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Cofactor engineering Microbiologia industriale II Metabolic Engineering (2002), 4: 182-192 Metabolic Engineering (2002), 4: 217-229 Metabolic Engineering.

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Presentazione sul tema: "Cofactor engineering Microbiologia industriale II Metabolic Engineering (2002), 4: 182-192 Metabolic Engineering (2002), 4: 217-229 Metabolic Engineering."— Transcript della presentazione:

1 Cofactor engineering Microbiologia industriale II Metabolic Engineering (2002), 4: Metabolic Engineering (2002), 4: Metabolic Engineering (2003), 5: 49-55

2 Approccio usuale ingegneria metabolica Ottenere laumento della produttività manipolando loutput di alcuni pathways metabolici Alterazione dei livelli enzimatici –amplificazione, delezione o introduzione di geni Tuttora difficile considerare le dinamiche integrate e le strutture di controllo globali

3 I.M. Nutrienti per biosintesi Anabolismo Macromolecole Energia per biosintesi Catabolismo Energia per trasporto nutrienti Sostanze di scarto, prodotti di fermentazione accettori di elettroni ridotti Chemicals, energia luminosa

4 CatabolismoAnabolismo substrato CO2 Biomassa ATP

5 CatabolismoAnabolismo substrato scarti biomassa ADP ATP NAD* NADH intermedi Il catabolismo porta intermedi, equivalenti riducenti e energia allanabolismo, che produce biomassa

6 Definizione di un cofattore: molecola che partecipa alla reazione la sua struttura non è direttamente coinvolta nella formazione del prodotto non viene consumata passa da uno stato allaltro.

7 La quantità di cofattore presente allinterno della cellula è limitata : lesempio del NAD(H/+) il NAD(H/+) è coinvolto in più di 300 reazioni metaboliche di ossidoriduzione nel catabolismo, una fonte di carbonio viene ossidata e si produce NADH in Escherichia coli la quantità di NAD(H/ + ) si stima attorno alle 10 moli per grammo di peso secco necessità di rigenerazione: mantenere il bilancio redox

8 Importanza del bilanciamento redox sul metabolismo globale Per ottenere 100 g biomassa calcolo le necessità biosintetiche (lievito in anaerobiosi): 669 mmoli Glucosio, 648 NADPH 1102 NADH 648/12=54 Glu Formazione di glicerolo: 551 Glu 551/1274 mmoli di glucosio anabolico sono spese per bilanciamento redox: si tratta del 43%!!

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10 Se una reazione richiede cofattori, il processo globale dovrebbe risentire della disponibilità e della proporzione in forma attiva del cofattore. LA MANIPOLAZIONE DEI COFATTORI DIVENTA CRUCIALE PER INCREMENTARE IL PROCESSO

11 Come manipolare i cofattori? Ci sono vari esempi di manipolazione dei cofattori in generale, due strategie –manipolazione delle condizioni di crescita –modifiche genetiche

12 Metabolismo centrale anaerobico in E. coli

13 Influenza della fonte di carbonio Gluconato Gluconato (+1)Glucosio Sorbitolo (-1) Gluconato-6-PGlucosio-6-P Fruttosio-6-P Fruttosio-1,6-diP Gliceraldeide 3P Sorbitolo-1-P Piruvato NAD +NADH PEP Piruvato ATP ADP ATP ADP PEP Piruvato NAD +NADH

14 Chemostati anaerobici cambiano rapporti NADH/NAD + ; EtOH/acetato. Ridistribuzione metabolica

15 Modificazioni genetiche RICICLO SINTESI DE NOVO -

16 Incremento quantità NAD(H/+) multicopia mutato

17 Introduzione di una FDH NAD- dipendente (C. boidinii) Piruvato Acetil-CoA Formico CO 2 H2H2H2H2 NADH FDH1 PDH PFL FDHF NADH Pathway originale NAD indipendente (FDHF formico deidrogenasi, NAD indipendente) Nuovo pathway NAD dipendente (FDH1 formico deidrogenasi, NAD dipendente) Pathway aerobico NAD dipendente (PDH piruvato deidrogenasi)

