ) Giorgio Bonaga

5 detector comparto termostatizzato registratore. detector precolonna colonna (fase fissa) Giorgio Bonaga injector solvente A pompa reciprocante filtro solvente B camera di miscelazione (fase mobile )

6 detector comparto termostatizzato registratore. valvola dosatrice filtro detector solvente Asolvente B precolonna colonna (fase fissa) camera di miscelazione (fase mobile ) Giorgio Bonaga pompa reciprocante injector

7 LE VARIABILI DELLA LC Nella cromatografia liquida, analogamente alle altre tecniche analitiche, si deve operare una scelta delle variabili del sistema, sulla base delle caratteristiche del campione da analizzare. Nella LC le variabili sono: 1. SERBATOI DEL SOLVENTE 2. POMPE (pneumatiche, a siringa, reciprocanti) E VALVOLE DOSATRICI 3. SISTEMI DI INIEZIONE (con setto, a valvola) 4. COLONNE E FASI STAZIONARIE 5. RIVELATORI (RID, UV, FD, ED) 6. TECNICHE DI SEPARAZIONE LC (LSC, LLC, RPC, SEC, IEC) Gli argomenti verranno trattati in riferimento alla cromatografia liquida tradizionale, perché gli ultimi sviluppi di questa tecnica (detti Fast LC, e Extreme LC) verranno illustrati separatamente. Giorgio Bonaga

8 1. SERBATOI DEI SOLVENTI Sono contenitori della capacità di 500 ml od anche maggiore. Per evitare la dissoluzione dei gas (N 2 e O 2 ) nei solventi che, formando delle bolle, può disturbare (rumore di fondo) il sistema di rivelazione dei soluti, ma danneggiare anche il rivelatore (RID), è buona pratica degasare i solventi: per riscaldamento dei serbatoi che li contengono e utilizzando eventualmente una pompa da vuoto per eliminare i gas; facendo gorgogliare nei solventi un gas inerte a bassa solubilità (Ar); I cromatografi HPLC attuali non dispongono del sistema di degasamento dei solventi perché liniettore, la precolonna e la colonna sono sotto alte pressioni (anche oltre le 1000 atm). Unaltra precauzione è la filtrazione dei solventi per trattenere particelle sospese di cui anche i solventi più puri sono contaminati. Tra i serbatoi dei solventi e la pompa si dispongono dei filtri di acciaio sinterizzato (trattato per ridurre al minimo la porosità) con pori di circa 1 m, che vanno settimanalmente ripuliti in un bagno di ultrasuoni. Giorgio Bonaga

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10 2. POMPE E VALVOLE DOSARICI a. POMPE Le pompe impiegate nei cromatografi HPLC devono soddisfare alcuni requisiti: 1. il flusso del sovente deve essere costante, non pulsato, per evitare un segnale di fondo del rivelatore (RID e ED, in misura molto minore anche FD e DAD) non riproducibile. Anche la pressione applicata non deve fluttuare. I flussi comuni sono compresi nellintervallo 1,0-2,0 ml/min; 2. il sistema deve poter operare anche a pressioni molto alte (fino a psi, pari a oltre 1000 atm), per consentire lutilizzazione di colonne da LC molto lunghe (fino a 100 cm); 3. le pompe non devono produrre un segnale di fondo apprezzabile; 4. il materiale della pompa deve essere chimicamente inerte; 5. le pompe devono essere di uso semplice. Giorgio Bonaga

11 POMPA PNEUMATICA Il solvente si trova in una camera, separato dal gas di spinta da un pistone mobile. Laumento della pressione del gas di spinta produce la compressione del solvente da parte del pistone e la sua immissione nel circuito della fase mobile. Queste pompe garantiscono un flusso costante, regolato dalla pressione del gas di spinta, ma la pressione costante è anche un parametro invariabile e dunque un limite. Un secondo limite è rappresentato dalla necessità di riempimento periodico della camera del solvente. gas di spinta camera del solvente pistone Giorgio Bonaga

