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Analisi di variabilità genomica: risorse e metodi per l'analisi dei dati Dip.Biochimica e Biologia Molecolare 23-marzo-2006.

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Presentazione sul tema: "Analisi di variabilità genomica: risorse e metodi per l'analisi dei dati Dip.Biochimica e Biologia Molecolare 23-marzo-2006."— Transcript della presentazione:

1 Analisi di variabilità genomica: risorse e metodi per l'analisi dei dati Dip.Biochimica e Biologia Molecolare 23-marzo-2006

2 Variabilità è un termine a cui è associata una enormità di problematiche scientifiche e culturali. In questa lezione verrà posta lenfasi sulla variabilità intra-specie umana (human diversity) Variabilità inter-specie Variabilità intra-specie

3 Variabilità Umana La variabilità umana rappresenta i range di possibili valori associati ad ogni caratteristica misurabile, fisica o mentale, dellessere umano. Le differenze fra tali valori possono essere irrilevanti o significative, transitorie o permanenti, volontarie o involontarie, congenite o acquisite, genetiche o ambientali. Linsieme di tali differenze rendono ognuno dei 6,5 miliardi di individui che popolano il pianeta terrestre diverso da tutti gli altri.

4 Variabilità Genetica La variabilità genetica è determinata dalle mutazioni che rendono due individui diversi. Il Genoma Umano nucleare di due individui è conservato per il 99,9%, il rimanente 0,1% racchiude quelle differenze che rendono i due individui diversi. Studiare tali differenze consente di…

5 …….. –comprendere le cause molecolari delle malattie genetiche –studiare le origini delluomo –studiare le migrazioni delle popolazioni attuali

6 Tali studi sono stati condotti da che si sono scoperte le leggi fondamentali della genetica e quindi dellereditarietà ma lavvento della Genomica ha dato un enorme impulso a tali studi sia per quanto riguarda la quantità di informazioni disponibili che per quanto riguarda laccuratezza delle stesse che oggi consentono di effettuare le analisi ad un livello molto più puntuale.

7 La variabilità genetica deriva dallesistenza delle mutazioni

8 Variabilità Percentuale di siti che mutano rispetto al totale nel confronto pairwise 1.Genoma Umano nucleare: mediamente 0,1%. 2.Genoma Umano mitocondriale: mediamente 0,3%. Variabilità media : n. di siti varianti, rispetto al numero di siti totali costituenti il genoma, osservati in un gruppo di individui 1.Variabilità media nucleare umana: 10MSNPs/3000Msiti*100 = 0,3% (il n. di individui e popolazioni è difficile da stimare)media nucleare 2.Variabilità media mitocondriale :media mitocondriale 3466SNPs/16570siti*100= 21% su 2150 genomi mt umani

9 Mutazione Alterazione della sequenza di DNA causata da –fattori naturali –fattori ambientali

10 Mutazione Mutazioni di singolo nucleotide, delezioni o inserzioni di corti frammenti nucleotidici causano alterazioni in un singolo gene. Mutazioni di grossi frammenti cromosomiali dovuti a delezioni, inserzioni o inversioni sono dette aberrazioni e coinvolgono più geni e quindi proteine.

11 Mutazioni di singolo nucleotide, delezioni o inserzioni di corti frammenti nucleotidici causano alterazioni in un singolo gene. –fattori naturali (errori durante la replicazione : mismatch) –fattori ambientali (modificazioni chimiche dei nucleotidi) Nel caso dei mismatch il sistema di riparo può riconoscere le mutazioni e correggerle, altrimenti le mutazioni si fissano e vengono trasmesse alle progenie.

12 Mutazioni di singolo nucleotide e delezioni o inserzioni di corti frammenti nucleotidici causano alterazioni in un singolo gene. Mutazioni missenso o non sinonima (sostituzione di un nucleotide che cambia un aa in un altro) Mutazioni non senso (sostituzione di un nucleotide che cambia un aa in un codone di STOP) Mutazione sinonima (sostituzione di un nucleotide nellambito della stessa famiglia di codoni) Mutazioni con slittamento causano linserimento o la delezione di piccole stringhe. Può verificarsi in qualsiasi parte del genoma ma sono preferite regioni già ripetute che favoriscono lo scivolamento.

