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ENSE – Laboratorio Analisi Sementi

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Presentazione sul tema: "ENSE – Laboratorio Analisi Sementi"— Transcript della presentazione:

1 ENSE – Laboratorio Analisi Sementi
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1): elaborazione di disciplinari per la produzione di prodotti sementieri no OGM ASPETTI ANALITICI Rita Zecchinelli ENSE – Laboratorio Analisi Sementi Tavazzano (LO) Roma, 19 giugno 2007

2 E.N.S.E. Laboratorio Analisi Sementi, Tavazzano (LO)
Laboratorio OGM: verifica presenza di OGM in sementi convenzionali (mais, soia) presenza / assenza quantificazione identificazione evento GM messa a punto di metodologie e protocolli test di proficiency (circuito ISTA) test di validazione (circuito ENGL/CRL)

3 E.N.S.E. Laboratorio Analisi Sementi, Tavazzano (LO)
2001: ACCREDITAMENTO ISTA 2006: AMPLIAMENTO A ANALISI OGM ANALISI VARIETALI

4 SCOPO: definire protocolli di campionamento e
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) SCOPO: definire protocolli di campionamento e analisi per verificare l’assenza di OGM nelle sementi. 1° ANNO: mais soia pomodoro barbabietola 2° ANNO: patata

5 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI ANALISI
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) CAMPIONAMENTO PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI ANALISI ESTRAZIONE DEL DNA QUANTIFICAZIONE DNA ANALISI QUALITATIVA, QUANTITATIVA: RISULTATO

6 CONTROLLI SU TUTTE LE SEMENTI
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) mais soia A N O DETECTION OGM Specie largamente studiate a livello internazionale. Disponibilità di protocolli validati. Disponibilità di materiali di riferimento. Import di sementi da Paesi utilizzatori di OGM. CONTROLLI SU TUTTE LE SEMENTI IMPIEGATE e PRODOTTE

7 2° A N O barbabietola pomodoro patata DETECTION OGM
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) barbabietola pomodoro A N O patata DETECTION OGM Esperienze limitate. Scarsa disponibilità di protocolli validati. Scarsa disponibilità di materiali di riferimento.

8 2° A N O patata DETECTION OGM Esperienze limitate.
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) patata A N O DETECTION OGM Esperienze limitate. Scarsa disponibilità di protocolli validati. Scarsa disponibilità di materiali di riferimento. + Mancanza di metodi standardizzati per il campionamento. Deperibilità, ingombro.

9 2° A N O DETECTION OGM Esperienze limitate.
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) patata barbabietola A N O pomodoro DETECTION OGM Esperienze limitate. Scarsa disponibilità di protocolli validati. Scarsa disponibilità di materiali di riferimento. Limitato import di sementi da paesi utilizzatori di OGM. CONTROLLI A SONDAGGIO

10 CAMPIONAMENTO delle SEMENTI:
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) CAMPIONAMENTO delle SEMENTI: i riferimenti

11 SEMENTI: CAMPIONAMENTO - caratteristiche del lotto:
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) SCOPO: ottenere un campione di dimensioni adeguate, rappresentativo del lotto SEMENTI: CAMPIONAMENTO - caratteristiche del lotto: identificazione - omogeneità - dimensioni - strumenti: sonde - campionatore automatico - modalità, in base a: tipo confezioni - intensità, in base a: dimensioni lotto, peso e n° confezioni - dimensione del campione (3000 semi), in base alla specie: mais g, soia 800 g, pomodoro 10 g, barbabietola 80 g (sementi confettate: semi) - numero di aliquote: 5 per il laboratorio (analisi) per il laboratorio (rianalisi) per altro laboratorio (revisione) da conservare per la ditta