12 POMPA A SIRINGA Un motore asincrono aziona una vite senza fine, la vite muove un pistone che comprime il cilindro della fase mobile. uscita solvente riserva solvente motore sincrono avanzamento manuale leva di blocco motore sincrono Giorgio Bonaga

13 valvola unidirezionale flusso totale camma POMPA ALTERNATIVA RECIPROCANTE È laccoppiamento a 180° di due pompe a pistone comandate dalla stessa camma, in modo da ridurre al minimo il flusso pulsato ( flusso smorzato ). Le valvole a flusso unidirezionale consentono il caricamento delle camere del solvente e il loro svuotamento in modo alternato, in modo da ottenere un flusso di solvente quasi costante. ingresso solvente Giorgio Bonaga

14 VALVOLA DI FLUSSO UNIDIREZIONALE

15 Giorgio Bonaga

16 pompa B pompa A Giorgio Bonaga flusso smorzato

17 %A %B %C Flow Rate Pressure (H 2 O) (MeOH) (ml/min) (atm.) Ready pompa ternaria dai serbatoi del solvente al detector alla colonna smorzatore di impulsi allinjector caricamento iniezione rheodyne injector colonna Giorgio Bonaga

18 b. VALVOLE DOSATRICI MISCELAZIONE AD ALTA PRESSIONE Si impiega una pompa reciprocante per ogni solvente, con il controllo elettronico del numero di impulsi in funzione della composizione della fase mobile. La mandata della pompa è collegata alla camera di miscelazione. MISCELAZIONE A BASSA PRESSIONE I serbatoi dei solventi sono collegati a valvole dosatrici a tempo che prelevano i solventi e li immettono nella camera di miscelazione. Dalla camera di miscelazione la fase mobile viene inviata ad ununica pompa reciprocante che ne determina il flusso (il minore volume morto consente la regolazione fine del gradiente). valvola dosatrice Giorgio Bonaga

19 3. SISTEMI DI INIEZIONE LC Nella HPLC liniettore è un sistema delicato, perché deve consentire di portare il campione liquido dalla pressione atmosferica alla pressione più comune in testa alla colonna, pari a circa 1500 psi (100 atm), senza alterare il flusso della fase mobile. I principali sistemi di iniezione sono: 1. iniettore dinamico provvisto di setto 2. iniettore a valvola 1. INIETTORE DINAMICO È dotato di un setto elastico (di silicone, ma di piccolo diametro) che viene forato dalla microsiringa, il cui ago alloggia in un tubo nel quale viene a contatto diretto con la fase mobile, che trascina i soluti in testa alla colonna. Giorgio Bonaga

20 fase mobile setto colonna pulizia del setto INIETTORE DINAMICO CON SETTO Giorgio Bonaga

21 2. INIETTORE A VALVOLA ( microsample injector valve ) Consente lintroduzione del campione senza interruzioni significative di flusso. È dotato di tubi capillari di acciaio montati su un disco metallico rotante su un perno. Limmissione del campione in colonna avviene in due fasi: a) CARICAMENTO il campione viene introdotto con un una siringa in un capillare ( sample loop ) a volume tarato (10, 20, 50, 100 l ) non inserito nel circuito della fase mobile e collegato al capillare di spurgo. b) INIEZIONE quando il campione iniettato emerge dal capillare di spurgo, si ruota la valvola e i collegamenti dei capillari cambiano: il sample loop entra in serie con il circuito della fase mobile e il campione che lo riempe viene spinto nella colonna senza interruzione del flusso della fase mobile. Il volume di campione iniettato non dipende dal volume della siringa, ma dal volume del sample loop. Giorgio Bonaga

22 INIETTORE A VALVOLA a) CARICAMENTO (4-3/ ) scarico campione fase mobile sample loop Giorgio Bonaga scarico campione fase mobile sample loop b) INIEZIONE (1-6/ ) colonna

23 VALVOLA CAMPIONATRICE ( Microsample Injector Valve ) scarico caricamento del campione fase mobile alla colonna loop del campione Giorgio Bonaga scarico iniezione del campione alla colonna fase mobile loop del campione