13 Una mutazione può causare lacquisto di una nuova funzione (positiva) o la riduzione o perdita di una funzione (negativa). Una mutazione può manifestarsi in modo più o meno forte Una mutazione può manifestarsi subito o con effetto ritardato. Mutazione costitutiva che sopprime la regolazione su un gene o un gruppo di geni Mutazione leaky …. Comunque una mutazione è un cambio del genotipo che produce variabilità influenzando più o meno il fenotipo.

14 Allele ogni possibile stato associabile ad un locus genico Nel caso del singolo sito di DNA possiamo avere 4 alleli (A,C,G,T) Il numero di alleli possibili in un organismo n-ploide è n

15 Genotipo set di alleli che un individuo presenta su di un locus genico Nel caso del singolo sito di DNA il numero di genotipi possibili per un organismo n-ploide è dato da 4exp(n). Nel caso delluomo potremmo avere 16 genotipi diversi.

16 Polimorfismo presenza su un locus genomico di due o più alleli RFLP : Restriction Fragment Lenghth Polymorphism Microsatelliti: sequenze ripetute in tandem lunghe fino a 150bp, con una unità di 13 bp STS: sequence tagged sites (sequenza lunga da 200 a 500 kb unica nel genoma) SNP : Single Nucleotide Polymorphism

17 Polimorfismo Secondo la definizione classica di polimorfismo lallele più raro dovrebbe avere una frequenza minima pari a 1% Leterozigosità misura il grado di polimorfismo sulla base delle frequenze dei genotipi.

18 APLOTIPO insieme di sequenze relative ad una definita regione genomica riportanti un set di polimorfismi completamente coincidenti rispetto ad un riferimento RiferimentoATGACAGTG Campione # 1AACTGATTA Campione # 2AACTGATTA Campione # 3AACTGATTA Aplotipo A Campione # 4AACTGATTA

19 APLOGRUPPO insieme di APLOTIPI accomunati da un set di siti polimorfici portanti lo stesso allele ereditati dal loro comune ancestore Aplotipo A AACTGATTA Aplotipo B ACCTGTATG Aplotipo C ATCTGATTA Aplotipo D ACCTGGTTT Aplotipo E TACTGATTA I siti marcati con i numeri gialli definiscono laplogruppo

20 tag SNPs e Aplotipi Sono stati mappati 10M SNPs nelle popolazioni umane. Alleli di SNPs associati definiscono laplotipo Gran parte delle regioni cromosomiche sono caratterizzate da aplotipi molto rari (frequenza max 5%). Tali regioni contengono diversi SNPs ma quelli che definiscono lunicità dellaplotipo sono chiamati tag SNPstag SNPs

21 Variabilità Genetica Si ricordano le differenze fra – erditarietà genetica mendeliana (genoma nucleare) – ereditarietà genetica citoplasmatica (genoma mitocondriale) Nellambito del genoma nucleare un ruolo particolare ha il cromosoma Y. Ricordiamo infatti che…

22 …nel genoma nucleare cromosomi differenti segregano indipendentemente durante la meiosi 1.tratti fenotipici (normale o mutante) controllati da geni localizzati su cromosomi differenti segregano indipendentemente 2.tratti fenotipici controllati da geni che segregano insieme con frequenze più alte dellatteso sono associati (linked) 3.a causa della ricombinazione non è detto che geni localizzati sullo stesso cromosoma siano associati 4.lanalisi di linkage fornisce una misura della probabilità che due loci siano associati. 5.il cromosoma Y è presente solo nei maschi e quindi viene ereditato solo per via patrilineare, inoltre il cromosoma Y ha una regione estesa che non ricombina