12 SEMENTI DI MAIS, SOIA, POMODORO, BARBABIETOLA
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) SEMENTI DI MAIS, SOIA, POMODORO, BARBABIETOLA C A M P I O N E T P R O T C L 1. Verificare le seguenti condizioni: a) Il lotto deve essere identificato da un cartellino di certificazione; per lotti non definitivamente certificati, è possibile effettuare il campionamento solo se si provvede ad effettuare una sigillatura provvisoria, con attribuzione di un numero di riferimento identificativo; b) il peso del lotto non deve superare quello massimo ammesso (N.B. ricordare che è consentita una tolleranza del 5%); c) il lotto deve essere accessibile in ogni sua parte; d) il lotto deve risultare omogeneo, almeno per le caratteristiche macroscopiche. 2. Procedere al campionamento, utilizzando lo strumento e le modalità di campionamento indicate adatte al tipo di confezione e allo stato in cui si trova la semente. 3. Effettuare un numero di campioni elementari almeno pari al minimo stabilito in base al peso unitario delle confezioni, al numero di confezioni che compongono il lotto o al peso totale del lotto. 4. Miscelare i campioni elementari prelevati per ottenere il campione globale di peso minimo pari a 5 volte il peso minimo del campione di analisi per la specie interessata (mais: g, soia: 800 g, pomodoro: 10 g, barbabietola: 80 g). Nel caso di sementi confettate, calcolare la dimensione del campione in base alle dimensioni dei confetti e stimare il peso minimo del campione in modo da garantire il prelievo di 3000 semi; incrementare il valore ottenuto del 10% a scopo di garanzia. 5. Suddividere il campione globale in cinque aliquote, ciascuna in una busta di carta robusta e completata con le indicazioni relative al lotto campionato (specie, varietà, lotto, categoria, ditta, data). 6. Compilare un verbale che descriva l’intervento effettuato. 7. Consegnare un’aliquota e una copia del verbale al rappresentante della ditta presso la quale si effettua il campionamento. 8. Confezionare adeguatamente i campioni, unendo copia dei verbali. 9. Inviare i campioni al laboratorio di destinazione, evitando in ogni caso di lasciare il pacco incustodito o di delegare la spedizione ad altri. 10. Effettuare l’invio prontamente, con il mezzo più rapido.

13 PATATA: CAMPIONAMENTO IN CAMPO
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) PATATA: CAMPIONAMENTO IN CAMPO il campionamento in campo è preferibile perché consente di ottenere migliore rappresentatività; il momento ottimale è 10 giorni dopo la distruzione dei cespi; la dimensione del campione viene stabilita in base alla superficie della coltura (minimo: 400 tuberi); la raccolta del campione viene realizzata dall’intero appezzamento, in modo rappresentativo; - viene prelevata una singola aliquota, ma è necessario garantire la possibilità di un ricampionamento.

14 TUBERI-SEME DI PATATA P R O T C L C A M P I O N E T
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) TUBERI-SEME DI PATATA P R O T C L C A M P I O N E T Eseguire il prelievo in campo, almeno 10 giorni dopo la distruzione dei cespi. 2. Per appezzamenti di dimensioni sino a 4 ha: prelevare un numero di tuberi almeno pari a 400. 3. Per appezzamenti di dimensioni superiori a 4 ha e sino a 9,9 ha: prelevare un numero di tuberi almeno pari a 550. 4. Per appezzamenti di dimensioni pari a 10 ha o superiori: 110 tuberi in più ogni 5 ha. 5. Suddividere idealmente la superficie da campionare con un reticolo di dimensioni opportune, in modo da avere un numero di celle pari al numero di prelievi elementari. 6. Prelevare un tubero da ogni cella. 7. Scegliere tuberi di medio calibro. 8. Compilare un verbale che descriva l’intervento effettuato e che riporti tutte le informazioni relative alla partita e al coltivatore. 9. Acquisire una dichiarazione relativa alla destinazione della merce, al fine di consentire un eventuale ricampionamento. 10. Confezionare adeguatamente i campioni, unendo copia dei verbali. 11. Inviare i campioni al laboratorio di destinazione, evitando in ogni caso di lasciare il pacco incustodito o di delegare la spedizione ad altri. 12. Effettuare l’invio prontamente, con il mezzo più rapido.