24 RHEODYNE INJECTOR Giorgio Bonaga

25 Colonna HPLC in acciaio: 250 mm x 4,6 mm i.d. Colonna LC in vetro: 1000 mm x 50 mm i.d. TIPO DI COLONNA LUNGHEZZA (mm) DIAMETRO INTERNO (mm) FLUSSO DI LAVORO (ml/min) capillare1500,320,001 microbore1501,00,02 analitica2504,60,5 semipreparativa250105,0 preparativa ,0 4. COLONNE E FASI STAZIONARIE Le fasi stazionarie verranno dettagliatamente trattate in associazione con le tecniche di separazione LC. Giorgio Bonaga

26 COLONNA E FASELC CLASSICAHPLC COLONNA Lunghezza (mm) Diametro interno (mm) (analitica) 4,6 (analitica) FASE STAZIONARIA Forma Dimensione ( m) Tipo Strato pellicolare ( m) regolare 150 a corpo poroso - regolare pellicolare 1-2 irregolare 3-60 a corpo poroso m Giorgio Bonaga m 40 m strato: 2 m 10 m strato: 1 m 150 m

27 Giorgio Bonaga particella regolare di silice porosa

28 5. RIVELATORI PER LC Si distinguono in: 1.Bulk property detectors ( BPD ): sono quelli sensibili a proprietà specifiche dellinsieme soluto/solvente (RID) 2.Solute property detectors ( SPD ): sono quelli sensibili a proprietà specifiche soltanto del soluto (FD, UVD, ED) 1. Il segnale S di un bulk property detector è proporzionale al flusso di massa del soluto ( m/t ) e dipende da una costante k m caratteristica del rivelatore: Moltiplicando numeratore e denominatore per il volume V di fase mobile: S = k m m t Ma m/V = C (concentrazione del soluto) e V/t = F (flusso della fase mobile), pertanto: V. t S = k m m. V S = k m C. F Giorgio Bonaga

29 Il segnale in uscita è proporzionale al prodotto della concentrazione del soluto per il flusso della fase mobile che, proprio per questo motivo, deve essere mantenuto costante. A flusso costante larea del picco cromatografico (approssimata allarea del triangolo di base = t e altezza = S ) è: cioè proporzionale alla quantità assoluta del soluto. 2. Il segnale S di un solute property detector è proporzionale alla concentrazione ( m/V ) e dipende da una costante k c caratteristica del rivelatore: S = k c m V Moltiplicando numeratore e denominatore per t : V. t S = k c t. m A = k m. m. m 1 2 Giorgio Bonaga

30 Larea del picco cromatografico (approssimata allarea del triangolo di base = t e altezza = S ) è: Ma t/V = 1/F (reciproco del flusso della fase mobile), pertanto: F. t S = k c 1. m1. m cioè inversamente proporzionale al flusso della fase mobile. m F altezza del picco proporzionale al flusso della fase mobile BPD area del picco indipendente dal flusso della fase mobile altezza del picco indipendente dal flusso della fase mobile SPD area del picco inversamente proporzionale al flusso della fase mobile S. t = 2 A = k c m F A = k c. 1 2 Giorgio Bonaga

31 CARATTERISTICHE IDEALI DEI RIVELATORI PER LC Il detector ideale dovrebbe avere le seguenti caratteristiche: 1.minima deriva della linea di base ( drifting ) 2.minimo rumore di fondo ( noise ) 3.elevata selettività, sensibilità e riproducibilità 4.risposta rapida, come tutti i rivelatori on line 5.ampio range dinamico: R= k. C (10 5 ) 6.minimo volume morto della cella a flusso per evitare lallargamento dei picchi 7.non produrre il rimescolamento dei soluti nella cella a flusso 8.non essere sensibile alla variazione di composizione della fase mobile (cioè deve consentire leluizione a gradiente), alla temperatura e al flusso della fase mobile 9.non essere distruttivo rumore di fondo deriva Giorgio Bonaga

