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ESAME ISTOLOGICO : esame estemporaneo mediante uso del criostato biopsie mirate su tessuti e\o su organi prelievi autoptici ESAME ISTOLOGICO : esame estemporaneo.

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Presentazione sul tema: "ESAME ISTOLOGICO : esame estemporaneo mediante uso del criostato biopsie mirate su tessuti e\o su organi prelievi autoptici ESAME ISTOLOGICO : esame estemporaneo."— Transcript della presentazione:

1 ESAME ISTOLOGICO : esame estemporaneo mediante uso del criostato biopsie mirate su tessuti e\o su organi prelievi autoptici ESAME ISTOLOGICO : esame estemporaneo mediante uso del criostato biopsie mirate su tessuti e\o su organi prelievi autoptici ESAME CITOLOGICO : esame su versamento interstiziale esame su urine esame su striscio vaginale agoaspirato ESAME CITOLOGICO : esame su versamento interstiziale esame su urine esame su striscio vaginale agoaspirato ITER DI PROCEDURA NEL LABORATORIO DI ANATOMIA PATOLOGICA 1FASEPROPEDEUTICA 2FASEPROPEDEUTICA DI LABORATORIO 3FASEPRE-ANALITICA 4FASEANALITICA 5FASEPOST-ANALITICA 6FASEINTERPRETATIVA 7REFERTAZIONE 1FASEPROPEDEUTICA 2FASEPROPEDEUTICA DI LABORATORIO 3FASEPRE-ANALITICA 4FASEANALITICA 5FASEPOST-ANALITICA 6FASEINTERPRETATIVA 7REFERTAZIONE

2 ISTOLOGIA : richiesta esame da reparto o divisione ospedaliera interna o da medico esterno allegate notizie cliniche e patologiche circa la motivazione della richiesta di esame contestuale invio di reperto anatomico o istologico (vetrini di consulenza) esecuzione autopsia e relativi prelievi effettuata dal medico anatomo-patologo ISTOLOGIA : richiesta esame da reparto o divisione ospedaliera interna o da medico esterno allegate notizie cliniche e patologiche circa la motivazione della richiesta di esame contestuale invio di reperto anatomico o istologico (vetrini di consulenza) esecuzione autopsia e relativi prelievi effettuata dal medico anatomo-patologo CITOLOGIA : richiesta esame da reparto o divisione ospedaliera interna o da medico esterno allegate notizie cliniche e patologiche circa la motivazione della richiesta di esame contestuale invio di campione citologico o di vetrino con striscio vaginale già eseguito dal ginecologo (preparazione ed anamnesi del paziente sottoposto ad agoaspirato in apposito ambulatorio) CITOLOGIA : richiesta esame da reparto o divisione ospedaliera interna o da medico esterno allegate notizie cliniche e patologiche circa la motivazione della richiesta di esame contestuale invio di campione citologico o di vetrino con striscio vaginale già eseguito dal ginecologo (preparazione ed anamnesi del paziente sottoposto ad agoaspirato in apposito ambulatorio) 1FASEPROPEDEUTICA

3 ISTOLOGIA : ricezione biopsie e reperti classificazione e numerazione reperti su apposito registro interno annuale progressivo compilazione apposito modulo di profilo mirato riduzione reperti anatomici ad opera del medico in apposite cassettine per istologia procedura di fissazione dei tessuti in processatore automatico (autotecnico) (circa 15 h.) (accensione e preparazione del criostato negli esami estemporanei) ISTOLOGIA : ricezione biopsie e reperti classificazione e numerazione reperti su apposito registro interno annuale progressivo compilazione apposito modulo di profilo mirato riduzione reperti anatomici ad opera del medico in apposite cassettine per istologia procedura di fissazione dei tessuti in processatore automatico (autotecnico) (circa 15 h.) (accensione e preparazione del criostato negli esami estemporanei) 2FASE PROPEDEUTICA DI LABORATORIO

4 ISTOLOGIA : inclusione in paraffina dei reperti in precedenza fissati preparazione microtomo e bagno termostatato stendi-sezioni raccolta sezioni istologiche di circa 3 µ su vetrini; loro fissazione in stufa a secco termostatata; procedimento deparaffinazione in solventi (per esame al criostato : riduzione reperto e taglio sezioni con loro immediata fissazione in metanolo) ISTOLOGIA : inclusione in paraffina dei reperti in precedenza fissati preparazione microtomo e bagno termostatato stendi-sezioni raccolta sezioni istologiche di circa 3 µ su vetrini; loro fissazione in stufa a secco termostatata; procedimento deparaffinazione in solventi (per esame al criostato : riduzione reperto e taglio sezioni con loro immediata fissazione in metanolo) 3FASEPRE - ANALITICA

5 ISTOLOGIA : colorazione manuale o automatizzata delle sezioni su vetrino colorazione di routine E.-E. colorazioni speciali reazioni specifiche di immuno-isto-chimica montaggio vetrini in mezzo di inclusione idoneo (colorazione esame criostato) Controllo di qualità : uso di sezioni già risultate positive in qualità di controllo positivo controlli inter-laboratorio ISTOLOGIA : colorazione manuale o automatizzata delle sezioni su vetrino colorazione di routine E.-E. colorazioni speciali reazioni specifiche di immuno-isto-chimica montaggio vetrini in mezzo di inclusione idoneo (colorazione esame criostato) Controllo di qualità : uso di sezioni già risultate positive in qualità di controllo positivo controlli inter-laboratorio 4FASEANALITICA

6 ISTOLOGIA : apposizione etichette identificative sui vetrini contenenti le sezioni colorate archiviazione in apposite rastrelliere delle cassettine per istologia contenenti le inclusioni in paraffina consegna dei vassoi contenenti i vetrini e dei moduli di profilo mirato al medico anatomo-patologo specialista archiviazione dei vetrini diagnosticati in istoteche ISTOLOGIA : apposizione etichette identificative sui vetrini contenenti le sezioni colorate archiviazione in apposite rastrelliere delle cassettine per istologia contenenti le inclusioni in paraffina consegna dei vassoi contenenti i vetrini e dei moduli di profilo mirato al medico anatomo-patologo specialista archiviazione dei vetrini diagnosticati in istoteche 5FASEPOST - ANALITICA

7 ISTOLOGIA : osservazione dei vetrini al microscopio ottico interpretazione e diagnosi da parte del medico anatomo-patologo specialista refertazione su apposito modulo di profilo mirato e relativa consegna in segreteria amministrativa Controllo di qualità : lettura vetrini incrociata tra medico lettore e medico revisore lettura alla cieca inter-laboratorio ISTOLOGIA : osservazione dei vetrini al microscopio ottico interpretazione e diagnosi da parte del medico anatomo-patologo specialista refertazione su apposito modulo di profilo mirato e relativa consegna in segreteria amministrativa Controllo di qualità : lettura vetrini incrociata tra medico lettore e medico revisore lettura alla cieca inter-laboratorio 6FASEINTERPRETATIVA

8 7REFERTAZIONE refertazione su apposito modulo in segreteria amministrativa archiviazione documentazione cartacea inserimento su personal computer del referto in archivio informatico dedicato per singola area di interesse (istologia; citologia; immunopatologia) archiviazione documentazione informatica consegna del referto dalla segreteria al reparto o al medico richiedente o al paziente refertazione su apposito modulo in segreteria amministrativa archiviazione documentazione cartacea inserimento su personal computer del referto in archivio informatico dedicato per singola area di interesse (istologia; citologia; immunopatologia) archiviazione documentazione informatica consegna del referto dalla segreteria al reparto o al medico richiedente o al paziente

9 DOPO IL PRELIEVO -Tessuti Freschi inviati direttamente al patologo: perché e come. -Tessuti sotto vuoto Banche di tessuti: perché e come. Problemi connessi. -Tessuti Freschi inviati direttamente al patologo: perché e come. -Tessuti sotto vuoto Banche di tessuti: perché e come. Problemi connessi.

10 La diagnosi istopatologica, che si basa sullo studio della morfologia, richiede l uso di fissativi idonei a preservare nello statu quo ante migliore possibile la struttura del campione. La fissazione di un tessuto fornisce quindi una immagine statica, la quale, benché non ne rappresenti proprio le caratteristiche dell aspetto in vivo, deve tuttavia essere costantemente riproducibile. Requisiti fondamentali del fissativo ideale : sicura preservazione della morfologia di base integrità della struttura antigenica impedimento di alterazioni biochimiche nei tessuti, per aggiunta o sottrazione di componenti chimiche opposizione ai processi autolitici e putrefattivi. La diagnosi istopatologica, che si basa sullo studio della morfologia, richiede l uso di fissativi idonei a preservare nello statu quo ante migliore possibile la struttura del campione. La fissazione di un tessuto fornisce quindi una immagine statica, la quale, benché non ne rappresenti proprio le caratteristiche dell aspetto in vivo, deve tuttavia essere costantemente riproducibile. Requisiti fondamentali del fissativo ideale : sicura preservazione della morfologia di base integrità della struttura antigenica impedimento di alterazioni biochimiche nei tessuti, per aggiunta o sottrazione di componenti chimiche opposizione ai processi autolitici e putrefattivi. FISSAZIONE DEI TESSUTI

11 Fissazione Definizione Trattamento chimico che porta alla immobilizzazione e alla stabilizzazione di componenti tessutali con minima dislocazione ed estrazione dei composti nativi La FORMA delle cellule e dei tessuti deve venir conservata il più possibile simile alla condizione vitale Definizione Trattamento chimico che porta alla immobilizzazione e alla stabilizzazione di componenti tessutali con minima dislocazione ed estrazione dei composti nativi La FORMA delle cellule e dei tessuti deve venir conservata il più possibile simile alla condizione vitale