15 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI ANALISI Omogeneizzatore sterilmixer Mulino ZM200 Retsch SCOPO – caratteristiche del campione di analisi: - dimensioni adeguate, in base al protocollo di analisi - farina sufficientemente fine, sufficientemente omogenea - assenza di “contaminazioni”

16 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI ANALISI PROTOCOLLO
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI ANALISI PROTOCOLLO A. Ottenimento campioni/subcampioni di lavoro ∙ Sementi: semi: unico campione o diversi subcampioni in base al protocollo - tramite calcolo del peso dei semi ∙ Tuberi-seme di patata: - minimo 400 tuberi: sbucciatura, 1 carotaggio/tubero (~1g) B. Macinazione - in base allo strumento disponibile procedure di pulizia accurata sementi confettate: deconfettare e lasciare seccare prima della macinazione macinato di patata: conservazione del macinato liofilizzato o congelato a -20°C le “contaminazioni” possono essere evitate se la procedura di macinazione viene seguita scrupolosamente

17 ESTRAZIONE DEL DNA SCOPO: METODO: RIFERIMENTO:
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) ESTRAZIONE DEL DNA SCOPO: OTTENERE DNA PURO E DI BUONA QUALITA’ PER LE ANALISI PCR METODO: CTAB (cetyltrimethilammonium bromide) RIFERIMENTO: “Foodstuffs - detection of genetically modified organism and derived products - nucleic acides extraction CEN”

18 ESTRAZIONE DEL DNA PROTOCOLLO
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) ESTRAZIONE DEL DNA PROTOCOLLO Tre fasi - LISI della membrana cellulare con cattura di lipidi e proteine - ESTRAZIONE con eliminazione di polisaccaridi, proteine, altro - PRECIPITAZIONE e RISOSPENSIONE del DNA

19 QUANTIFICAZIONE DEL DNA
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) QUANTIFICAZIONE DEL DNA SCOPO: CONOSCERE QUANTITA’ E QUALITA’ DEL DNA ESTRATTO METODO: SPETTROFOTOMETRICO METODI ALTERNATIVI: FLUORIMETRIA QUANTIFICAZIONE SU GEL DI AGAROSIO DILUIZIONI CONCENTRAZIONE OTTIMALE (50 ng/μl)

20 QUANTIFICAZIONE DEL DNA
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) QUANTIFICAZIONE DEL DNA PROTOCOLLI A. Quantificazione del DNA su gel di agarosio - preparazione del gel di agarosio - lettura del gel con transilluminatore e stima della concentrazione di DNA per confronto con campione di riferimento B. Quantificazione del DNA con spettrofotometro - calibrazione: lettura della soluzione di riferimento e del “bianco” a λ= 260 nm e a λ= 320 nm - lettura del campione e del “bianco” a λ= 260 nm e a λ= 320 nm - calcolo:[assorbanza a 260 nm (OD) - assorbanza a 320 nm (background)] x fattore di diluizione x fattore di conversione

21 ANALISI QUALITATIVA E QUANTITATIVA
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) ANALISI QUALITATIVA E QUANTITATIVA SCOPO: EVIDENZIARE, QUANTIFICARE L’EVENTUALE PRESENZA DI OGM IN SEMENTI CONVENZIONALI. SCOPO COMPLEMENTARE: IDENTIFICARE L’EVENTO OGM PRESENTE. ANALISI SU SEMENTI - matrice unica e nota - campioni di grandi dimensioni - presenza di OGM limitata - omogeneizzazione necessaria

22 ANALISI QUALITATIVA E QUANTITATIVA
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) ANALISI QUALITATIVA E QUANTITATIVA Approccio privilegiato: analisi del DNA PCR - REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI

23 PCR Denaturazione Annealing Extension
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) PCR tramite amplificazione specifica, genera milioni di copie identiche di una singola sequenza di DNA Denaturazione Annealing Extension

24 ANALISI QUALITATIVA Risultato: elettroforesi su gel di agarosio
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) ANALISI QUALITATIVA Risultato: elettroforesi su gel di agarosio confronto con standard

25 Sonda TaqMan ANALISI QUANTITATIVA
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) ANALISI QUANTITATIVA Sonda TaqMan Il principio base della PCR Real Time è l’utilizzo di sonde fluorogeniche in grado di emettere fluorescenza, registrabile dallo strumento, proporzionale alla quantità di DNA presente nel campione. In figura è illustrato il saggio TaqManR: sonda con fluorofori alle estremità: al 5’ un reporter (R) e al 3’ un quencher (Q); non si ha emissione di fluorescenza se i due fluorofori sono vicini. La sonda, che ha sequenza complementare al target, si lega al DNA bersaglio in una sua zona centrale. Durante la fase di annealing, la TaqDNApolimerasi taglia la sonda allontanando R da Q, e determinando, in questo modo, l’emissione di fluorescenza.

