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Elettroforesi nel laboratorio di proteomica Biotecnologie 2011-2012 Pier Luigi Orvietani Università degli Studi di Perugia Corso di Laurea Interfacoltà

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Presentazione sul tema: "Elettroforesi nel laboratorio di proteomica Biotecnologie 2011-2012 Pier Luigi Orvietani Università degli Studi di Perugia Corso di Laurea Interfacoltà"— Transcript della presentazione:

1 Elettroforesi nel laboratorio di proteomica Biotecnologie Pier Luigi Orvietani Università degli Studi di Perugia Corso di Laurea Interfacoltà in Biotecnologie Fondamenti di Bioinformatica e di Biologia dei Sistemi Proteomica e Metabolomica

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5 LE PROTEINE HANNO FUNZIONI BIOLOGICHE DIVERSE: ENZIMI PROTEINE DI TRASPORTO PROTEINE DI RISERVA PROTEINE CONTRATTILI O MOTILI PROTEINE STRUTTURALI PROTEINE DI DIFESA PROTEINE REGOLATRICI ECC.

6 DALLA SEQUENZA ALLA STRUTTURA: DALLA SEQUENZA ALLA STRUTTURA: La funzione di una proteina dipende dalla sua sequenza aminoacidica

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9 I FOGLIETTI BETA SONO STRUTTURE ESTESE CHE TALVOLTA FORMANO BARILI

10 La condensazione di elementi multipli di struttura secondaria porta alla STRUTTURA TERZIARIA Strutture della trioso fosfato isomerasi e dididro folato reduttasi: elementi di struttura secondaria simili ma diversa struttura terziaria

11 PROTEINE INTEGRALI DI MEMBRANA Si tratta di proteine inserite in un ambiente idrofobico Le alfa-eliche sono lelemento di struttura secondaria più comune.

12 DALLA STRUTTURA ALLA FUNZIONE Esistono molti livelli di funzione delle proteine, che si articolano dalle semplici riorganizzazioni atomiche fino ai cambiamenti nello sviluppo di un organismo Tutti coinvolgono il legame con altre molecole Il riconoscimento molecolare è alla base del funzionamento di una proteina Un esempio è lattività catalitica Biologia strutturale: capire la funzione attraverso la struttura

13 LE FUNZIONI DI TUTTE LE PROTEINE DIPENDONO DALLA LORO CAPACITA DI LEGARE ALTRE MOLECOLE : LIGANDI INTERAZIONI LIGANDI-PROTEINE: INTERAZIONI NON COVALENTI TRA SUPERFICIE PROTEICA E LIGANDO VARIAZIONI DI CONFORMAZIONE DELLA PROTEINA: POSSONO CONSENTIRE IL LEGAME POSSONO FAVORIRLO POSSONO IMPEDIRLO IL RICONOSCIMENTO MOLECOLARE DIPENDE DA MICROAMBIENTI SPECIALIZZATI CHE DERIVANO DALLA STRUTTURA TERZIARIA DELLA PROTEINA

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15 Espressione genica: il risultato finale della trascrizione + processamento dellRNA + sintesi della proteina e suo funzionamento, cioè il fenotipo.

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18 PROTEOMICA: studia tutte le proteine espresse in un certo momento, incluse le isoforme e le modifiche post-traduzionali TRASCRITTOMICA: studia l'insieme degli mRNA trascritti nell'intero organismo, tessuto, cellula METABOLOMICA: studia la totalità dei metaboliti presenti in un organismo LIPIDOMICA: studia la totalità dei lipidi INTERATTOMICA: studia la totalità delle interazioni molecolari che hanno luogo in un organismo; un nome che comunemente indica la disciplina della interattomica è quello di biologia dei sistemi (system biology). SPLICEOMICA: studia la totalità delle isoforme proteiche dovute a splicing alternativo Ecc. GRANDE FAMIGLIA DEGLI OMA