12 Fissazione Una fissazione ideale prevede: Stabilizzazione contro modificazioni successive indotte da trattamenti susseguenti quale linclusione in paraffina Simultaneità nel campione della reazione tessuto-fissativo ( rapida penetrazione e diffusione nei tessuti ) Riproducibilità del processo di fissazione nonostante differente composizione del tessuto Assenza di anormali componenti prodotti o estrazione di componenti native Rapidità di azione ( per evitare linsorgere di autolisi ) Assenza di sovra-fissazione Una fissazione ideale prevede: Stabilizzazione contro modificazioni successive indotte da trattamenti susseguenti quale linclusione in paraffina Simultaneità nel campione della reazione tessuto-fissativo ( rapida penetrazione e diffusione nei tessuti ) Riproducibilità del processo di fissazione nonostante differente composizione del tessuto Assenza di anormali componenti prodotti o estrazione di componenti native Rapidità di azione ( per evitare linsorgere di autolisi ) Assenza di sovra-fissazione

13 Fissazione dei Tessuti Molto importante è lo spessore del campione di tessuto che non deve, in genere, superare i 3 mm, onde evitare che al centro del tessuto intervengano fenomeni degenerativi prima dellarrivo del fissativo. Una buona fissazione, atto preliminare più importante della tecnica istologica, pena la perdita irreparabile del tessuto dipende: - dal tipo, dal pH e dalla concentrazione del fissativo usato, - dalla osmolarità e dalle forze ioniche in atto - dalla temperatura e dalla durata dellintera operazione In genere i fissativi più usati intervengono sulle proteine e sui lipidi, mentre i glicidi, specie se a basso peso molecolare, vengono solo inclusi tra le proteine fissate e possono diffondere nellacqua. Molto importante è lo spessore del campione di tessuto che non deve, in genere, superare i 3 mm, onde evitare che al centro del tessuto intervengano fenomeni degenerativi prima dellarrivo del fissativo. Una buona fissazione, atto preliminare più importante della tecnica istologica, pena la perdita irreparabile del tessuto dipende: - dal tipo, dal pH e dalla concentrazione del fissativo usato, - dalla osmolarità e dalle forze ioniche in atto - dalla temperatura e dalla durata dellintera operazione In genere i fissativi più usati intervengono sulle proteine e sui lipidi, mentre i glicidi, specie se a basso peso molecolare, vengono solo inclusi tra le proteine fissate e possono diffondere nellacqua.

14 Fissazione Classificazione I fissativi si dividono in due classi a seconda che agiscano per: 1) Coagulazione: denaturazione irreversibile delle proteine, con nuove stabilizzazioni tra gruppi diversi di diverse proteine che reagiscono una con laltra formando aggregati MODIFICANO in modo irreversibile la struttura terziaria 3 Modi: movimento termico con distruzione della struttura secondaria e terziaria (calore) repulsione elettrostatica tra parti diverse di una stessa proteina (acidi forti, sali di metallo) rimozione di H 2 O con disidratazione (etanolo) La disidratazione con etanolo può seguire la fissazione per Cross-link Classificazione I fissativi si dividono in due classi a seconda che agiscano per: 1) Coagulazione: denaturazione irreversibile delle proteine, con nuove stabilizzazioni tra gruppi diversi di diverse proteine che reagiscono una con laltra formando aggregati MODIFICANO in modo irreversibile la struttura terziaria 3 Modi: movimento termico con distruzione della struttura secondaria e terziaria (calore) repulsione elettrostatica tra parti diverse di una stessa proteina (acidi forti, sali di metallo) rimozione di H 2 O con disidratazione (etanolo) La disidratazione con etanolo può seguire la fissazione per Cross-link

15 Fissazione 2) CROSS LINKING: ovvero la formazione di legami crociati tra polipeptidi allinterno di una stessa proteina o tra proteine vicine STABILIZZANO la conformazione nativa della proteina E un processo ADDITIVO, più o meno sensibile Tipico di ALDEIDI, CARBODIMIDE Utile anche in ME, Istochimica 2) CROSS LINKING: ovvero la formazione di legami crociati tra polipeptidi allinterno di una stessa proteina o tra proteine vicine STABILIZZANO la conformazione nativa della proteina E un processo ADDITIVO, più o meno sensibile Tipico di ALDEIDI, CARBODIMIDE Utile anche in ME, Istochimica

16 Tecniche di fissazione : per immersione, consistente nel sommergere il tessuto nel liquido fissativo, con rapporto volumetrico minimo tra fissativo e campione di 10 : 1 per perfusione, in assoluto la migliore da un punto di vista teorico - pratico, ma limitata all animale da esperimento o ad organi asportati in loco e con vasi integri per uso di vapori, secondo cui i tessuti si fissano grazie ai vapori che si liberano da una soluzione fissativa riscaldata, permettendo così una fissazione in situ (si evita in tal modo che alcune sostanze solubili possano diffondere in soluzione e disperdersi). Si usano fissativi altamente volatili come : formaldeide, glutaraldeide, acido osmico. Tecniche di fissazione : per immersione, consistente nel sommergere il tessuto nel liquido fissativo, con rapporto volumetrico minimo tra fissativo e campione di 10 : 1 per perfusione, in assoluto la migliore da un punto di vista teorico - pratico, ma limitata all animale da esperimento o ad organi asportati in loco e con vasi integri per uso di vapori, secondo cui i tessuti si fissano grazie ai vapori che si liberano da una soluzione fissativa riscaldata, permettendo così una fissazione in situ (si evita in tal modo che alcune sostanze solubili possano diffondere in soluzione e disperdersi). Si usano fissativi altamente volatili come : formaldeide, glutaraldeide, acido osmico. FISSAZIONE DEI TESSUTI

17 Fissazione dei Tessuti La Formalina: E il più diffuso ed usato fissativo in istopatologia, ad un valore di pH prossimo a 7.0. La formalina diviene monomerica ed idratata, una molecola di basso peso molecolare capace di penetrate rapidamente nei tessuti, con la formazione di gruppi idrossi-metile con le proteine, e con la formazione di legami di tipo metilenico tra catene polipeptidiche (cross-linking) Formalina al 10%: formaldeide polimerizzata in soluzione acquosa satura al 40% e successivamente diluita 1:10 (detta anche formaldeide 4%) Formalina salata: 100 ml di formaldeide al 40% + 9 g di NaCl ml di H 2 0; è una soluzione isotonica che impedisce la coartazione ed il rigonfiamento cellulare Formalina nel tamponata: 100 ml di formaldeide 40% ml di H g di fosfato acido di sodio g di fosfato disodico anidro; impedisce lacidificazione dei tessuti (fenomeno dovuto alla trasformazione della formaldeide in acido formico), mantenendo il pH a 7.0. La Formalina: E il più diffuso ed usato fissativo in istopatologia, ad un valore di pH prossimo a 7.0. La formalina diviene monomerica ed idratata, una molecola di basso peso molecolare capace di penetrate rapidamente nei tessuti, con la formazione di gruppi idrossi-metile con le proteine, e con la formazione di legami di tipo metilenico tra catene polipeptidiche (cross-linking) Formalina al 10%: formaldeide polimerizzata in soluzione acquosa satura al 40% e successivamente diluita 1:10 (detta anche formaldeide 4%) Formalina salata: 100 ml di formaldeide al 40% + 9 g di NaCl ml di H 2 0; è una soluzione isotonica che impedisce la coartazione ed il rigonfiamento cellulare Formalina nel tamponata: 100 ml di formaldeide 40% ml di H g di fosfato acido di sodio g di fosfato disodico anidro; impedisce lacidificazione dei tessuti (fenomeno dovuto alla trasformazione della formaldeide in acido formico), mantenendo il pH a 7.0.

18 Modi di Applicazione ( 1 ) Immersione Il campione deve essere immerso in almeno 20 volte volume di fissativo Ottima fissazione se: dimensioni adeguate (< 3 mm di spessore) minimo intervallo tra asportazione e immersione (< 30 m ottimale) ( le cellule, tolte dallorganismo, non sono più ossigenate e muoiono in un tempo variabile) Immersione Il campione deve essere immerso in almeno 20 volte volume di fissativo Ottima fissazione se: dimensioni adeguate (< 3 mm di spessore) minimo intervallo tra asportazione e immersione (< 30 m ottimale) ( le cellule, tolte dallorganismo, non sono più ossigenate e muoiono in un tempo variabile)

19 Modi di Applicazione Immersione Importante il tipo di contenitore ( a bocca larga ) e le dimensioni. Importanti le indicazioni sul recipiente (non sul coperchio) Nome, data, Numero; provenienza Immersione Importante il tipo di contenitore ( a bocca larga ) e le dimensioni. Importanti le indicazioni sul recipiente (non sul coperchio) Nome, data, Numero; provenienza

20 Modi di Applicazione ( 2 ) Perfusione a circolazione chiusa in forma liquida (aldeidi) Distanza tra vasi e cellule: max. 100 microns Diffusione: penetrazione del fissativo e raggiungimento della adeguata concentrazione nel tessuto. Dipende da: rapporto di diffusione del fissativo che a sua volta dipende da: Concentrazione Temperatura Natura dl fissativo Topografia del tessuto in rapporto al fissativo Tipo di tessuto Cross Link o coagulazione Perfusione a circolazione chiusa in forma liquida (aldeidi) Distanza tra vasi e cellule: max. 100 microns Diffusione: penetrazione del fissativo e raggiungimento della adeguata concentrazione nel tessuto. Dipende da: rapporto di diffusione del fissativo che a sua volta dipende da: Concentrazione Temperatura Natura dl fissativo Topografia del tessuto in rapporto al fissativo Tipo di tessuto Cross Link o coagulazione