32 CELLE A FLUSSO È un componente critico della strumentazione HPLC perché deve possedere un volume morto molto piccolo, dal momento che il volume determina lampiezza della base del picco del soluto in termini di tempo. Pertanto, per separare due soluti occorre che essi abbiano tempi di ritenzione almeno uguali al tempo necessario perché fluisca dalla cella il volume occupato dal soluto che eluisce per primo. Cella di tipo Z la lunghezza è al massimo di 10 mm (1000 m) e il diametro del cilindro da 10 a 16 m, per un volume morto molto piccolo, pari a 3-8 l. Il percorso della fase mobile è lungo la direzione del raggio luminoso. Cella conica nelleluizione a gradiente, la variazione della composizione della fase mobile determina una sensibile variazione dellindice di rifrazione (RI), indipendentemente dalla presenza di soluti nella fase mobile. La cella conica ha una sezione che si allarga nella direzione del fascio luminoso, trasformando il gradiente di indice di rifrazione in una lente liquida convessa (convergente) che riallinea il fascio luminoso. Giorgio Bonaga

33 CELLA A FLUSSO TIPO Z Z type cell CELLA A FLUSSO CONICA tapered type cell lente di quarzo entrata fase mobile uscita fase mobile lente liquida poliammide corpo di Al Giorgio Bonaga sorgente

34 tV c < t R B tV c > t R B A B AB AB EFFETTI DELLA DIMENSIONE DELLA CELLA A FLUSSO SULLA RIVELAZIONE DEI SOLUTI BB Giorgio Bonaga

35 RIVELATORE A INDICE DI RIFRAZIONE (RID) L'indice di rifrazione di un materiale è un parametro macroscopico, solitamente indicato col simbolo n, che rappresenta il fattore numerico (vettore donda) per effetto del quale la velocità di propagazione di una radiazione elettromagnetica (luce) viene rallentata, rispetto alla sua velocità nel vuoto, quando attraversa il materiale. raggio incidente raggio riflesso ( = ) raggio rifratto aria: n 1 = 1 vetro: n 2 = 1,5 Giorgio Bonaga

36 TEORIA CORPUSCOLARE: variazione della velocità dei fotoni (Newton) LA VELOCITA DELLA LUCE E MAGGIORE NEI MEZZI PIU RIFRANGENTI fotone

37 Giorgio Bonaga TEORIA ONDULATORIA: variazione della velocità dellonda nelle due fasi LA VELOCITA DELLA LUCE E MAGGIORE NEI MEZZI MENO RIFRANGENTI A B

38 Dalle equazioni di Maxwell si può scrivere che: n = c/v dove: n = indice di rifrazione c = velocità della luce v = velocità di fase Si può verificare che nellaria (dove v = c) : n = 1 Dall equazione di Maxwell si ottiene la Legge di Snell: sin. n 1 = sin. n 2 (sin /sin = n 2 /n 1 ) Se, ad es., langolo di incidenza ( ) del raggio di luce su una superficie di vetro è di 40°, langolo del raggio rifratto ( ) è: sin 40°. 1,0 = sin. 1,5 = 25,018° (http://ww2.unime.it/weblab/ita/RefractionOfLight/lightrefract_ita.htm) Giorgio Bonaga

39 MATERIALERI Vuoto1,00000 Aria (760 mm/Hg)1,00029 Ghiaccio1,31 Acqua (20° C)1,33 Acetone1,36 Alcol etilico1,36 Soluzione zuccherina (30%)1,38 Quarzo fuso1,46 Glicerina1,47 Soluzione zuccherina (80%)1,49 Vetro crown1,52 Cloruro si sodio1,54 Disolfuro di carbonio1,63 Ioduro di metilene1,74 SOLUZIONERI H 2 O (100)1,330 H 2 O: EtOH (75:25)1,337 H 2 O: EtOH (50:50)1,345 H 2 O: EtOH (25:75)1,352 EtOH (100)1.360