19 Oggi la definizione di proteoma può essere ampliata considerando i seguenti punti: identifica tutte le proteine prodotte in una determinata cellula, tessuto o organismo; definisce come queste proteine interagiscono tra loro descrive la precisa localizzazione delle proteine allinterno della cellula descrive infine lesatta struttura tridimensionale di queste proteine (lo scopo è quello di trovare il loro punto debole, ossia il punto in cui lazione di un farmaco potrebbe attivarne o disattivarne la funzione) LA PROTEOMICA La proteomica è linsieme delle tecnologie e degli approcci sviluppati per lo studio del proteoma PROTEOMA: il termine proteoma, ormai universalmente accettato come equivalente linguistico di genoma, fu coniato da M.R. Wilkins nel 1994 per definire il complemento proteico codificato da un genoma

20 PERCHE STUDIARE IL PROTEOMA ? Il sequenziamento del DNA umano (progetto genoma) e lo studio dellespressione dellmRNA (microarray) non forniscono tutte le informazione necessarie per lo studio dei processi biologici: malattie (2% delle malattie dellessere umano sono caratterizzate dal difetto di un singolo gene) differenziamento invecchiamento effetti dellambiente La diversità, la funzionalità e labbondanza proteica dipendono infatti anche da altri meccanismi (regolazione della traduzione, folding, modificazioni post- traduzionali e degradazione proteica) che regolano lespressione genica. La proteomica permette di studiare lespressione proteica di una cellula o tessuto in un determinato momento, perché prende in considerazione il prodotto finale dellespressione genica, cioè le proteine.

21 La Proteomica ha come scopo base lo studio del proteoma. Identificare vuol dire saper riconoscere una proteina, mentre il sequenziamento è una procedura che ha lo scopo di determinare lesatta sequenza peptidica di una proteina Un metodo di separazione proteica è lElettroforesi Obiettivi della Proteomica sono lidentificazione e leventuale sequenziamento delle proteine. Separare le proteine allinterno del Proteoma

22 2D-Elettroforesi

23 2-D PAGE o BIDIMENSIONALE SDS- Page Isoelectric focusing (IEF) PUNTO ISOELETTRICO GRANDEZZA MOLECOLARE

24 Potenzialita della 2-DE Grande capacità di separazione e risoluzione di miscele proteiche( proteine)ad elevato ordine di grandezza Risoluzione estremamente alta I gel 2 –DE sono collettori di frazioni proteiche molto efficienti Proteine sono protette allinterno della matrice del gel Possibilità di confronto tra i dati Riproducibilità e affidabilità dei dati Capacità di rilevazione di modificazioni post-traduzionali delle proteine glicosilazione fosforilazione tagli proteolitici Possibilità di costruire o di usufruire di mappe di riferimento disponibili in rete

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26 campioni da analizzare - Fluidi biologici (sangue, urine, saliva, CFS ecc.) Trattati sempre a 4°C Congelati in azoto liquido e Stoccati in aliquote in azoto liquido o tenute a – 80°C - Tessuti - Cellule

27 Metodi di distruzione delle cellule e dei tessuti omogenizzatori omogenizzatori : il tessuto viene messo in un provettone di vetro all'interno del quale agisce un pestello di teflon o di vetro (Potter). Le membrane sono lacerate dalle forze frizionali che il pestello esercita contro le pareti del cilindro di vetro. frullatori frullatori : sono utilizzati per sospensioni di cellule vegetali o animali, o per pezzi di tessuto. che può essere azionato a mano o mediante un motore elettrico

28 Sonicazione Sonicazione: ideale per sospensioni cellulari, onde sonore ad alta frequenza (> 20KHz) x > > distruzione cellule per forze taglianti e cavitazionali (compressione e rarefazione dovuta a formazione e scoppio bolle). Per volumi piccoli ( max 100 ml) aggiungendo ghiaccio (sviluppa calore). La strumentazione utilizzata può essere di due tipi: -Bagnetto sonicatore -Sonda sonicatrice

29 Per una buona separazione in 2DE il campione deve essere il più possibile puro e privo di contaminanti Precipitazione Concentrazione con taglio molecolare(cut-off) DNA Lipidi Sali detergenti polisaccaridi Disturbano il processo di isoelettrofocalizzazione e quello di colorazione del gel. Prepurificazione cromatografica Metodi per diminuire tali interferenze