21 Modi di Applicazione ( 3 ) Esposizione di cellule e tessuti disidratati (liofilizzati) a fissativi in forma gassosa (aldeidi) ad elevata temperatura ( 80°c ) Usata solo per applicazioni particolari in istochimica per rivelare amine biogene ( noradrenalina, serotonina, dopamina) Esposizione di cellule e tessuti disidratati (liofilizzati) a fissativi in forma gassosa (aldeidi) ad elevata temperatura ( 80°c ) Usata solo per applicazioni particolari in istochimica per rivelare amine biogene ( noradrenalina, serotonina, dopamina)

22 Fissazione dei Tessuti Fissativi alcolici Alcool etilico 95° Alcool etilico 95° ed etere etilico anaparti Alcool metilico Alcool metilico ed acetone anaparti Lalcool di per sé, per il basso potenziale di ossidazione e per la moderata capacità di penetrazione, non è un buon fissativo per istologia ( ma è meglio di niente ); determina eccessiva coartazione ed indurimento dei tessuti, denatura le proteine e coagula grossolanamente il citoplasma; pertanto si preferisce utilizzarlo in associazione con altre componenti onde ottenere un fissativo più efficace ed omogeneo. Si è soliti ricorrere allalcool etilico 95° o allalcool etilico 50° in egual volume al materiale prelevato come prefissaggio in citologia. Fissativi alcolici Alcool etilico 95° Alcool etilico 95° ed etere etilico anaparti Alcool metilico Alcool metilico ed acetone anaparti Lalcool di per sé, per il basso potenziale di ossidazione e per la moderata capacità di penetrazione, non è un buon fissativo per istologia ( ma è meglio di niente ); determina eccessiva coartazione ed indurimento dei tessuti, denatura le proteine e coagula grossolanamente il citoplasma; pertanto si preferisce utilizzarlo in associazione con altre componenti onde ottenere un fissativo più efficace ed omogeneo. Si è soliti ricorrere allalcool etilico 95° o allalcool etilico 50° in egual volume al materiale prelevato come prefissaggio in citologia.

23 Fissazione dei Tessuti Miscele fissatrici a base di alcool: Liquido di Serra: composto da 2 parti di alcool etilico 95° ed 1 parte di formaldeide 40% cui si aggiungono poche gocce di acido acetico glaciale Liquido di Carnoy: costituito da 6 parti di alcool etilico 99°, 3 parti di cloroformio ed 1 parte di acido acetico glaciale Liquido di Clarke: composto da 3 parti di alcool etilico 99° ed 1 parte di acido acetico glaciale Formalina alcoolica di Lillie: costituita da 9 parti di alcool etilico 99° ed 1 parte di formaldeide 40% Miscele fissatrici a base di alcool: Liquido di Serra: composto da 2 parti di alcool etilico 95° ed 1 parte di formaldeide 40% cui si aggiungono poche gocce di acido acetico glaciale Liquido di Carnoy: costituito da 6 parti di alcool etilico 99°, 3 parti di cloroformio ed 1 parte di acido acetico glaciale Liquido di Clarke: composto da 3 parti di alcool etilico 99° ed 1 parte di acido acetico glaciale Formalina alcoolica di Lillie: costituita da 9 parti di alcool etilico 99° ed 1 parte di formaldeide 40%

24 Fissazione dei Tessuti Miscele fissatrici a base di acido picrico: Liquido di Bouin: composto dalla miscela di 15 parti di acido picrico in soluzione satura acquosa, 5 parti di formaldeide 40% ed 1 parte di acido acetico glaciale Liquido di Duboscq - Brasil: costituito da 150 ml di alcool etilico 80°, 60 ml di formaldeide 40%, 15 ml di acido acetico glaciale ed 1 g di acido picrico Entrambi sono fissativi molto penetranti; tuttavia, la presenza dellacido picrico e di quello acetico è di ostacolo ad eventuali indagini retrospettive e di estrazione del DNA e, inoltre, scioglie facilmente la maggior parte delle calcificazioni presenti. Miscele fissatrici a base di acido picrico: Liquido di Bouin: composto dalla miscela di 15 parti di acido picrico in soluzione satura acquosa, 5 parti di formaldeide 40% ed 1 parte di acido acetico glaciale Liquido di Duboscq - Brasil: costituito da 150 ml di alcool etilico 80°, 60 ml di formaldeide 40%, 15 ml di acido acetico glaciale ed 1 g di acido picrico Entrambi sono fissativi molto penetranti; tuttavia, la presenza dellacido picrico e di quello acetico è di ostacolo ad eventuali indagini retrospettive e di estrazione del DNA e, inoltre, scioglie facilmente la maggior parte delle calcificazioni presenti.

25 Rischi e precauzioni duso per i fissativi Formaldeide : Potenziale allergenico (cancerogenicità) per inalazione e contatto. Uso di cappe aspiranti. Alcool : Rischio incendi Glutaraldeide Ac. Picrico Sali di Mercurio Tetrossido di Osmio Importante: uso di armadi dedicati e quantità limitate. Formaldeide : Potenziale allergenico (cancerogenicità) per inalazione e contatto. Uso di cappe aspiranti. Alcool : Rischio incendi Glutaraldeide Ac. Picrico Sali di Mercurio Tetrossido di Osmio Importante: uso di armadi dedicati e quantità limitate.

26 Tempi duso per i fissativi Formaldeide 4% (= Formalina 10% ) Velocità di penetrazione = 0,5 cm in 24 Fissazione: Tempo varia a sec. delle dim. del frammento, da 3h a 24h Alcool etilico 95% : penetra lentamente nei tessuti freschi Fissazione: accettabile sono in cell. isolate e frammenti piccoli ( diam 1-2 mm) Formaldeide 4% (= Formalina 10% ) Velocità di penetrazione = 0,5 cm in 24 Fissazione: Tempo varia a sec. delle dim. del frammento, da 3h a 24h Alcool etilico 95% : penetra lentamente nei tessuti freschi Fissazione: accettabile sono in cell. isolate e frammenti piccoli ( diam 1-2 mm)

27 Tecnica di inclusione in paraffina : Si effettua di routine su campioni privi di problemi particolari, tenendo presente che, con essa, si rendono solubili e si asportano dai tessuti i grassi. La paraffina (a punto di fusione di °C) è chimicamente inattiva e conserva bene i tessuti che devono essere disidratati con immersione in alcool etilico (70°, 95° 99°) e diafanizzati con solventi della paraffina (cloroformio, benzene, toluene, xilene) prima di venire impregnati in essa e successivamente inclusi in blocchetti. In genere, il processo di inclusione avviene mediante l uso di inclusori automatici, fatti funzionare in ore notturne, e di dispensatori di paraffina, utilizzati per ottenere dei blocchetti ben compatti che contengono il tessuto pronto per essere sezionato con gli appositi microtomi. Tecnica di inclusione in paraffina : Si effettua di routine su campioni privi di problemi particolari, tenendo presente che, con essa, si rendono solubili e si asportano dai tessuti i grassi. La paraffina (a punto di fusione di °C) è chimicamente inattiva e conserva bene i tessuti che devono essere disidratati con immersione in alcool etilico (70°, 95° 99°) e diafanizzati con solventi della paraffina (cloroformio, benzene, toluene, xilene) prima di venire impregnati in essa e successivamente inclusi in blocchetti. In genere, il processo di inclusione avviene mediante l uso di inclusori automatici, fatti funzionare in ore notturne, e di dispensatori di paraffina, utilizzati per ottenere dei blocchetti ben compatti che contengono il tessuto pronto per essere sezionato con gli appositi microtomi. INCLUSIONE DEI TESSUTI

28 Disidratazione ETANOLO METANOLO ACETONE PROPANEDIOLO ETANOLO METANOLO ACETONE PROPANEDIOLO Chiarificazione XILOLO BENZOLO CLOROFORMIO XILOLO BENZOLO CLOROFORMIO

29 Inclusione Paraffina Gelatina / Agar Celloidina Resine Paraffina Gelatina / Agar Celloidina Resine Idrosolubili (Metacrilati) Idrosolubili (Metacrilati) Epossidiche

30 Congelamento dei tessuti Effetti del congelamento Metodi di congelamento Effetti del congelamento Metodi di congelamento Blocchi di metallo Produzione di Neve CO 2 Ghiaccio secco Appar. Termo-elettrici Gas liquidi (N 2 ) Blocchi di metallo Produzione di Neve CO 2 Ghiaccio secco Appar. Termo-elettrici Gas liquidi (N 2 ) Sostanze Protettive Glicerolo / DMSO Sostanze Protettive Glicerolo / DMSO METODO IDEALE FREON ISOPENTANO METODO IDEALE FREON ISOPENTANO Conservazione di tessuti e cellule

31 METODI RAPIDI Metodo T (°C) Efficienza Tessuti in liquidi refrigerati Tessuti in liquidi refrigerati Tessuti in contatto di metalli refrigerati Tessuti in contatto di metalli refrigerati Fluido organico In gas liquido (N2) Fluido organico In gas liquido (N2) Fluido organico In ghiaccio secco Liquido organico Fluido organico In ghiaccio secco Liquido organico Raffreddamento Termo-elettrico Raffreddamento Termo-elettrico Supporto metallico Raffreddato per conduzione Supporto metallico Raffreddato per conduzione a a a a b b Il più veloce Ottimale per la maggior parte delle applicazioni in M.O Ottimale per la maggior parte delle applicazioni in M.O scarsa a: N-esano, isopentano, miscele di butano e pentano b: giaccio secco in miscela con etanolo, metanolo o acetone a: N-esano, isopentano, miscele di butano e pentano b: giaccio secco in miscela con etanolo, metanolo o acetone

32 Sezionamento Microtomo Criostato Ultra-microtomiaM.E. Microtomo Criostato Ultra-microtomiaM.E. Temp. ideali per i vari tipi di tessuto Lama Tratt. delle sezioni 1) Essicamento (+ fissazione) 2) Freeze drying o altri metodi Temp. ideali per i vari tipi di tessuto Lama Tratt. delle sezioni 1) Essicamento (+ fissazione) 2) Freeze drying o altri metodi Rischio ambientale