23 …nel genoma mitocondriale leredità è citoplasmatica e materna:materna il mitocondrio si duplica in interfase nel citoplasma (eredità citoplasmatica) e durante la meiosi è luovo che trasferisce il citoplasma allo zigote (eredità materna) il genoma mitocondriale non ricombina il mitocondrio è presente in copie multiple nel citoplasma e ogni mitocondrio possiede più copie del genoma (allincirca 10 nelluomo) se il genoma mitocondriale subisce delle mutazioni eteroplasmia (% di molecole mutate rispetto al wild-type ) la segregazione delle molecole mutate rispetto al wild type è random o dipende da fattori specifici? (Chinnery et al., Trends in Genetics Volume 16, Issue 11, 1 November 2000, Pages )Trends in Genetics Volume 16, Issue 11

24 Variabilità Genetica Lavvento delle tecniche di sequenziamento prima e della Genomica poi hanno dato un impulso sempre più crescente agli studi di genetica di popolazione e alla comprensione dei meccanismi molecolari associati alle malattie genetiche. Loggetto di osservazione su cui ci si è concentrati ha dimensioni differenti nel caso del genoma nucleare rispetto al genoma mitocondriale. Genoma nucleare SNPs Genoma mitocondriale la sequenza dellintero genoma

25 Genomica Mitocondriale

26 DEAF 1555G MELAS 3243G LHON 3460A MERRF 8344G NARP 8993 G/C LHON 11778A LHON 14484C LHON 14459A 0 / P E ND6 S Q A N OLOL C Y PLPL OHOH T Cyt b ND5 L S H ND4 ND4L R ND3 G COIII ATPase6 ATPase8 K COII D COI W ND2 M I ND1 L 16srRNA V 12srRNA PHPH F Complex I genes (NADH dehydrogenase) Complex IV genes (cytochrome c oxidase) Complex III genes (ubiquinol: cytochrome c oxidoreductase) Complex V genes (ATP synthase) Transfer RNA genes Ribosomal RNA genes 5 kb deletion KSS The Human Mitochondrial DNA Map From MITOMAP

27 HSP LSP ETAS domain C C C C C C 5' O H 3' 321 CSB domain Central conserved domain ETASs 12 CSBs RNADNA 5'3' tRNA Phe tRNA Pro Schematica rappresentazione della regione D-loop nei mammiferi regione D-loop nei mammiferi HVS 1HVS 2 mtRNApol+mtTFA mrp H strand L strand mtRNAprocessing

28 Genoma mitocondriale Per le caratteristiche precedentemente descritte del mitocondrio, gli studi di genetica popolazione si sono fortemente concentrati sul mitocondrio. Prima dellavvento della genomica, i genetisti popolazionali hanno utilizzato come marcatori le sequenze delle regioni HVS1 e HVS2 del D-loop e i polimorfismi RFLP della regione codificante. La regione HVS1 è stata sequenziata in un elevatissimo numero di popolazioni (in GenBank sono annotate circa sequenze relative al D-loop o a sue parti). Ciò ha permesso la individuazione, su un elevatissimo numero di popolazioni mondiali, degli aplotipi e quindi degli aplogruppi mitocondriali.aplogruppi Analogamente è stato condotto uno screening a largo raggio della regione codificante attraverso gli RFLP. Gli studi più recenti sul D-loop ….

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30 Group I Group II Group III

31 Genoma mitocondriale Il sequenziamento dei genomi mitocondriali completi ha consentito una classificazione più fine degli aplogruppi genomi disponibili relativi ai 5 continenti. La classificazione degli aplogruppi

32 La risorsa genomica mitocondriale HmtDB HmtDB

33 HmtDB Variabilità sito specifica e classificazione degli aplogruppi Siti del mtDNA con valori di variabilità discriminanti in una particolare area geografica, rispetto al resto del mondo, fungono da marcatori molecolari di aplogruppi localizzati nella specifica area.