30 PRECIPITAZIONE La solubilità delle proteine è il risultato di interazioni polari dei loro residui amminoacidici di superficie con le molecole di solvente acquoso, interazioni ioniche con i sali presenti e varie forze repulsive tra molecole dotate di identica carica Sono 5 gli agenti comunemente usati per far precipitare le proteine: sali inorganici pH e temperatura solventi organici proteine basiche polietilenglicole

31 PRECIPITAZIONE CON SOLVENTI ORGANICI La facilità o difficoltà con la quale la proteina viene impossibilitata a interagire col solvente dipende largamente dalla natura dei residui amminoacidici di superficie. I solventi organici fanno decrescere fortemente la solubilità proteica. Questo avviene a causa della diminuzione della costante dielettrica del mezzo e grazie alla "deidratazione" (viene cioè impedita l'interazione con le molecole d'acqua). Con la diminuzione della costante dielettrica di una soluzione le forze attrattive tra residui di superficie di carica opposta aumenta e questo comporta la formazione di aggregati che precipitano. La temperatura alla quale avviene la precipitazione è un fattore importante perché in presenza di solventi organici la solubilità diminuisce marcatamente insieme alla temperatura. MEZZO APOLARE AGGREGAZIONE Solventi organici: TCA metanolo acetone TCA bassa efficienza Acetone buona TCA in acetone bassa efficienza Metanolo-cloroformio buona solo per piccoli volumi Tributil fosfato-acetone-metanolo buona

32 CONCENTRATORI CENTRIFUGHI Membrane filtranti con MWCO Molecular Weight Cut-Off Volume in ml 0, Membrana da ultrafiltrazione (sezione) vista al microscopio elettronico

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34 UREA: è un agente caotropico (denaturante) quindi in grado di portare ogni singola proteina ad avere una sola ed unica conformazione e quindi migrazioni omogene e di mantenere in soluzione proteine idrofobiche. Si usa a concentazioni 8-9M (alte) La carbamilazione delle proteine porta alla modificazione dei gruppi amminici o dei gruppi sulfidirilici liberi, quindi NH 2 terminale o arginine, lisine o costeine con conseguente perdita della possibilità per questi gruppi di assumere una carica positiva => si ha una alterazione del pI delle proteina i cui residui aminoacidici hanno subito tale modificazione! TIOUREA: è un agente caotropico più forte dellUrea ed è in grado di solubilizzare meglio le proteine idrofobiche. Si usa quindi per aumentare il potere solubilizzante, ma usato in combinazione con lUREA (7M UREA- 2M TIOUREA)]. Lazione denaturante aiuta ad inibire eventuali attività enzimatiche presenti in soluzione. Limitazione TEMPERATURA DI LAVORO Non deve superare i 30°C, altrimenti potremmo avere processi di carbamilazione Lurea è in equilibrio con lammonio cianato, passando per uno stadio intermedio che forma ammoniaca e acido isocianico

35 Il detergente viene utilizzato per aumentare la solubilità delle proteine idrofobiche. In genere vengono utilizzati detergenti non carichi (NP-40, Triton X100, etc) o zwitterionici (CHAPS, etc). Si usano a concentrazione che variano da 1 al 4% Anche i detergenti concorrono nella denatuarzione delle proteine e nellinibizione di attività enzimatiche presenti nel campione. DETERGENTI LSDS essendo una molecola carica negativamente e legandosi lo stesso alle proteine (forma delle micelle detergente-proteine) non consente una corretta focalizzazione. SDS LSDS risulta compatibile con una isoelettrofocalizzazione qualora esso sia presente nel lisato finale ad una concentrazione minore dello 0,25% e si trovi in rapporto 1/8 (o ancora minore) con detergenti nonionici o zwitterionici Detergenti come NP-40 e Triton X100 sono non ionici e risultano essere abbastanza blandi attenzione alle attività enzimantiche che vengono mantenute (proteasi attive )