33 Freeze – Drying (Liofilizzazione) Freeze – Drying (Liofilizzazione) Principi Applicazione ai tessuti Trattamento successivo Principi Applicazione ai tessuti Trattamento successivo Freeze – Sobstitution Condiz. di congelamento Condiz. di liofilizzazione Temp. Tempo Trappola di N 2 O Condiz. di congelamento Condiz. di liofilizzazione Temp. Tempo Trappola di N 2 O Inclusione in paraffina Fissazione in vapori

34 Tecnica di preparazione delle sezioni in paraffina, di circa 3 µ, per essere colorate : E un procedimento atto ad assicurare che la paraffina, non miscibile con acqua ed alcool, venga eliminata ed il tessuto possa essere impregnato dal colorante. Quindi è necessario utilizzare dei solventi della paraffina ed idratare gradualmente il tessuto sino all H 2 O distillata. Nel caso in cui il colorante sia in soluzione alcoolica ci si arresta all alcool 95°. Tecnica di preparazione delle sezioni in paraffina, di circa 3 µ, per essere colorate : E un procedimento atto ad assicurare che la paraffina, non miscibile con acqua ed alcool, venga eliminata ed il tessuto possa essere impregnato dal colorante. Quindi è necessario utilizzare dei solventi della paraffina ed idratare gradualmente il tessuto sino all H 2 O distillata. Nel caso in cui il colorante sia in soluzione alcoolica ci si arresta all alcool 95°. SPARAFFINATURA DELLE SEZIONI xilolo5 etanolo 100°5 etanolo 95°5 etanolo 70°5 etanolo 50°5 H 2 O distillata –– –– colorazione xilolo5 etanolo 100°5 etanolo 95°5 etanolo 70°5 etanolo 50°5 H 2 O distillata –– –– colorazione

35 Colorazione dei tessuti Composizione (Gruppi reattivi –SO 4 / = PO 4 / - COOH / - O / - S/ -NH 3 ) Tipo di colorante / pH / Solventi / Additivi Tipo di legame Composizione (Gruppi reattivi –SO 4 / = PO 4 / - COOH / - O / - S/ -NH 3 ) Tipo di colorante / pH / Solventi / Additivi Tipo di legame tra colorante e tessuto Ionico (Salino – elettrostatico) Covalenti (tra non metalli = elettroni condivisi tra due atomi) Complessi es. gruppi aldeidici R. Schiff (atomo centrale con 1 o 2 legami) es Ag. Diammina Intermolecolari (van der Waal) Ionico (Salino – elettrostatico) Covalenti (tra non metalli = elettroni condivisi tra due atomi) Complessi es. gruppi aldeidici R. Schiff (atomo centrale con 1 o 2 legami) es Ag. Diammina Intermolecolari (van der Waal)

36 Colorazione dei tessuti Colorazione di macromolecole sulla base di cariche (ioniche) Componenti tissutali Coloranti Colorazione di macromolecole sulla base di cariche (ioniche) Componenti tissutali Coloranti Basofile Acidofile Neutrofile Basofile Acidofile Neutrofile Cationici (basici) Anionici (acidi) Cationici (basici) Anionici (acidi)

37 COLORANTI : DEFINIZIONE CROMOGENO ( Luce visibile mm) Criteri di purezzaSpettro Gruppi cromofori -N -Nazoc=calkene N = O nitrosoc=ooxo N = O nitrosoc=ooxo N - O2nitro(gruppi auxocromi) N - O2nitro(gruppi auxocromi) es: -SH NOMENCLATURAcoloranti COLORANTI : DEFINIZIONE CROMOGENO ( Luce visibile mm) Criteri di purezzaSpettro Gruppi cromofori -N -Nazoc=calkene N = O nitrosoc=ooxo N = O nitrosoc=ooxo N - O2nitro(gruppi auxocromi) N - O2nitro(gruppi auxocromi) es: -SH NOMENCLATURAcoloranti NITROAZOCHINONICINITROAZOCHINONICI

38 Pratica di colorazione dei tessuti Reattivi Purezza Acqua Etichetta sui reattivi Conservazione Scarto /Scaricamento Reattivi Purezza Acqua Etichetta sui reattivi Conservazione Scarto /Scaricamento Technical quality Purified / Pure / Very pure Analytical grade Technical quality Purified / Pure / Very pure Analytical grade

39 Coloranti (Assorbimento colore osservato) Coloranti (Assorbimento colore osservato) Coloranti cationiciNuclei / Batteri pH 3-4 per la completa ionizzazione di gruppi di fosfato DNA / RNA (selettivo) es. col. GRAM Effetto di diversi fissativi / Concentrazione di sali Coloranti cationiciNuclei / Batteri pH 3-4 per la completa ionizzazione di gruppi di fosfato DNA / RNA (selettivo) es. col. GRAM Effetto di diversi fissativi / Concentrazione di sali + Cresyl-violetto + I 2 - col. Rosso = Fucsina + Cresyl-violetto + I 2 - col. Rosso = Fucsina ZIEL-NIELSEN

40 · EMATEINAossidazione di ematossilina Compl. con AL EMALLUME(Mayer - Carazzi) Compl. con AL EMALLUME(Mayer - Carazzi) Fe EMAT. HARRIS - Lillie Fe EMAT. HARRIS - Lillie · EMATEINAossidazione di ematossilina Compl. con AL EMALLUME(Mayer - Carazzi) Compl. con AL EMALLUME(Mayer - Carazzi) Fe EMAT. HARRIS - Lillie Fe EMAT. HARRIS - Lillie COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche) progressive- Differenziazione Ematossiline regressive- pH progressive- Differenziazione Ematossiline regressive- pH

41 Colorazione dei tessuti Reazione di Blocco Ossidazione -Ossidanti Riduzione Acilazione / Alchilazione (form. di derivati acidi) Saponificazione (idrolisi di derivati acidi Deaminazione Ossidazione -Ossidanti Riduzione Acilazione / Alchilazione (form. di derivati acidi) Saponificazione (idrolisi di derivati acidi Deaminazione Deboli Medi Forti Deboli Medi Forti H2O2 / I2 Ac. Perform. Permanganato H2O2 / I2 Ac. Perform. Permanganato

42 sezioni in H 2 O distillata Emallume acido di Mayer, filtrato, 7 lavare H 2 O di fonte 10 soluzione satura Li 2 CO 3 15 lavare H 2 O di fonte 10 sezioni in H 2 O distillata Emallume acido di Mayer, filtrato, 7 lavare H 2 O di fonte 10 soluzione satura Li 2 CO 3 15 lavare H 2 O di fonte 10 Eosina [0.25 %], acidificata con qualche goccia di CH 3 COOH1 lavare in H 2 O distillata2 disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) Eosina [0.25 %], acidificata con qualche goccia di CH 3 COOH1 lavare in H 2 O distillata2 disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) COLORAZIONE DI ROUTINE IN ISTOLOGIA Ematossilina - Eosina Risultati : nucleo blu scuro; citoplasma rosso

43 Colorazione con coloranti basici La colorabilità dipende da vari fattori: pH disidratazione fissazione temperatura pH disidratazione fissazione temperatura

44 Colorazione con coloranti basici Dipende da: pH della soluzione Tipo di colorante Tempo e temperatura Tampone Trattamento dopo la colorazione pH della soluzione Tipo di colorante Tempo e temperatura Tampone Trattamento dopo la colorazione Meccanismo: Aggregati di coloranti legati a gruppi acidi Legame ionico + f. van der Waal es. Blu di Toluidina Aggregati di coloranti legati a gruppi acidi Legame ionico + f. van der Waal es. Blu di Toluidina Metacromasia Visibile U.V. Visibile U.V. Alcool resist. Alcool resist

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48 PAS HCOH HCHCHCHC HCHCHCHC O O

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53 sezioni in H 2 O distillata soluzione Alcian blu 8 GX [1% in CH 3 COOH 3 %] 30 lavare in H 2 O distillata 5 contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) sezioni in H 2 O distillata soluzione Alcian blu 8 GX [1% in CH 3 COOH 3 %] 30 lavare in H 2 O distillata 5 contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) lavare in H 2 O distillata 5 disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) lavare in H 2 O distillata 5 disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA ALCIAN BLU pH 2.5 Risultati : nucleo rosso intenso; glico - proteine acide blu - verde; colorazione citoplasmatica di fondo rosa tenue

54 sezioni in H 2 O distillata alcune sezioni possono essere pre-trattate con - amilasi (diastasi) [0.1 % in PBS] a 37 °C 30 HIO 4 (acido periodico) [ % in H 2 O distillata] 15 lavare in H 2 O distillata 5 reattivo di Schiff (fucsina solforosa) lavare in metabisolfito di sodio [5 %] 2 lavare in H 2 O di fonte 15 sezioni in H 2 O distillata alcune sezioni possono essere pre-trattate con - amilasi (diastasi) [0.1 % in PBS] a 37 °C 30 HIO 4 (acido periodico) [ % in H 2 O distillata] 15 lavare in H 2 O distillata 5 reattivo di Schiff (fucsina solforosa) lavare in metabisolfito di sodio [5 %] 2 lavare in H 2 O di fonte 15 contrasto nucleare con emallume 5 lavare in H 2 O di fonte 15 disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) contrasto nucleare con emallume 5 lavare in H 2 O di fonte 15 disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA PAS (acido periodico di Schiff) e PAS Diastasi Risultati : nucleo blu scuro; glicogeno e glico- proteine neutre rosso magenta. Dopo pretrattamento con diastasi il glicogeno non si colora