40 Il RID interferenziale misura in continuo la differenza di indice di rifrazione tra la la fase mobile pura e la fase mobile che contiene i soluti. Il fascio prodotto da una sorgente di radiazione visibile viene diviso in due raggi rifratti da un prisma polarizzatore; i due raggi attraversano due celle a flusso contenenti solo la fase mobile pura. Alluscita dalle celle i due raggi vengono ricomposti da un prisma ricompositore del fascio e collimati su un fotomoltiplicatore che misura lintensità della radiazione (linea di base). Quando la fase mobile trasporta un soluto si avrà una variazione dellindice di rifrazione ( minore o maggiore ) a cui corrisponderà una variazione ( diminuzione o aumento ) della velocità della luce del raggio che attraversa la cella del campione. Questa modificazione produrrà uno sfasamento dei due raggi, tanto maggiore quanto maggiore è la differenza dellindice di rifrazione. Nella ricombinazione dei due raggi sfasati si ha uninterferenza distruttiva proporzionale alla differenza di velocità, cioè alla concentrazione del soluto. La riduzione di intensità viene misurata dal fotomoltiplicatore ed inviata al registratore che la traduce in un picco. Il rifrattometro richiede la termostatizzazione della fase mobile, perché lindice di rifrazione dipende dalla temperatura e le variazioni di temperatura produrrebbero la deriva della linea di base. Il rifrattometro è anche incompatibile con una eluizione a gradiente, perché la variazione della composizione della fase mobile produce delle grandi variazioni dellindice di rifrazione. Giorgio Bonaga

41 campione fase mobile prisma polarizzatore del fascio prisma ricompositore del fascio Sorgente VIS lente fotomoltiplicatore registratore RIFRATTOMETRO INTERFERENZIALE Giorgio Bonaga picchi positivi: aumento dellindice di rifrazione per effetto di soluti con indici di rifrazione maggiori di quello della fase mobile picchi negativi: diminuzione dellindice di rifrazione per effetto di soluti con indici di rifrazione minori di quello della fase mobile

42 HPLC DI ZUCCHERI E POLIALCOLI CON RIVELATORE RIFRATTOMETRICO Giorgio Bonaga iniezione 0 7,5 15 min saccarosio glucosio galattosio fruttosio mannitolo sorbitolo

43 RIVELATORE A FLUORESCENZA (FD) La fluorescenza è la proprietà di alcune sostanze eccitate da una radiazione di una certa energia (o ) di emettere radiazioni di energia inferiore (cioè di più elevata). E E0E0 E1E1 E2E ASSORBIMENTO MOLECOLARE RILASSAMENTO NON RADIOATTIVO RILASSAMENTO DI FLUORESCENZA rilassamento vibrazionale conversione interna banda 1banda 2 Giorgio Bonaga

44 Per tutte le molecole si può definire il rendimento quantico di fluorescenza ( ): = RfRf R f + R nr con: R f = velocità di rilassamento flurescente R nr = velocità di rilassamento non radioattivo Per la maggior parte delle molecole R nr >> R f per cui 0 Alcune sostanze danno luogo a fluorescenza naturale, ma è possibile formare derivati altamente fluorescenti mediante reazioni di derivatizzazione, prima dellintroduzione nel cromatografo. Tra i numerosi reagenti è molto comune il dansil-cloruro nellanalisi di ammine e amminoacidi. Cl H Giorgio Bonaga

45 SOSTANZE NATURALMENTE FLUOSCENTI sostanzaformula (nm) eccitazione emissione intensità relativa benzene C6H6C6H (rifer.) toluene C 6 H 5 - CH propilbenzene C 6 H 5 - C 3 H fluorobenzene C 6 H 5 - F clorobenzene C 6 H 5 - Cl bromobenzene C 6 H 5 - Br iodobenzene C 6 H 5 - I - 0 fenolo C 6 H 5 - OH ione fenato C 6 H 5 – O anisolo C 6 H 5 - OCH anilina C 6 H 5 - NH ione anilinio C 6 H NH acido benzoico C 6 H 5 - COOH benzonitrile C 6 H 5 - CN nitrobenzene C 6 H 5 - NO Giorgio Bonaga