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38 Agente riducente è necessario per rompere i ponti disolfuro S-S e mantenere in forma ridotta le proteina. Generalmente si usa: DTT – DiTioTreitolo o in alternativa il DTE – DiTio Eritritolo a concentrazioni mM TBP a concentrazione 5mM DeStreak RIDUCENTI A pH >8 il gruppo sulfidrilico del DTT diventa ionizzato e migra perciò verso lanodo. Questo fatto porta ad una perdita di DTT nelle regioni a pH >8 con conseguente perdita delle caratteristiche riducenti dellambiente. Le proteine si ossidano in modo casuale con formazione di ponti e acquisiscono carica, spostandosi dal loro punto isoelettrico (fenomeno delle strisciate di proteine a pH >8 - Streaking). Altre due strategie per evitare la formazione di ponti disolfuro sono: 1)Ridurre ed alchilare (con iodoacetamide – IAA) la proteina prima della IEF. 2)Ossidare i gruppi tiolici delle proteine a disulfidi misti => convertire tutti i gruppi tiolici in una forma ossidata ma stabile (HED –Hydroxyethyldisulphide – DeStreak) LIMITAZIONI DTT DTE suo epimero

39 a) piccole molecole organiche polimeriche b) altamente solubili c) anfoteriche (presenza contemporanea di gruppi basici e acidici => hanno un pI determinato da questi gruppi) d) alto potere tamponante al loro pI. A: gruppo acidico B: gruppo basico ANFOLINE Si usano nel lysis buffer per: a) aumentare la solubilità delle proteine b) prevenire interazioni proteine-gel A seconda dellintervallo di pH scelto per lanalisi di isolettrofocusing vengono selezionate miscele di anfoliti su misura (IPG buffer - immobilzed pH gradient buffer).

40 INIBITORI DI PROTEASI: alcuni enzimi proteolitici riescono a rimanere attivi, anche se le condizioni di preparazione sono denaturanti Per evitare una degradazione proteica durante le fasi che precedono la corsa elettroforetica, si usano: Può essere utilizzato anche Tris Base fino a 40 mM, che rende alcalino lambiente e neutralizza una serie di proteasi attive in ambiente acido. NUCLEASI BLUE DI BROMOFENOLO (tracce)

41 COOH CHH 2 N CH 3 catene laterali acida apolare polare non dissociabile basica

42 La carica netta di una proteina dipende dal suo pI e dal pH dellambiente.

43 pH pI = 8 pI = 6 pI = 5 pI = 4 Una proteina mostra carica elettrica = 0 ad un pH = pI mostra carica elettrica ad un pH < pI + mostra carica elettrica ad un pH > pI

44 pI = In una Elettroforesi condotta a pH costante, solo quelle proteine con un pI = pH non migrano verso lanodo o verso il catodo pH costante = 6 Elettroforesi nativa Separazione basata sulla Carica

45 Anfoline in fase liquida Molecole anfotere a basso peso molecolare Valori di pI leggermente spaziati con cui possiamo creare un gradiente di pH Inizialmente si sviluppavano in gel cilindrici Sottoposte ad un campo elettrico migrano a seconda della loro carica fino al pI Per la loro elevata capacità tamponante in ogni punto del gel il valore di pH sarà bene preciso

46 Limitazioni delle anfoline Effetto del drift catodico Non buona riproducibilità tra esperimenti nello stesso laboratorio e tra laboratori differenti per la diversità dei lotti di anfoline Non focalizzazione delle proteine basiche Non possibilità di applicare una quantità di proteine tale da consentire successive micronalisi per il riconoscimento dei polipeptidi

47 IPG = Immobilized PH Gradient strip Nel 1993 è stato sviluppato un metodo nel quale la focalizzazione viene svolta su gradienti IMMOBILIZZATI Il gradiente è formato legando covalentemente un gradiente di molecole cariche (immobiline) nel gel Le IMMOBILINE sono derivati della acrilammide, contenenti catene laterali con capacità tamponanti, che vengono polimerizzate nel gel insieme alla acrilammide. Il processo di formazione delle IPG è simile a quello di un gel a gradiente Nelle due camere vi sono rispettivamente un buffer acido ed uno basico La concentrazione dei buffer definisce il range di pH delle strip che si vogliono formare. Si versa su un supporto di plastica, si lava per allontanare i catalizzatori ed i monomeri non polimerizzati,si secca e si taglia a strip. Il pH in ogni punto del gel è determinato dalla mistura di immobiline che si trovano in quel punto.