55 sezioni in H 2 O distillata soluzione Alcian blu 8 GX [1% in CH 3 COOH 3 %] 30 lavare in H 2 O distillata 5 HIO 4 (acido periodico) [ % in H 2 O distillata] 15 lavare in H 2 O distillata 5 reattivo di Schiff (fucsina solforosa) lavare in metabisolfito di sodio [5 %] 2 sezioni in H 2 O distillata soluzione Alcian blu 8 GX [1% in CH 3 COOH 3 %] 30 lavare in H 2 O distillata 5 HIO 4 (acido periodico) [ % in H 2 O distillata] 15 lavare in H 2 O distillata 5 reattivo di Schiff (fucsina solforosa) lavare in metabisolfito di sodio [5 %] 2 lavare in H 2 O distillata 10 contrasto nucleare con ematossilina Carazzi 5 lavare in H 2 O di fonte 15 disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) lavare in H 2 O distillata 10 contrasto nucleare con ematossilina Carazzi 5 lavare in H 2 O di fonte 15 disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA ALCIAN - PAS (VIALLI) Risultati : nucleo blu scuro; glico - proteine acide blu - verde; glico - proteine, glicogeno e sostanze PAS+ rosso - magenta; collagene rosso; colorazione citoplasmatica di fondo rosa tenue; altre strutture giallo

56 sezioni in H 2 O distillata immergere in alcool isopropilico 60 % 5 soluzione di Oil Red O [0,5 % in 200 ml di alcool isopropilico 100°] agitata a caldo e filtrata 20 differenziare in alcool isopropilico 60° 20 lavare in H 2 O di fonte 5 eventuale colorazione nucleare con ematossilina 5 lavare in H 2 O di fonte 10 montare in glicerina e lutare sezioni in H 2 O distillata immergere in alcool isopropilico 60 % 5 soluzione di Oil Red O [0,5 % in 200 ml di alcool isopropilico 100°] agitata a caldo e filtrata 20 differenziare in alcool isopropilico 60° 20 lavare in H 2 O di fonte 5 eventuale colorazione nucleare con ematossilina 5 lavare in H 2 O di fonte 10 montare in glicerina e lutare COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA METODO DELL OIL RED O x I LIPIDI Risultati : lipidi neutri ed esteri di colesterolo rosso; fosfolipidi rosa pallido; nuclei blu - scuro

57 sezioni in H 2 O distillata immergere in alcool etilico 55 ° 5 soluzione satura di Sudan nero B in alcool etilico 55 ° 40 differenziare in alcool etilico 55° 20 lavare in H 2 O di fonte 5 montare in glicerina e lutare sezioni in H 2 O distillata immergere in alcool etilico 55 ° 5 soluzione satura di Sudan nero B in alcool etilico 55 ° 40 differenziare in alcool etilico 55° 20 lavare in H 2 O di fonte 5 montare in glicerina e lutare COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA METODO AL SUDAN NERO B x I LIPIDI Risultati : lipidi neutri blu - nero; con tale metodo si colorano anche gli steridi, gli acidi grassi, i fosfolipidi e i glicolipidi. I nuclei ed i proteoglicani acidi si colorano in bruno, tuttavia ben differenziato dal colore dei lipidi

58 sezioni in H 2 O distillata immergere in alcool etilico 70 ° 5 soluzione satura in parti eguali di Sudan III e IV miscelata in alcool etilico 70 ° ed acetone in parti eguali 10 differenziare in alcool etilico 50° 20 lavare in H 2 O di fonte 5 Emallume acido di Mayer, filtrato, 7 lavare in H 2 O di fonte 5 montare in glicerina e lutare sezioni in H 2 O distillata immergere in alcool etilico 70 ° 5 soluzione satura in parti eguali di Sudan III e IV miscelata in alcool etilico 70 ° ed acetone in parti eguali 10 differenziare in alcool etilico 50° 20 lavare in H 2 O di fonte 5 Emallume acido di Mayer, filtrato, 7 lavare in H 2 O di fonte 5 montare in glicerina e lutare COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA METODO AL SUDAN III e SUDAN IV Risultati : lipidi neutri da rosso ad arancio; nuclei blu - scuro

59 sezioni in H 2 O distillata immergere in soluzione contenente Orceina [1 g ml acido nitrico ml alcool etilico 95 °] 24 h lavare l eccesso di colorante in alcool etilico 85 ° 2 lavare H 2 O distillata 10 colorare con miscela contenente : [0.35 g Blu di alizarina acido + solfato di alluminio 10 g / 100 ml H 2 O distillata] 10 lavare H 2 O distillata 10 sezioni in H 2 O distillata immergere in soluzione contenente Orceina [1 g ml acido nitrico ml alcool etilico 95 °] 24 h lavare l eccesso di colorante in alcool etilico 85 ° 2 lavare H 2 O distillata 10 colorare con miscela contenente : [0.35 g Blu di alizarina acido + solfato di alluminio 10 g / 100 ml H 2 O distillata] 10 lavare H 2 O distillata 10 soluzione acquosa di acido fosfomolibdico [5 % ] 20 lavare H 2 O distillata 10 soluzione contenente : [Orange G 2 g + verde luce 0.2 g + CH 3 COOH 2 ml /100 ml H 2 O distillata] 10 lavare H 2 O di fonte 5 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) soluzione acquosa di acido fosfomolibdico [5 % ] 20 lavare H 2 O distillata 10 soluzione contenente : [Orange G 2 g + verde luce 0.2 g + CH 3 COOH 2 ml /100 ml H 2 O distillata] 10 lavare H 2 O di fonte 5 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA ORCEINA x FIBRE ELASTICHE Risultati : fibre elastiche bruno - rossastro; fibre muscolari e citoplasma violetto; fibre collagene e reticolari verde; eritrociti e mielina arancione; nuclei e strutture basofile blu scuro

60 sezioni in H 2 O distillata ossidare in permanganato di K ( KMnO 4 ) 5 lavare in H 2 O di fonte 5 soluzione di acido ossalico (C 2 H 2 O4) 1 lavare in H 2 O di fonte 5 mordenzare in Allume ferrico [2 %] 5 lavare in H 2 O di fonte 5 lavare in H 2 O distillata soluzione di Argento nitrato (AgNO 3 ) ammoniacale [10 %] al buio lavare in H 2 O distillata sviluppare in soluzione di formalina [10 %] 3 sezioni in H 2 O distillata ossidare in permanganato di K ( KMnO 4 ) 5 lavare in H 2 O di fonte 5 soluzione di acido ossalico (C 2 H 2 O4) 1 lavare in H 2 O di fonte 5 mordenzare in Allume ferrico [2 %] 5 lavare in H 2 O di fonte 5 lavare in H 2 O distillata soluzione di Argento nitrato (AgNO 3 ) ammoniacale [10 %] al buio lavare in H 2 O distillata sviluppare in soluzione di formalina [10 %] 3 lavare in H 2 O di fonte 5 lavare in H 2 O distillata differenziare in Cloruro oro (HAuCl 4 ) [1 %] lavare in sodio tiosolfato (Na 2 SO 2 O 3 ) [5 %] 5 lavare H 2 O di fonte 5 contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) lavare H 2 O di fonte 5 disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) lavare in H 2 O di fonte 5 lavare in H 2 O distillata differenziare in Cloruro oro (HAuCl 4 ) [1 %] lavare in sodio tiosolfato (Na 2 SO 2 O 3 ) [5 %] 5 lavare H 2 O di fonte 5 contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) lavare H 2 O di fonte 5 disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA METODO DI GOMORI PER IL RETICOLO Risultati : fibre reticolari nero; collagene ocra -bruno scuro; nuclei rosso intenso N. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette) Risultati : fibre reticolari nero; collagene ocra -bruno scuro; nuclei rosso intenso N. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)

61 sezioni in H 2 O distillata ossidare con soluzione di KMnO 4 (permanganato di K) 5 lavare H 2 O di fonte 5 soluzione di C 2 H 2 O4 (acido ossalico) 1 lavare H 2 O di fonte 5 soluzione di Weigert (resorcina - fucsina) a 60° C 120 lavare H 2 O di fonte 10 Emallume acido di Mayer, filtrato, 3 sezioni in H 2 O distillata ossidare con soluzione di KMnO 4 (permanganato di K) 5 lavare H 2 O di fonte 5 soluzione di C 2 H 2 O4 (acido ossalico) 1 lavare H 2 O di fonte 5 soluzione di Weigert (resorcina - fucsina) a 60° C 120 lavare H 2 O di fonte 10 Emallume acido di Mayer, filtrato, 3 lavare H 2 O di fonte 10 soluzione satura Li 2 CO 3 15 lavare H 2 O di fonte 10 soluzione di Van Gieson (fucsina acida [1 %] 5 ml + acido picrico 95 ml) 3 lavare H 2 O di fonte 5 disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) lavare H 2 O di fonte 10 soluzione satura Li 2 CO 3 15 lavare H 2 O di fonte 10 soluzione di Van Gieson (fucsina acida [1 %] 5 ml + acido picrico 95 ml) 3 lavare H 2 O di fonte 5 disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA ELASTIC - VAN GIESON Risultati : fibre elastiche marrone scuro - nero; collagene rosa - rosso; connettivo giallo; nuclei blu scuro