46 eccitazione (nm) emissione (nm) intensità di fluorescenza È intuitivo che lo spettro di eccitazione (lunghezze donda delle radiazioni assorbite) delle sostanze fluorescenti è circa uguale al loro spettro di emissione (lunghezze donda delle radiazioni fluorescenti) Giorgio Bonaga

47 I fluorimetri misurano la fluorescenza dei soluti presenti nella fase mobile che sono attivi a questo rilassamento. Il fluorimetro a semisfera riflettente raccoglie la metà della radiazione di fluorescenza emessa in un semispazio e dunque eleva notevolmente la sensibilità strumentale. Esso prevede un primo sistema ottico costituito da una sorgente (a deuterio) che emette delle radiazioni collimate e focalizzate su una combinazione di filtri. I filtri selezionano la della radiazione di eccitazione che viene focalizzata sulla cella a flusso. Le radiazioni di fluorescenza che vengono emesse vengono raccolte da una semisfera riflettente che le invia ad un secondo sistema ottico i cui filtri hanno il compito di selezionare la di emissione, trasformarla con il fotomoltiplicatore in un segnale la cui intensità è proporzionale alla concentrazione del soluto che lha prodotta ed infine, per mezzo di un registratore, in un picco. Il FD è ovviamente un rivelatore selettivo per soluti fluorescenti o capaci di fissare un gruppo che li rende fluorescenti. Ha una sensibilità dellordine di g/ml (dunque particolarmente idoneo allanalisi di soluti presenti in tracce) e un range dinamico lineare effettivo di circa 10 3 (inferiore e quello teorico per effetto dello spegnimento della fluorescenza a causa di decadimenti non radiattivi o quenching ). Giorgio Bonaga

48 IN semisfera riflettente cella a flusso (5 l) OUT sorgente (D) I° sistema ottico eccitazione ) II° sistema ottico emissione ) fotomoltiplicatore RIVELATORE A FLUORESCENZA Giorgio Bonaga

49 I0I0 I b, C RIVELATORE AD ASSORBIMENTO UV-VIS (UVD) Le radiazioni elettromagnetiche di specifiche che colpiscono le molecole trasferiscono energia ai loro gruppi funzionali (se cromofori ) con eccitazioni elettroniche della configurazione elettronica (passaggio dallo stato fondamentale allo stato eccitato). Lassorbimento di parte dellenergia produce dunque una diminuzione dellintensità della radiazione incidente. Lassorbimento delle radiazioni UV-VIS (VIS = nm; UV = nm; UV lontano = < 210 nm) è molto utilizzato nella HPLC di molecole organiche, proprio per la particolare configurazione elettronica dei loro gruppi funzionali.

50 Questa proprietà, detta assorbanza, è governata dalla Legge di Lambert-Beer (una legge limite, valida solo per soluzioni diluite, con C < 0,01 mol/l). dove: A = assorbanza I 0 = intensità della radiazione incidente I = intensità della radiazione trasmessa = assorbività molare (costante di ogni sostanza) b = cammino ottico della cella di misura (cm) C = concentrazione molare della sostanza = log = b C I0I0 I Giorgio Bonaga

51 Naturalmente solo le sostanze contenenti dei gruppi funzionali cromofori assorbono dellle caratteristiche del gruppo, con assorbività molari note. gruppo funzionalecromoforo (nm) aldeide- CHO210, ; ammina- NH aromatico: antracene benzene bifenile naftalene piridina C6H6C6H6 252; ; 202; ; 275; ; 195; ; 6900; ; 4000; 3500 azide- C=N azo- N=N bromuro- Br carbossilico- COOH chetone- C=O195; ; disolfuro- S-S -194; ; 400 estere- COOR20550 etere- O Giorgio Bonaga