48 Vantaggi delle immobiline Gradiente di pH stabile perché è immobilizzato Buona separazione anche a pH basici estremi Possibilità di caricare grandi quantitativi di materiale anche fino a 12 mg Riproducibilità delle mappe e confronto dei dati fra diversi laboratori

49 +- Proteine con pI = In una elettroforesi con gradiente di pH immobilizzato, le proteine migreranno verso il rispettivo pI IEF IsoElectricFocusing Separazione basata sul pI

50 IPG strip disponibili

51 Gradiente 3-10 lineare Gradiente 3-10 Non lineare Differenze di separazione fra due gradienti

52 Reidratazione passiva Reidratazione attiva 50V 300V3h V1h 3500V3h V1h 9500Vfino a voltaggio desiderato Programma di focalizzazione

53 EQUILIBRAMENTO STRIP PER LA 2° DIMENSIONE Iodoacetamide serve per alchilare

54 cariche delle catene laterali SDS Il trattamento con SDS conferisce a tutte le proteine una carica negativa Poliacrylamide gel Tunnel di diverso diametro Esse migreranno in un Gel, sotto lazione di un campo elettrico, solo in funzione della loro grandezza (M) Campo Elettrico

55 Grandezze dei pori del gel Dipende da due grandezze: %T, %C %T= (gr. Acrilammide + gr Bis-Acrilammide/ Volume totale) x100 %C= (gr Bis-Acrilammide/ gr. Acrilammide+gr. Bis-Acrillamide) x100

56 Il Gel % di acrilammide consigliata 8% 10% 12% 16% Dimensioni delle proteine kDa kDa kDa 5-80 kDa I gel possono essere: %T costante %T a gradiente per es. 8-16%

57 kD JpH - + SDS – 2D PAGE

58 kD pI Ogni proteina (spot) è caratterizzata da Mr - pI

59 Metodi per la rilevazione di spot proteici Requisiti ideali per un metodo di rilevazione di spot proteici da 2D Alta sensibilità Permettere analisi quantitative Compatibile con MS Economico Non tossico Rapido... in pratica non esiste il metodo ideale....

60 COLORAZIONE DEI GEL SILVER COOMASSIE RUBY Visibili ad occhio nudo Visibili con strumentazione DIGE

61 silver E il metodo più sensibile per la colorazione dei gel Sensibilità 1-2 ng Si basa sul legame che lAg instaura con le proteine specialmente sui gruppi amminici liberi e sulfurici SH COO - Ag + SH COO - Ag HCOH Metodica lunga Colorazione non lineare se non entro certi limiti Colorazione non sempre compatibile con la massa Silver acido Silver alcalino

62 E un metodo veloce Economico Pratico Facilmente decolorabile Compatibile con la massa Si basa sul legame che la molecola del colorante instaura con le proteine ed esattamente con i residui di arginina e lisina Sensibilità bassa ng Coomassie blue La colorazione richiede un mezzo acido per la generazione di unattrazione elettrostatica tra le molecole del colorante e i gruppi amminici delle proteine.Questa attrazione ionica, insieme con le forze di Van Der Waals mi lega il complesso colorante proteina insieme.

63 ruby E un metodo veloce Pratico Facilmente decolorabile Compatibile con la massa Altamente lineare fino al 3 ordine di magnitudo Sensibilità 1-10ng Si basa sul legame che il Rubidio, un metallo chelante, instaura, in presenza di solventi organici, con i residui amminoacidici basici Poco economico Si deve avere una strumentazione adatta per la ripresa delle immagini E un fluoroforo che ha due massimi di eccitazione a 280 e 450nm mentre ha un massimo di emissione a 610nm

64 silver coomassie ruby

65 Strumentazione per la cattura delle immagini VERSADOC

66 Tools del Versadoc tramite software

67 SVANTAGGI metodica lunga bassa capacità di risoluzione delle proteine idrofobiche difficile separazione delle proteine molto acide o basiche, con valore del Punto isoelettrico estremo scarsa risoluzione di proteine con MW > 150 kDa o <10kDa bassa risoluzione delle proteine a bassa concentrazione al di sotto del 4°ordine di grandezza mancanza di linearità o sensibilità tra abbondanza della proteina nel campione proteico e capacità di risoluzione tramite colorazione sul gel

68 IdentificazioneComparazione

69 Il confronto e lanalisi dei 2D Gels vengono effettuati mediante luso di opportuni Hardware e Software Bioinformatica


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