34 Lalgoritmo MSD per il riconoscimento dei siti marcatori I dati ottenuti da Site_Var sono quindi analizzati con uno script che calcola il parametro MSD (Mean Simple Deviation) al fine di quantificare i valori di variabilità discriminanti Siti con MSD maggiori di una prefissata soglia sono con molta probabilità marcatori di aplogruppi. Abbiamo così individuato 81 siti caratterizzanti nuovi sottoaplogruppi81

35 DEAF 1555G MELAS 3243G LHON 3460A MERRF 8344G NARP 8993 G/C LHON 11778A LHON 14484C LHON 14459A 0 / P E ND6 S Q A N OLOL C Y PLPL OHOH T Cyt b ND5 L S H ND4 ND4L R ND3 G COIII ATPase6 ATPase8 K COII D COI W ND2 M I ND1 L 16srRNA V 12srRNA PHPH F Complex I genes (NADH dehydrogenase) Complex IV genes (cytochrome c oxidase) Complex III genes (ubiquinol: cytochrome c oxidoreductase) Complex V genes (ATP synthase) Transfer RNA genes Ribosomal RNA genes 5 kb deletion KSS The Human Mitochondrial DNA Map From MITOMAP

36 Le mutazioni mitocondriali patologiche MITOMAP

37 Leberhaplogroup

38 Febbraio 2001 : pubblicazione del Genoma Umano Consorzio pubblico Celera Genomics

39 Il progetto Genoma Umano ha posto le basi e ha creato le premesse per lo studio sistematico della variabilità umana –Human Diversity (pre Genoma)Human Diversity –HapMap –National Geographic I grandi progetti Antropo-molecolari

40 Human Genome Diversity Project HGDP Progetto lanciato agli inzi degli anni 90 con lobiettivo di raccogliere in maniera sistematica e su larga scala campioni biologici relativi a popolazioni rappresentative di tutto il globo terrestre per la comprensione dei meccanismi che hanno generato e genereranno in futuro la variabilità umana per scopi culturali ma anche e soprattutto di interesse biomedico. Il lancio di tale progetto ha provocato numerosi dibattiti per le problematiche etiche connesse soprattutto in relazione al campionamento di popolazioni indigene per le quali si temeva un utilizzo commerciale dei campioni. Nature Reviews Genetics 6, (2005); doi: /nrg1596 THE HUMAN GENOME DIVERSITY PROJECT: PAST, PRESENT AND FUTURE L. Luca Cavalli-Sforza

41 Human Genome Diversity Project HGDP Superati i problemi etici sono state raccolte per le popolazioni indigene linee cellulari di linfoblastomi Il lancio vero e proprio del progetto nel Il CEPH raccoglie i campioni Nature Reviews Genetics 6, (2005); doi: /nrg1596 THE HUMAN GENOME DIVERSITY PROJECT: PAST, PRESENT AND FUTURE L. Luca Cavalli-Sforza

42 52 popolazioni raccolte nel progetto HGDP

43 HGDP primi risultati 377 polimorfismi di microsatelliti relativi a 1056 individui di 52 popolazioni

44 Il progetto Genoma Umano ha posto le basi e ha creato le premesse per lo studio sistematico della variabilità umana –Human Diversity (pre Genoma) –HapMapHapMap –National Geographic I grandi progetti Antropo-molecolari

45 HapMap Project FinalitàFinalità : catalogare e rendere pubblicamente disponibili aplotipi del genoma umano relativi a specifiche regioni del cromosoma per effettuare studi di associazione finalizzati al riconoscimento di geni associati a malattie o il loro ruolo nella risposta al farmaco. Partecipanti PopolazioniPopolazioni : 4 popolazioni per un totale di 270 campioni Pubblicazioni Accesso ai dati : Mart BrowserMart Browser

46 Il progetto Genoma Umano ha posto le basi e ha creato le premesse per lo studio sistematico della variabilità umana –Human Diversity (pre Genoma) –HapMap –National GeographicNational Geographic I grandi progetti Antropo-molecolari

47 Progetto lanciato dalla NG society e supportato dallIBM e dalla Waitt Family Foundation Raccoglierà campioni relativi a 1000 popolazioni indigene per approfondire le conoscenze sulla diffusione delluomo nella preistoria

48 Le risorse Bioinformatiche per la Human Diversity dbSNP : deCODE : EMPOP : Ensembl : HapMap HmtDB : Human Diversity : MitoMAP: mtDB : mtSNP : OMIM : UCSC :

49 Eredità materna del DNA mitocondriale back


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