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19 Anaerobiosi Effetto della presenza di una nuova FDH –aumento OD, consumo glucosio, etanolo, succinato –diminuiscono lattato e acetato: et/ac aumenta fino a 36 volte Differenze tra wt e nuova –aumentano consumo glucosio, OD, etanolo e succinato –calano acetato e lattato La nuova sembra competere con la vecchia: comportamento simile se ha solo eterologa o entrambe

20 Drastico cambiamento metabolico Deciso aumento NADH disponibile (raddoppia) Sono favoriti i prodotti ridotti, specialmente quelli che richiedono 2 NADH Etanolo diviene il maggior prodotto, 91% dei metaboliti prodotti Risultati simili si sono ottenuti clonando i geni di Zymomonas mobilis, ma qui non si è overespresso nessun enzima del pathway per letanolo

21 Incremento disponibilità NADH: caratterizzazione in aerobiosi Si induce produzione di etanolo, lattato, succinato, a differenza che nel wild type Ambiente più riducente, per bilancio redox si producono anche prodotti di fermentazione. La quantità di prodotti non spiega tutto il formato che sparisce: parte del NADH viene respirato.

22 Addizione acido formico in lievito Aumenta la disponibilità di NADH citoplasmatico Incremento della biomassa ceppo dipendente Produzione di etanolo!

23 Incremento quantità NAD(H) in lievito

24 Aumento produzione riboflavina Energia di mantenimento: la quantità di ATP che un microorganismo consuma per rimanere vitale e attivo, senza crescere. Produzione di riboflavina in Bacillus subtilis: –il pathway biosintetico è stato oggetto di molti studi e migliorie (operoni multipli derepressi) –la produzione sembra associata allefficiente produzione di energia e a un basso metabolismo di mantenimento.

25 La catena respiratoria ramificata di B. subtilis Ramo del citocromo c Ramo della quinolo ossidasi NADH Mena quinone Cit c aa3 ossidasi (qoxA-D) caa3 ossidasi (ctaC-F) bc ossidasi (qcrABC) YthAB (ythAB) bd ossidasi (cydAB) NDH-II (YilD) O2O2 H2OH2O 2H+/e 1H+/e ?H+/e 2H+/e 0H+/e

26 Strategia In dipendenza dalla composizione della catena respiratoria, per ogni elettrone trasportato sono traslocati tra 1 e 4 protoni La composizione è modulata dalle condizioni colturali La catena dei Bacilli interessanti industrialmente opera ben al di sotto del massimo valore teorico REINDIRIZZARE IL FLUSSO DI ELETTRONI VERSO LA VIA PIU EFFICIENTE

27 Maintenance e produzione 0.67 mmol gluc/ gDW/h 0.39 mmol gluc/ gDW/h Dopo 48 h: incremento del 30% nella produzione di riboflavina

28 Produzione di Isoamil acetato: alterazioni nella disponibilità del CoA Sintesi non naturale per E. coli Trasformato con gene AAT: alcol acetiltrasferasi Aggiunta esterna di alcol isoamilico Competizione per acetilCoA con le produzioni naturali EtOH e AcOH

29 Biosintesi CoA Oversepressione di PanK (Pantotenato kinasi), enzima limitante: aumenta tra il 125 e il 150% la concentrazione di CoA

30 Produzione di isoamilacetato I flussi metabolici restano essenzialmente imperturbati, ma aggiungendo isoamilico si ottiene un buon incremento nella produzione di di isoamilacetato

31 Concludendo Le manipolazioni dei pool/flussi dei cofattori sono possibili con mezzi fisiologici e genetici, e possono fornire un ulteriore mezzo per ottimizzare le applicazioni di ingegneria metabolica, sia da soli che accoppiati a modificazioni metaboliche classiche


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