62 La M.E. utilizza il potere separatore, a brevissima lunghezza d onda, delle radiazioni elettroniche emesse dal cannone elettronico (Filamento di Tungsteno e cilindro di Wehnelt) che consentono di ottenere, in modo appropriato con lenti elettro-magnetiche, ingrandimenti lineari di x ed oltre. M.E.T. = Microscopia elettronica a trasmissione; permette di ottenere l immagine elettronica, riprodotta su lastra fotografica o su schermo fluorescente, reale ed ingrandita di una sezione di tessuto (spessa da 10 a 100 nm), i cui punti possono essere attraversati o meno da un fascio di elettroni. M.E.S. = Microscopia elettronica a scansione; permette di ottenere un perfetto esame tridimensionale della superficie di un oggetto o un pezzo anatomico o biologico, scandendo il fascio di elettroni la superficie per linee successive, come un pennello elettronico. L immagine si ottiene direttamente su tubo a raggi catodici. L ingrandimento finale è da 20 a x. Dato il potere di penetrazione molto basso degli elettroni, le sezioni devono essere ultra-sottili ( nm), fissate in Tetraossido di Osmio o in Glutaraldeide, incluse in resina e colorate con sali di metalli pesanti(acetato di Uranile e citrato di Piombo), onde aumentare il contrasto dell immagine. La M.E. utilizza il potere separatore, a brevissima lunghezza d onda, delle radiazioni elettroniche emesse dal cannone elettronico (Filamento di Tungsteno e cilindro di Wehnelt) che consentono di ottenere, in modo appropriato con lenti elettro-magnetiche, ingrandimenti lineari di x ed oltre. M.E.T. = Microscopia elettronica a trasmissione; permette di ottenere l immagine elettronica, riprodotta su lastra fotografica o su schermo fluorescente, reale ed ingrandita di una sezione di tessuto (spessa da 10 a 100 nm), i cui punti possono essere attraversati o meno da un fascio di elettroni. M.E.S. = Microscopia elettronica a scansione; permette di ottenere un perfetto esame tridimensionale della superficie di un oggetto o un pezzo anatomico o biologico, scandendo il fascio di elettroni la superficie per linee successive, come un pennello elettronico. L immagine si ottiene direttamente su tubo a raggi catodici. L ingrandimento finale è da 20 a x. Dato il potere di penetrazione molto basso degli elettroni, le sezioni devono essere ultra-sottili ( nm), fissate in Tetraossido di Osmio o in Glutaraldeide, incluse in resina e colorate con sali di metalli pesanti(acetato di Uranile e citrato di Piombo), onde aumentare il contrasto dell immagine. MICROSCOPIA ELETTRONICA

63 METODO DI PREPARAZIONE DEI CAMPIONI MICROSCOPIA ELETTRONICA METODO DI PREPARAZIONE DEI CAMPIONI taglio delle sezioni ultra-sottili con ultra-microtomo con lama di cristallo o di diamante le sezioni, di spessore appropriato, vengono raccolte su dei retini di rame circolari e di 3 mm di Ø colorare con acetato di uranile in soluzione acquosa satura 10 lavare in H 2 O distillata colorare con citrato di piombo 10 lavare in H 2 O distillata far seguire la disidratazione secondo le tecniche usuali osservare al M.E. taglio delle sezioni ultra-sottili con ultra-microtomo con lama di cristallo o di diamante le sezioni, di spessore appropriato, vengono raccolte su dei retini di rame circolari e di 3 mm di Ø colorare con acetato di uranile in soluzione acquosa satura 10 lavare in H 2 O distillata colorare con citrato di piombo 10 lavare in H 2 O distillata far seguire la disidratazione secondo le tecniche usuali osservare al M.E. fissare un frammento di 1 mm 3 in glutaraldeide [2.5 %] in buffer cacodilato o in PBS a 4 °C 2-6 h lavare in PBS (3 cambi) 10 post-fissazione in tetraossido di osmio [1.30 %] a 4 °C 2 h lavare in PBS 20 disidratare i campioni in serie ascendente di alcool 2-3 h chiarificare in toluene o in ossido di propilene 1 h resina epossidica EPON + toluene [1 : 1]RT 12 h resina epossidica EPON RT 12 h inclusione in capsule di gelatina o di plastica e polimerizzazione in stufa a 60 °C 48 h fissare un frammento di 1 mm 3 in glutaraldeide [2.5 %] in buffer cacodilato o in PBS a 4 °C 2-6 h lavare in PBS (3 cambi) 10 post-fissazione in tetraossido di osmio [1.30 %] a 4 °C 2 h lavare in PBS 20 disidratare i campioni in serie ascendente di alcool 2-3 h chiarificare in toluene o in ossido di propilene 1 h resina epossidica EPON + toluene [1 : 1]RT 12 h resina epossidica EPON RT 12 h inclusione in capsule di gelatina o di plastica e polimerizzazione in stufa a 60 °C 48 h Risultati : doppia colorazione con aumento del contrasto e maggior evidenza di particolari ultrastrutturali; immagini in bianco e nero e\o con tonalità di grigio.

64 Citologia Finalità Necessità di ottimale fissazione e colorazione delle varie componenti Modalità di preparazione Citologia Finalità Necessità di ottimale fissazione e colorazione delle varie componenti Modalità di preparazione

65 Preparati citologici Cervice uterina Urine Versamenti Bronchi Vie bilari Polmone Mammella Tiroide Linfonodi Cervice uterina Urine Versamenti Bronchi Vie bilari Polmone Mammella Tiroide Linfonodi Striscio - Spatole Citocentrifugati Striscio - Spatole Citocentrifugati Spazzolati Agoaspirati Microbiopsie

66 Citologia Automatica Strisci CitocentrifugaFiltri Millipore Centrifugazione liquidi Inclusione di sedimenti Automatica Strisci CitocentrifugaFiltri Millipore Centrifugazione liquidi Inclusione di sedimenti Analisi dimmagine Citometria di flusso Analisi dimmagine Citometria di flusso Ago Spatole Anse Ago Spatole Anse

67 Agoaspirati Sedimenti FissazioneInclusione Principali Fissativi Agoaspirati Sedimenti FissazioneInclusione Principali Fissativi Alcool Formalina Alcool Formalina O H- C H O H- C H

68 sezioni in H 2 O distillata Ematossilina di Harris, filtrata, 3 lavare H 2 O di fonte 5 soluzione alcool - acida a pH 3 (etanolo 70° + HCl) 10 lavare H 2 O di fonte 2 soluzione satura Li 2 CO 3 15 lavare H 2 O di fonte 10 soluzione di etanolo 70° 2 soluzione di etanolo 95° 2 sezioni in H 2 O distillata Ematossilina di Harris, filtrata, 3 lavare H 2 O di fonte 5 soluzione alcool - acida a pH 3 (etanolo 70° + HCl) 10 lavare H 2 O di fonte 2 soluzione satura Li 2 CO 3 15 lavare H 2 O di fonte 10 soluzione di etanolo 70° 2 soluzione di etanolo 95° 2 Colorare in Orange G 6 3 etanolo 95° (2 cambi) 20 Colorare in EA 50 3 etanolo 95° (2 cambi) 20 disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) Colorare in Orange G 6 3 etanolo 95° (2 cambi) 20 Colorare in EA 50 3 etanolo 95° (2 cambi) 20 disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA PAPANICOLAOU Risultati : nucleo blu scuro; citoplasma variante tra il blu-verdastro (basofilia) ed il rosa- arancione\rosso chiaro (eosinofilia)

69 Col. Papanicolau Vantaggi ed eventi determinanti -Definizione dei dettagli nucleari -Trasparenza citoplasmatica -Differenziaione dei vari tipi cellulari -Corretta fissazione -Buona col. Nucleare -Coloranti con sol. altamente alcooliche -Adeguata diafanizzazione -Colorazione policromatica

70 Problemi di colorazione con Papanicolau 1)Coloraz. Nucleare pallida -Insufficente rimozione di fissativi a pellicola (polietilen- glicole + alcool etilico) -azione decolorante di HCl -striscio parzialmente asciugato prima della fissazione Problemi di colorazione con Papanicolau 1)Coloraz. Nucleare pallida -Insufficente rimozione di fissativi a pellicola (polietilen- glicole + alcool etilico) -azione decolorante di HCl -striscio parzialmente asciugato prima della fissazione

71 Problemi di colorazione con Papanicolau 1)Coloraz. Nucleare pallida (2) -pH dellacqua corrente poco alcalino -colorante troppo vecchio Problemi di colorazione con Papanicolau 1)Coloraz. Nucleare pallida (2) -pH dellacqua corrente poco alcalino -colorante troppo vecchio

72 Problemi di colorazione con Papanicolau 2)Coloraz. Nucleare troppo intensa -fissazione con alcool >95% -tempo di immersione in HCl troppo breve -striscio troppo spesso che trattiene il colore (N.B. è possibile decolorare) Problemi di colorazione con Papanicolau 2)Coloraz. Nucleare troppo intensa -fissazione con alcool >95% -tempo di immersione in HCl troppo breve -striscio troppo spesso che trattiene il colore (N.B. è possibile decolorare)

73 Problemi di colorazione con Papanicolau 3)Coloraz. Citoplasmatica insoddisfacente -permanenza in alcool 70% troppo lunga = decolorazione -asciugatura dello striscio prima della fissazione = tutto rosa Problemi di colorazione con Papanicolau 3)Coloraz. Citoplasmatica insoddisfacente -permanenza in alcool 70% troppo lunga = decolorazione -asciugatura dello striscio prima della fissazione = tutto rosa

74 Problemi di colorazione con Papanicolau 3)Coloraz. Citoplasmatica insoddisfacente -striscio di alterno spessore -tempo di coloraz. scarso o non scuotimento del cestello -scarsa col. con verde luce = sostituire o pH non 4,5-5 Problemi di colorazione con Papanicolau 3)Coloraz. Citoplasmatica insoddisfacente -striscio di alterno spessore -tempo di coloraz. scarso o non scuotimento del cestello -scarsa col. con verde luce = sostituire o pH non 4,5-5

75 Problemi di colorazione con Papanicolau 4) Riscio di inquinamento e trasporto di cellule -filtrare i coloranti Problemi di colorazione con Papanicolau 4) Riscio di inquinamento e trasporto di cellule -filtrare i coloranti