52 insaturazione: alifatica aliciclica insaturazione coniugata - (C=C) 3 – - (C=C) (C=C) insaturazione isolata: doppio legame triplo legame - C=C – - C C ioduri- I nitrato- ONO nitrile- C=N160- nitrito- ONO ; ; 10 nitro- NO 2 210forte nitroso- NO ossima- NOH solfone- SO solfossido- S - O tiochetone- C=S205forte tioetere- S -194; ; 1600 tiolo- SH Giorgio Bonaga

53 Per ottenere il risultato analitico è essenziale che le sostanze analizzate forniscano un assorbimento sufficiente e che i solventi impiegati come fase mobile non assorbano una quantità rilevante della radiazione UV utilizzata. È pertanto utile conoscere le di cut-off dei principali solventi, ovvero la alla quale un solvente è trasparente solo per il 10% e per questo impedirebbe di misurare gli assorbimenti dei soluti. solvente di cut off solvente di cut off acetato di etile244eptano200 acetone330esano200 acetonitrile190etere dietilico220 benzene280metanolo205 butan-2-olo260metil- i butilchetone335 carbonio tetracloruro265pentano200 carbonio dicloruro235piridina330 cloroformio245propan-1-olo210 cicloesano200tetraidrofurano210 dimetilsolfossido270toluene285 diossano215 o -Xilene285 Giorgio Bonaga

54 I rivelatori UV utilizzati in HPLC possono essere a lunghezza donda fissa o a lunghezza donda variabile. I primi sono dotati di una lampada a vapori di mercurio che emette unintensa radiazione a 254 nm, ma non possono essere utilizzati per rivelare sostanze che assorbono a < 254 nm ed hanno anche ridotta sensibilità. I secondi possono registrare lo spettro completo di assorbimento UV di qualsiasi soluto. Attualmente il più diffuso è il DAD ( Diode Array Detector ). Nel rivelatore a striscia di diodi (DAD), la sorgente VIS è una lampada alogena di tungsteno ( nm) e la sorgente UV è una lampada ad arco di deuterio ( nm). Il fascio di luce policromatica, focalizzata da lenti acromatiche e da un filtro di olmio, attraversa la cella a flusso, preferibilmente conica per evitare le variazioni dellindice di rifrazione della fase mobile nel caso di eluizione a gradiente. Il fascio di luce emergente viene focalizzato da una fenditura su un reticolo monocromatore che disperde la luce su una serie di fotodiodi (fino a 1024, per un range di = ) collocati lungo una striscia ( diode array ). Ciascun fotodiodo misura lintensità del segnale ad una certa ed è collegato con un calcolatore che memorizza, istante per istante, tutti i segnali di assorbanza forniti dai sensori della striscia di fotodiodi. Il DAD, dunque, fornisce lo spettro UV-VIS completo dei soluti che eluiscono dalla colonna. Giorgio Bonaga

55 campione UV (D) lenti acromatiche RIVELATORE A STRISCIA DI DIODI (DAD = Diode Array Detector ) VIS (Tg) filtro di olmio fenditura reticolo monocromatore Giorgio Bonaga striscia di fotodiodi ( diode array )

56 ABS AUFS RunTime EndTime min 10.0 min Ready Giorgio Bonaga

57 ABS AUFS RunTime EndTime min 10.0 min Ready Giorgio Bonaga tiammina solventi

58 Giorgio Bonaga

59 RIVELATORE ELETTROCHIMICO (ED) I rivelatori elettrochimici (amperometrici, polarografici, coulombometrici) sono utilizzati nella rivelazione di soluzioni ioniche o si soluzioni di elettroliti, cioè soluti presenti in forma ionica e suscettibili di essere ossidati o ridotti con facilità. 1. Rivelatore conducimetrico : misura la conduttanza ( = 1/R, in Siemens) di soluzioni ioniche, direttamente proporzionale alla mobilità degli ioni in soluzione; 2. Rivelatore amperometrico: misura l intensità ( I = V/R, in Ampère) della corrente prodotta dalle reazioni di ossidazione o dalla reazioni di riduzione di soluzioni di elettroliti, direttamente proporzionale alla concentrazione dei soluti.. Durante le ossidazioni gli elettroni vengono trasferiti dal soluto allelettrodo, durante le reazioni di riduzione gli elettroni si trasferiscono dallelettrodo al soluto. Giorgio Bonaga e HCOO - ++ __ e Na + AMPEROMETRIA CONDUCIMETRIA Ox Red