26 Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1)
ANALISI QUANTITATIVA

27 LA CASSETTA OGM 35S NOS Promotore Gene di interesse Terminatore
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) LA CASSETTA OGM 35S NOS “Gene funzionale” DNA della pianta Promotore Gene di interesse Terminatore

28 EVENTI AUTORIZZATI IN UE PER LA COLTIVAZIONE
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) EVENTI AUTORIZZATI IN UE PER LA COLTIVAZIONE SPECIE EVENTO GENE D’INTERESSE STATUS NOTIFICANTE VARIETÀ ISCRITTE Mais MON810 gene cry1Ab (resistenza insetti: lepidotteri) Autorizzata 90/220/CEE con Decisione 98/294/CE Monsanto 47 ES: 36 FR: 6 DE: 5 Bt176 gene bar (resistenza insetti: lepidotteri) Autorizzato 90/220/CEE con decisione 97/98/CE Iscritta al registro degli alimenti Ciba-Geigy T25 gene pat (tolleranza agli erbicidi) Autorizzato 90/220/CEE con decisione 98/293/CE Agrevo Colza MS1/RF1 Gene bar (tolleranza agli erbicidi glufosinato) Autorizzato 90/220/CEE con decisione 97/392/CE Bayer Cropscience MS1/RF2 Autorizzato 90/220/CEE con decisione 97/393/CE Tabacco ITB 1000 OX Gene bxn (tolleranza agli erbicidi) Autorizzato 90/220/CEE con decisione 94/385/CE Seita Esempi di eventi di mais e soia, con evidenziate le parti costituenti. EVENTI IN CORSO DI AUTORIZZAZIONE PER LA COLTIVAZIONE: mais 6, soia 1, colza Fonte:

29 Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1)
Eventi OGM di pomodoro Evento p35S tNOS Varietà commerciale Produttore Caratteristiche Paesi 1345-4 + - DNA Plant Tecnology corporation Ritardo nella maturazione (riduzione dell'accumulo di etilene) mediante l'inserimento del gene troncato ACC sintasi Canada, Messico, USA 35 1 N Agritope Inc. Ritardo nella maturazione (degradazione di un precursore dell'etilene) mediante l'introduzione di un gene che codifica per l'enzima S-adenosilmetionina idrolasi. USA 5345 Monsanto Company Resistenza ai lepidotteri mediante l'inserimento del gene cry1Ac dal Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. Canada, USA CGN (8338) Ritardo nella maturazione (degradazione di un precursore dell'etilene) mediante l'introduzione di un gene che codifica per l'enzima ACC deaminasi. B, Da, F Zeneca Seed Ritardo della degradazione pectinica (riduzione dell'espressione della poligalatturonasi endogena) mediante l'inserimento di un gene (senso o antisenso) troncato che codifica per la PG. CGN (FLAVR SAVR) Flavr Savr Calgene Inc. Ritardo della degradazione pectinica (riduzione dell'espressione della poligalatturonasi endogena) mediante l'inserimento di un'altra copia del gene antisenso che codifica per la PG. Canada, Giappone, Messico, USA Esempi di eventi di mais e soia, con evidenziate le parti costituenti. Fonte:

30 Eventi OGM di barbabietola da zucchero
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) Eventi OGM di barbabietola da zucchero Evento p35S tNOS Varietà commerciale Produttore Caratteristiche Paese GTSB77 + - InVigor™ Novartis Seed Monsanto Company Tollerante al glifosate, mediante l'inserimento di un gene che codifica per l'enzima EPSPS isolato dal ceppo CP4 di Agrobacterium tumefaciens. Australia, Giappone, Filippine, Usa H7-1 Monsanto Company Campioni standard certificati IRMM disponibili. Australia, Canada, Giappone, Corea, Filippine, Usa T120-7 Bayer CropScience (Aventis CropScience(AgrEvo)) Tollerante all'erbicida fosfinotricina (PPT) mediante l'inserimento di un gene, isolato da fungo Streptomyces viridochromogenes, che codifica per l'enzima PAT detossificando l'erbicida. Canada, Giappone, USA. Esempi di eventi di mais e soia, con evidenziate le parti costituenti. Fonte:

31 Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1)
Fonte: Evento p35S tNOS Varietà commerciale Produttore Caratteristche Paese ATBT04-6, ATBT04-27, ATBT04-30, ATBT04-31, ATBT04-36, SPBT02-5, SPBT02-7 + Atlantic and Superior NewLeaf® Monsanto Company Resistente alla dorifora mediante inserimento del gene cry3a da Bacillus thuringensis subsp. tenebrionis Australia, Canada, Giappone, Corea, Filippine, Usa BT6, BT10, BT12, BT16, BT17, BT18, BT23 Russet Burbank NewLeaf® Canada, Giappone, Corea, Filippine, Messico, Usa RBMT15-101, SEMT15-02, SEMT15-15 - NewLeaf® Y Resistente alla dorifora mediante inserimento del gene cry3a da Bacillus thuringensis subsp. tenebrionis. Resistente a PVY (virus Y della patata) mediante inserzione del DNA codificante la proteina del capsidio RBMT21-129, RBMT21-350, RBMT22-082 Russet Burbank NewLeaf® Plus Resistente alla dorifora mediante inserimento del gene cry3a da Bacillus thuringensis. Resistente a PLRV (RNA virus dell'accartocciamento fogliare della patata) mediante inserzione del DNA codificante la replicasi virale Australia, Canada, Giappone, Corea, Filippine, Messico, Usa EH BASF Amylogene Contenuto di amilopectina superiore al 98%, mediante l'introduzione del gene antisenso gbss che inibisce la produzione di amilosio. Campioni standard certificati IRMM disponibili. UK (Codice BPS , 12/0705) E v e n t i O G M d i p a t a t a Esempi di eventi di mais e soia, con evidenziate le parti costituenti.

32 Mais, soia: PCR REAL TIME
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) Mais, soia: PCR REAL TIME IL PROTOCOLLO MESSO A PUNTO: è mirato a verifiche su grandi numeri può richiedere modifiche, in base alle strumentazioni disponibili prevede uno screening con ricerca di p35S e tNOS include 2 sub-campioni per ogni campione (estrazioni indipendenti) include 3 repliche per ogni estratto può essere completato con l’identificazione degli eventi OGM presenti nei campioni positivi prevede procedure che diminuiscono i rischi di errore include uno schema dei possibili errori e delle azioni correttive necessarie prevede analisi “multiplex” prevede il “protocollo termico” e fornisce indicazioni sul “protocollo di piastra” prevede l’utilizzo di campioni standard di riferimento certificati per la costruzione di una curva di calibrazione con 5 punti considera il gene endogeno di riferimento prevede parametri per verificare l’esito della PCR (R2, slope) prevede parametri per la verifica dell’attendibilità del risultato (CV su 6 repl.)

33 Pomodoro, patata, barbabietola:
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) Pomodoro, patata, barbabietola: PCR QUALITATIVA IL PROTOCOLLO MESSO A PUNTO: -è mirato a verifiche per sondaggio -può richiedere modifiche, in base alle strumentazioni disponibili -prevede uno screening con ricerca del p35S e/o tNOS include i riferimenti ai metodi validati per gli eventi privi di p35S e tNOS (barbabietola H7-1 e patata EH ) include 2 sub-campioni per ogni campione (estrazioni indipendenti) include 2 repliche per ogni estratto prevede la verifica dell’amplificabilità del DNA (geni endogeni di riferimento) prevede procedure che diminuiscono i rischi di errore include uno schema dei possibili errori e delle azioni correttive necessarie

34 Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1)
Amplificazione con primer trnLc-trnLd (cloroplasto) lane 2-3-4: pomodoro lane 5-6-7: barbabietola lane 8: patata lane 9: mais lane 10: soia lane 11: controllo negativo di amplificazione lane 1,12: marcatori di peso molecolare

35 Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1)
TOF-TOR in pomodoro M - + NTC M tomatina: +

36 Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1)
p35S in pomodoro p35S: neg. p35S: pos. M + - NTC

37 Grazie! Staff laboratorio OGM:
Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1) Staff laboratorio OGM: D.ssa Elena Perri - responsabile scientifico D.ssa Maria Losi - ricercatrice D.ssa Vanna Losi - ricercatrice D.ssa Daniela Villa – ricercatrice Dr. Simone Garavelloni – assegno di ricerca P.A. Carlo Tamagni - tecnico Grazie!


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