76 sezioni in H 2 O distillata Giemsa puro diluito in H 2 O al [10 o 20 %] 60 differenziare in CH 3 COOH diluito (0.4 ml acido acetico glaciale \ 100 ml H 2 O) 10 lavare in H 2 O distillata differenziare in etanolo 95°, controllando al microscopio 10 arrestare la differenziazione con alcool iso-propilico 2 (3 cambi) sezioni in H 2 O distillata Giemsa puro diluito in H 2 O al [10 o 20 %] 60 differenziare in CH 3 COOH diluito (0.4 ml acido acetico glaciale \ 100 ml H 2 O) 10 lavare in H 2 O distillata differenziare in etanolo 95°, controllando al microscopio 10 arrestare la differenziazione con alcool iso-propilico 2 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) effetto Giemsa : produce una particolare colorazione viola - rossastra della cromatina del nucleo a causa dell eosinato di Azur. La soluzione di Giemsa pura è formata da eosinato di Azur II, contenente eosinato di Azur B ed eosinato di blu di metilene sciolti anaparti. chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) effetto Giemsa : produce una particolare colorazione viola - rossastra della cromatina del nucleo a causa dell eosinato di Azur. La soluzione di Giemsa pura è formata da eosinato di Azur II, contenente eosinato di Azur B ed eosinato di blu di metilene sciolti anaparti. COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA GIEMSA Risultati : DNA e RNA blu; sostanze acidofile rosso - arancio e proteo-glicani rosso - violetto * specialmente elettiva per le cellule del sangue * Risultati : DNA e RNA blu; sostanze acidofile rosso - arancio e proteo-glicani rosso - violetto * specialmente elettiva per le cellule del sangue *

77 sezioni fatte essiccare allaria post-fissazione in metanolo 15 lavare in H 2 O di fonte 5 soluzione di Giemsa puro diluito al [15 %] in buffer fosfato a pH 6.8 (22 ml 0.5 M Na 2 HPO ml 0.5 M KH 2 PO 4 / 1000 ml H 2 O distillata) 15 sezioni fatte essiccare allaria post-fissazione in metanolo 15 lavare in H 2 O di fonte 5 soluzione di Giemsa puro diluito al [15 %] in buffer fosfato a pH 6.8 (22 ml 0.5 M Na 2 HPO ml 0.5 M KH 2 PO 4 / 1000 ml H 2 O distillata) 15 lavare in H 2 O distillata (3 cambi) fare asciugare a secco chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) lavare in H 2 O distillata (3 cambi) fare asciugare a secco chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA GIEMSA modificato Risultati : DNA e RNA blu; sostanze acidofile rosso - arancio e proteo-glicani rosso - violetto (eseguito specie su strisci) Risultati : DNA e RNA blu; sostanze acidofile rosso - arancio e proteo-glicani rosso - violetto (eseguito specie su strisci)

78 sezioni in H 2 O distillata cristalvioletto o violetto di metile [1 %] scolare eccesso di colorante soluzione di Lugol 3 0 lavare in H 2 O di fonte differenziare in soluzione di alcool - acetone 20 lavare in H 2 O di fonte fucsina basica o rosso neutro [1 %] lavare in H 2 O di fonte e tamponare con carta bibula sezioni in H 2 O distillata cristalvioletto o violetto di metile [1 %] scolare eccesso di colorante soluzione di Lugol 3 0 lavare in H 2 O di fonte differenziare in soluzione di alcool - acetone 20 lavare in H 2 O di fonte fucsina basica o rosso neutro [1 %] lavare in H 2 O di fonte e tamponare con carta bibula disidratare in etanolo 100° 1 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) disidratare in etanolo 100° 1 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA GRAM Risultati : Batteri Gram + blu scuro; batteri Gram - rosso; colorazione di fondo rosa N. B. : porre attenzione alla differenziazione Risultati : Batteri Gram + blu scuro; batteri Gram - rosso; colorazione di fondo rosa N. B. : porre attenzione alla differenziazione

79 sezioni in H 2 O distillata fucsina basica [10 ml di soluzione al 10 % in etanolo 100 °] in acido fenico [+100 ml fenolo 5 % in H 2 O distillata e filtrato]; flambare le sezioni sul bunsen sino a farle fumare lavare in H 2 O distillata differenziare in soluzione alcool - acida [HCl 3% in etanolo 70°] finché le sezioni non cedono più colore lavare in H 2 O di fonte 10 sezioni in H 2 O distillata fucsina basica [10 ml di soluzione al 10 % in etanolo 100 °] in acido fenico [+100 ml fenolo 5 % in H 2 O distillata e filtrato]; flambare le sezioni sul bunsen sino a farle fumare lavare in H 2 O distillata differenziare in soluzione alcool - acida [HCl 3% in etanolo 70°] finché le sezioni non cedono più colore lavare in H 2 O di fonte 10 blu di metilene [1 % in H 2 O distillata] lavare in H 2 O di fonte disidratare in etanolo 100° sino a che le sezioni non divengono blu pallide 2 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) blu di metilene [1 % in H 2 O distillata] lavare in H 2 O di fonte disidratare in etanolo 100° sino a che le sezioni non divengono blu pallide 2 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA ZIEHL - NEELSEN (KOCH) Risultati : Bacilli alcool - acido resistenti rosso; flora batterica e tessuti vari blu N. B. : porre attenzione alla differenziazione Risultati : Bacilli alcool - acido resistenti rosso; flora batterica e tessuti vari blu N. B. : porre attenzione alla differenziazione

80 Tecnica di allestimento dei preparati citologici in celloidina : E un procedimento atto ad assicurare che tutto il materiale cellulare sia conservato durante i passaggi analitici, raccogliendo le cellule in un film di celloidina così da renderle compatte e non dispersibili. celloidina 10 % : sciogliere 10 g. di celloidina in fiocchi in 50 ml di alcool etilico 99° e poi aggiungere 50 ml di etere (conservare in recipiente di vetro ben sigillato) riempire di celloidina 10 % una provetta in propilene, svuotarla, capovolgerla per allontanarne l eccesso onde ottenerne uno strato di µ. di spessore (cell - bag) riempire la provetta di cloroformio che indurisce la celloidina e svuotarla di quest ultimo prima dell uso riempire la provetta con la sospensione cellulare, tappare e centrifugare allontanare il surnatante, estrarre delicatamente il cell - bag, ridurne le dimensioni per facilitarne l alloggiamento nelle cassettine citologiche ed includere in paraffina. Tecnica di allestimento dei preparati citologici in celloidina : E un procedimento atto ad assicurare che tutto il materiale cellulare sia conservato durante i passaggi analitici, raccogliendo le cellule in un film di celloidina così da renderle compatte e non dispersibili. celloidina 10 % : sciogliere 10 g. di celloidina in fiocchi in 50 ml di alcool etilico 99° e poi aggiungere 50 ml di etere (conservare in recipiente di vetro ben sigillato) riempire di celloidina 10 % una provetta in propilene, svuotarla, capovolgerla per allontanarne l eccesso onde ottenerne uno strato di µ. di spessore (cell - bag) riempire la provetta di cloroformio che indurisce la celloidina e svuotarla di quest ultimo prima dell uso riempire la provetta con la sospensione cellulare, tappare e centrifugare allontanare il surnatante, estrarre delicatamente il cell - bag, ridurne le dimensioni per facilitarne l alloggiamento nelle cassettine citologiche ed includere in paraffina. INCLUSIONE DELLE CELLULE

81 sezioni in H 2 O distillata Ematossilina di Harris, filtrata, 3 lavare H 2 O di fonte 5 soluzione alcool - acida a pH 3 (alcool 70° + HCl) 10 lavare H 2 O di fonte 2 soluzione satura Li 2 CO 3 15 lavare H 2 O di fonte 10 sezioni in H 2 O distillata Ematossilina di Harris, filtrata, 3 lavare H 2 O di fonte 5 soluzione alcool - acida a pH 3 (alcool 70° + HCl) 10 lavare H 2 O di fonte 2 soluzione satura Li 2 CO 3 15 lavare H 2 O di fonte 10 Eosina [0.25 %], acidificata con qualche goccia di CH 3 COOH1 lavare in H 2 O distillata2 disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) Eosina [0.25 %], acidificata con qualche goccia di CH 3 COOH1 lavare in H 2 O distillata2 disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) COLORAZIONE DI ROUTINE IN CITOLOGIA Ematossilina - Eosina Risultati : nucleo e batteri gram + blu scuro; citoplasma ed emazie rosa-rosso.

82 sezioni in H 2 O distillata ossidare le sezioni in HIO 4 [0.5 % in H 2 O distillata] 15 lavare in H 2 O distillata 5 mettere le sezioni al buio a 60 °C nella soluzione argentica pre-riscaldata (10 ml di metenammina [3 %] ml di AgNO3 [5 %] ml di Borace [5 %]) lavare in H 2 O di fonte HAuCl 4 (cloruro oro) [1 %] sezioni in H 2 O distillata ossidare le sezioni in HIO 4 [0.5 % in H 2 O distillata] 15 lavare in H 2 O distillata 5 mettere le sezioni al buio a 60 °C nella soluzione argentica pre-riscaldata (10 ml di metenammina [3 %] ml di AgNO3 [5 %] ml di Borace [5 %]) lavare in H 2 O di fonte HAuCl 4 (cloruro oro) [1 %] sodio tiosolfato [3 %] lavare in H 2 O di fonte verde di metile [1 %] disidratare in etanolo 95° 4 disidratare in etanolo 100° 4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) sodio tiosolfato [3 %] lavare in H 2 O di fonte verde di metile [1 %] disidratare in etanolo 95° 4 disidratare in etanolo 100° 4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA ARGENTO - METENAMMINA x I MICETI Risultati : miceti in nero; nucleo verde intenso

