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Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Unicam incontri Camerino 25-26 Settembre 2003 Altisonante Misterioso Inquietante.

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2 Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Unicam incontri Camerino Settembre 2003 Altisonante Misterioso Inquietante

3 Nucleare

4 Tutti gli anni, verso il mese di marzo, una famiglia di zingari cenciosi piantava la tenda vicino al villaggio, e con grande frastuono di zufoli e tamburi faceva conoscere le nuove invenzioni. Prima portarono la CALAMITA. Gabriel Garcia Marquez Centanni di solitudine Magnetica

5 Cronologia NMR 1945 Prima osservazione di un segnale NMR 1945 Prima osservazione di un segnale NMR Bloch e coll. Stanford Un. (1H in H2O) Purcell e coll. Harvard Un. (1H in paraffina) (nobel 1952) 1950Scoperta del Chemical Shift 1950Scoperta del Chemical Shift 1961 Primo spettrometro commerciale CW 1961 Primo spettrometro commerciale CW 1970 Primo spettrometro commerciale FT 1970 Primo spettrometro commerciale FT 1976Primi esperimenti 2D ( Ernst 1991 Nobel) 1976Primi esperimenti 2D ( Ernst 1991 Nobel) 1980Spettrometri NMR di II generazione 1980Spettrometri NMR di II generazione

6 Lorigine fisica dellNMR Pauli nel 1924 introdusse lidea dello spin nucleare Protoni e neutroni possiedono un momento angolare di spin con relativo numero quantico di spin I=1/2 In nuclei diversi da 1 H il numero quantico di spin può essere intero, semiintero o nullo; in particolare: numero di massa dispari spin semiintero numero di massa pari e n. atomico parispin nullo numero di massa pari e n. atomico disparispin intero LNMR dipende dallesistenza dello spin nucleare quindi nuclei con I=0 sono magneticamente inattivi.

7 Spin e abbondanza nucleare IsotopoSpin I% 1H1H1/ H2H C C1/ N N1/ O O5/ P1/2100

8 Momenti magnetici nucleari I nuclei hanno spin e sono carichi + ogni particella carica in moto produce un campo magnetico. ogni nucleo con un momento angolare possiede quindi un momento magnetico proporzionale. P

9 > proclamava lo zingaro con aspro accento, > 2I+1 orientazioni possibili

10 E= h I z H o E= h H o

11 Ho N - /N + =e - E/kT N-N- N+N+ E= h H o E=h H o Diagramma dellenergia Livelli degeneri

12 H0H0 H 0 Frequenza di precessione di Larmor Risonanza?

13 Irradiando il campione con delle opportune radiofrequenze e misurandone lassorbimento potremmo ottenere lo spettro del composto in esame. 13 C 15 N 31 P 1H1H MHz

14 Chemical shift Nuclei dello stesso atomo assorbono a frequenze leggermente diverse a causa del loro intorno chimico Gli elettroni di un atomo inducono un piccolo campo magnetico che si oppone a quello principale Il campo magnetico sperimentato dal nucleo è generalmente minore del campo effettivo di un fattore H = H o (1- ) H

15 Diagramma di correlazione 1 H NMR

16 Molteplicità dei segnali NMR Ad ogni protone (carbonio, azoto …) chimicamente diverso corrisponde un segnale di diversa frequenza. La forma del segnale in uno spettro NMR spesso non è un semplice picco di assorbimento ma può assumere aspetti molto diversi. Tripletto 1:2:1 Quartetto 1:3:3:1 Quintetto 1:4:6:4:1 Sigoletto Doppietto 1:1

17 La molteplicità dei segnali è dovuta ai vicini di casa H a H b | | -C C- | | a b Ho Ho + Ho - H 0 Doppietto 1:1 bb

18 H a H b | | -C C-H c | | a Ho Ho + Ho - 2 Ho Tripletto 1:2:1 b c

19 Tempi di rilassamento

20 M xy Tempo MzMz M z =M 0 (1-e -t/T 1 )

21 Le Risonanze Magnetiche NMR in soluzione (ad alta risoluzione) NMR in soluzione (ad alta risoluzione) NMR allo stato solido (CP-MAS) NMR allo stato solido (CP-MAS) NMR in vivo NMR in vivo Risonanza magnetica ( imaging) Risonanza magnetica ( imaging)