60 I rivelatori amperometrici, i più diffusi tra i rivelatori elettrochimici, si basano sul potenziale di un elettrodo di lavoro rispetto il potenziale di un elettrodo di riferimento. Si ha un passaggio di corrente quando dalla colonna eluisce una specie chimica che, depolarizzando lelettrodo rispetto il potenziale impostato, rende possibile il processo di elettrolisi, di cui si misura lintensità (I) della corrente prodotta. Il rivelatore elettrochimico amperometrico è costituito da 3 elettrodi ( wall jet detector ): un elettrodo di riferimento (RE = reference electrode ), un elettrodo di lavoro di platino o di grafite (WE = work electrode ) e un elettrodo ausiliario (CE = counter electrode ). Si impone una d.d.p. tra WE e CE in modo che si possa determinare lintensità della corrente prodotta dalla reazione red-ox di elettrolisi. La reazione red- ox dei soluti avviene ad un potenziale che permette, tramite un circuito potenziostatico, di mantenere costante il potenziale dellelettrodo WE. Lelettrodo di riferimento serve a mantenere ad un valore prestabilito il potenziale dellelettrodo WE. La fase mobile con i soluti lambisce lelettrodo WE e si disperde radialmente. Lintensità della corrente di idrolisi è il segnale che produce il picco proporzionale alla concentrazione del soluto. La purezza dei solventi è molto importante perché la presenza di ossigeno, contaminanti metallici e alogeni può innalzare sensibilmente il disturbo di fondo e la deriva della linea di base. Giorgio Bonaga

61 RIVELATORE ELETTROCHIMICO (AMPEROMETRICO) elettrodo ausiliario (CE) elettrodo di lavoro (WE) elettrodo di riferimento (RE) IN OUT filo di platino e pasta di grafite Giorgio Bonaga

62 SOSTANZE SENSIBILI ALL ED OSSIDAZIONERIDUZIONE ammine composti eterociclici diammine aromatiche diidrossiderivati fenoli idroperossidi mercaptani ossime perossidi purine acidi aldeidi chetoni composti aromatici alogenati composti eterociclici doppi legami coniugati esteri nitrili coniugati nitrocomposti ossime André-Marie Ampère Giorgio Bonaga

63

64 RIVELATORE A LUCE DIFFUSA IN EVAPORAZIONE ( Evaporative Light Scattering Detector = ELS) Leluato dalla colonna attraversa un nebulizzatore nel quale viene trasformato in un aerosol da un flusso di azoto o di aria. In un tubo termostatato avviene levaporazione del solvente e la formazione di una nube di soluto. Questa nube particellare viene attraversata da un raggio laser posto ortogonalmente e la diffusione della luce prodotta dai soluti viene rivelata da un fotodiodo al silicio. Giorgio Bonaga

65 N 2 o aria colonna nebulizzatore camera di nebulizzazione sifone sorgente laser tubo di evaporazione (termostatato) luce diffusa fotodiodo (silicio) Giorgio Bonaga

66 RIVELATORE GRANDEZZA MISURATA SPECIFICITA LOD (*) (grammi) RANGE DINAMICO LINEARE ad indice di rifrazioneindice di rifrazioneuniversale a fluorescenzafluorescenzaselettivo ad assorbimento UV-VISassorbanzaselettivo elettrochimico (amperometro)conduttanzaselettivo evaporative light scatteringluce diffusauniversale spettrometro di massamassa/caricauniversale PRESTAZIONI DEI RIVELATORI HPLC ( * ) LOD = limit of detection (diverso da: LOQ = limit of quantification ) Giorgio Bonaga


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