22 NMR in soluzione NMR dei chimici I composti vanno sciolti in un solvente deuterato Massima omogeneità del campo magnetico Spettri affilati poiché il rapido moto casuale delle molecole media a zero le interazioni dipolari anisotropiche

23 computer controlli electronici magnete a super- conduzione

24 Solvente deuterato Tubo NMR

25 FT Frequenza Tempo spin lock shim Sequenza dimpulsi

26 FT

27 1 H-NMR 13 C-NMR 2D NMR

28 NMR allo stato solido (MAS) Nei solidi i nuclei sono costretti in una determinata posizione quindi le interazioni dipolari anisotropiche (dipendenti dallorientazione) non si annullano e gli spettri sono molto larghi.

29 E.R. Andrew e I.J. Lowe dimostrarono che le interazioni dipolari anisotropiche si annullano se il campione è posto in rapida rotazione attorno ad un asse orientato a 54.74° rispetto al campo magnetico principale (Magic Angle Spinning MAS)

30 I campioni vengono polverizzati finemente, impaccati nel rotore e quindi messi in rotazione ad una velocità compresa tra 1 e 35 KHz Limitata utilità nei nuclei come 1 H e 19 F poiché gli accoppiamenti dipolari superano i 100 KHz.

31 MRS in vivo e MRI (imaging) Sono due tecniche molto conosciute per il loro utilizzo in campo biomedico ma in realtà possono essere usate in moltissimi campi scientifici. I principi fisici fondamentali sono gli stessi dellNMR in soluzione o MAS ma le tecniche, la strumentazione e i dati ottenuti da questi esperimenti sono molto differenti. La prima differenza è la scomparsa del termine NUCLEARE dal nome delle tecniche. Le differenze fondamentali derivano dalle diversità dei campioni da analizzare: - omogenei nei primi due casi - assolutamente eterogenei nella MR

32 Gradiente Frequenza Ho H 0 La frequenza di risonanza diventa dipendente dallo spazio.

33 Vista della sezione orizzontale e verticale di un tubo NMR riempito di acqua e con una barretta di plastica al centro XY YZ Come si ottengono queste immagini?

34 Immagini per retroproiezione

35 MR imaging

36 Tra le tecnologie emergenti della Medicina di laboratorio, la spettroscopia di risonanza magnetica in vivo (MRS) è particolarmente innovativa perché consente di esplorare direttamente sul paziente e in modo non invasivo la concentrazione intracellulare di alcuni intermedi metabolici e la funzionalità di diverse vie metaboliche. MRS in vivo Invece di ottenere immagini dettagliate di tessuti con la MRS possiamo ottenere gli spettri di composti biochimici presenti allinterno di questi tessuti!

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38 Con la spettroscopia RM del fosforo (31P-MRS): ATP fosfato inorganico (Pi) fosfocreatina (PCr) intermedi metabolici fosforilati (PME e PDE) concentrazione di Mg2+ pH intracellulare Si valuta la funzionalità di: fosforilazione ossidativa, glicogenonolisi, glicolisi …..

39 Con la spettroscopia RM del protone (1H-MRS): n-acetilaspartato (NAA) colina (Cho) creatina + fosfocreatina (Cr) glutammato e glutammina (Glx) mio-inositolo (m-I) e acido lattico (LA) Si valuta la funzionalità di: sistema glutamminergico,metabolismo energetico, la osmoregolazione del SNC …….

40 In vivo 31 P NMR di Corynebacterium glutamicum

41 .. José Arcadio Buendia … pensò che era possibile servirsi di quella invenzione inutile per sviscerare loro dalla terra. Lo zingaro, che era un uomo onesto, lo prevenne: > 197 Au


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