83 sezioni in H 2 O distillata soluzione Ammoniaca [2 %] in etanolo 95° overnight ossidare le sezioni in HIO 4 [0.5 % in H 2 O distillata] 15 lavare in H 2 O distillata 5 mettere le sezioni al buio a 60 °C nella soluzione argentica filtrata e pre- riscaldata : (25 ml H 2 O distillata + 2 ml di Borace [5 %] + 25 ml soluzione stock : (100 ml di metenammina [3 %] + 5 ml di AgNO3 [5 %]) controllare al microscopio lavare in H 2 O distillata 5 HAuCl 4 (cloruro oro) [0.2 %] lavare in H 2 O di fonte 5 sezioni in H 2 O distillata soluzione Ammoniaca [2 %] in etanolo 95° overnight ossidare le sezioni in HIO 4 [0.5 % in H 2 O distillata] 15 lavare in H 2 O distillata 5 mettere le sezioni al buio a 60 °C nella soluzione argentica filtrata e pre- riscaldata : (25 ml H 2 O distillata + 2 ml di Borace [5 %] + 25 ml soluzione stock : (100 ml di metenammina [3 %] + 5 ml di AgNO3 [5 %]) controllare al microscopio lavare in H 2 O distillata 5 HAuCl 4 (cloruro oro) [0.2 %] lavare in H 2 O di fonte 5 sodio tiosolfato [2 %] lavare in H 2 O distillata 5 liquido di Bouin a 60 °C 30 lavare in H 2 O di fonte 10 lavare in H 2 O distillata 5 soluzione di acido Fosfotungstico [2 %] lavare in H 2 O di fonte 10 soluzione di cromotropo 2 R : (100 ml. HCl 0.1M g. cromotropo 2 R) 15 lavare in H 2 O distillata 5 disidratare in etanolo 95° 3 disidratare in etanolo 100° 3 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione neutro sodio tiosolfato [2 %] lavare in H 2 O distillata 5 liquido di Bouin a 60 °C 30 lavare in H 2 O di fonte 10 lavare in H 2 O distillata 5 soluzione di acido Fosfotungstico [2 %] lavare in H 2 O di fonte 10 soluzione di cromotropo 2 R : (100 ml. HCl 0.1M g. cromotropo 2 R) 15 lavare in H 2 O distillata 5 disidratare in etanolo 95° 3 disidratare in etanolo 100° 3 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione neutro COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA ARGENTO - METENAMMINA - PAS Risultati : miceti in nero; membrane basali in nero; background in rosso

84 sezioni in H 2 O distillata soluzione di Lugol 5 decolorare in iposolfito di sodio [5 %] 2 lavare in H 2 O di fonte 5 lavare in H 2 O distillata soluzione Dominici (Orange G [1 %] + eritrosina [0.2 %] ml CH 3 COOH) lavare in H 2 O di fonte 5 lavare in H 2 O distillata sezioni in H 2 O distillata soluzione di Lugol 5 decolorare in iposolfito di sodio [5 %] 2 lavare in H 2 O di fonte 5 lavare in H 2 O distillata soluzione Dominici (Orange G [1 %] + eritrosina [0.2 %] ml CH 3 COOH) lavare in H 2 O di fonte 5 lavare in H 2 O distillata soluzione di blu di toluidina [0.5 %] lavare in H 2 O di fonte3 differenziare in CH 3 COOH sino a che le sezioni virano al rosa disidratare in etanolo 95° 4 disidratare in etanolo 100° 4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) soluzione di blu di toluidina [0.5 %] lavare in H 2 O di fonte3 differenziare in CH 3 COOH sino a che le sezioni virano al rosa disidratare in etanolo 95° 4 disidratare in etanolo 100° 4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA METODO DI MANN - DOMINICI Risultati : nuclei blu scuro; eritrociti giallo - arancio; connettivo rosso; granulociti eosinofili rosso; granulociti neutrofili viola; granulociti basofili blu elettivo per il tessuto emopoietico, i linfomi ed i midolli Risultati : nuclei blu scuro; eritrociti giallo - arancio; connettivo rosso; granulociti eosinofili rosso; granulociti neutrofili viola; granulociti basofili blu elettivo per il tessuto emopoietico, i linfomi ed i midolli

85 sezioni in H 2 O distillata soluzione contenente Orceina acetica [ 2 %] ( 90 ml CH 3 COOH puro + 2 g orceina ml H 2 O distillata 30 lavare in CH 3 COOH [45 %] 1 lavare in alcool butilico terziario 2 soluzione di xilolo ed alcool butilico terziario 1 : 1 2 chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) sezioni in H 2 O distillata soluzione contenente Orceina acetica [ 2 %] ( 90 ml CH 3 COOH puro + 2 g orceina ml H 2 O distillata 30 lavare in CH 3 COOH [45 %] 1 lavare in alcool butilico terziario 2 soluzione di xilolo ed alcool butilico terziario 1 : 1 2 chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) COLORAZIONE IN CITO-GENETICA METODO ALL ORCEINA ACETICA COLORAZIONE IN CITO-GENETICA METODO ALL ORCEINA ACETICA Risultati : i cromosomi si colorano in rosso - porpora una variante con l aggiunta di fast green e ripetuti ed accurati passaggi in alcool a vario grado è utilizzata per identificare la cromatina sessuale che si colora in rosso ed il citoplasma in verde chiaro. Risultati : i cromosomi si colorano in rosso - porpora una variante con l aggiunta di fast green e ripetuti ed accurati passaggi in alcool a vario grado è utilizzata per identificare la cromatina sessuale che si colora in rosso ed il citoplasma in verde chiaro.

86 Microscopia a fluorescenza Fluorescenza Illuminazione con luce a breve Emissione nel visibile Illuminazione con luce a breve Emissione nel visibile Filtri Fluoroforo (Fluorocromo) Fosforescenza Filtri Fluoroforo (Fluorocromo) Fosforescenza Eccitazione / Sbarramento Caratt. Spettro di Assorbimento Caratt. Spettro di Emissione Caratt. Spettro di Assorbimento Caratt. Spettro di Emissione Piccole quantità

87 Tipi di Fluorescenza Autofluorescenza O Fluorescenza indotta - Amine biogane + C carboline H N Fluorocromi - effetto QUENCNING- vantaggi caratteristici DNA ACRIDINE ORANGE (verde) RNA Rosso METACROMASIA concentrazione polimeri 1 maggiore A.O.CitologiaMETACROMASIA MASCHERATA Autofluorescenza O Fluorescenza indotta - Amine biogane + C carboline H N Fluorocromi - effetto QUENCNING- vantaggi caratteristici DNA ACRIDINE ORANGE (verde) RNA Rosso METACROMASIA concentrazione polimeri 1 maggiore A.O.CitologiaMETACROMASIA MASCHERATA - fibre elastiche- LIPOFUSCINE - NADH 2 - Porfirine - Vit. A - Farmaci - fibre elastiche- LIPOFUSCINE - NADH 2 - Porfirine - Vit. A - Farmaci Tetracicline Adriamicina Chinacrine Benzopirene Tetracicline Adriamicina Chinacrine Benzopirene

88 Reagenti di SCHIFFFluorescentiALDEIDI FUCSINA BASICA (para-rosanilina) Tioflarina T AMILOIDEPROCION yellow cellule (neuroni) BANDEGGIO CROMOSOMICO COL. SOPRAVITALE cell sorting Reagenti di SCHIFFFluorescentiALDEIDI FUCSINA BASICA (para-rosanilina) Tioflarina T AMILOIDEPROCION yellow cellule (neuroni) BANDEGGIO CROMOSOMICO COL. SOPRAVITALE cell sorting IMMUNOFLUORESCENZALampade Problemi di DECADENZAFOTOGRAFIA Liq. di montaggio VETRI IMMUNOFLUORESCENZALampade Problemi di DECADENZAFOTOGRAFIA Liq. di montaggio VETRI XENON MERCURIO XENON MERCURIO

89 Gruppi reattivi dimostrabili su sezioni Importanza in patologia diagnostica Acidi Nucleici Coloraz. con coloranti basici Valutazione Quantitativa (Microspettrofotometria) Controlli con trattamento enzimatico (RNAsi - DNAsi) Reaz. Di FEULGEN Coloraz. con coloranti basici Valutazione Quantitativa (Microspettrofotometria) Controlli con trattamento enzimatico (RNAsi - DNAsi) Reaz. Di FEULGEN M.O. Ordinaria M. Fluorescenza (Acridina Orange) Metacromasia M.O. Ordinaria M. Fluorescenza (Acridina Orange) Metacromasia

90 Metodi per la dimostrazione di acidi nucleici Metodi per la dimostrazione di acidi nucleici · Metodi qualitativi quantitativi quantitativi · Interesse in patologiaVIRUS · Distribuzione del DNA · Met. Feulgen · Metodi qualitativi quantitativi quantitativi · Interesse in patologiaVIRUS · Distribuzione del DNA · Met. Feulgen

91 CROMO-GALLOCIANINA CROMO-GALLOCIANINA Reaz. di FEULGEN Reaz. di FEULGEN per legame purina - Desossiriboso Idrolisi acidaFormaz. di gr. aldeidici Frammentazione del DNA ConcentrazioneHClTemperatura CROMO-GALLOCIANINA CROMO-GALLOCIANINA Reaz. di FEULGEN Reaz. di FEULGEN per legame purina - Desossiriboso Idrolisi acidaFormaz. di gr. aldeidici Frammentazione del DNA ConcentrazioneHClTemperatura Sensibilità Specificità di - reazione - localizzazione Sensibilità Specificità di - reazione - localizzazione COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)

92

93 sezioni in H 2 O distillata idrolisi in HCl 1 N a 60 °C per un tempo ottimale in relazione al fissativo usato da 4 a 25 (usare anche HCl 5 N a RT) (10) lavare in HCl 1 N freddo e poi in H 2 O distillata reattivo di Schiff lavare in metabisolfito di sodio [5 %] 2 lavare in H 2 O di fonte 15 sezioni in H 2 O distillata idrolisi in HCl 1 N a 60 °C per un tempo ottimale in relazione al fissativo usato da 4 a 25 (usare anche HCl 5 N a RT) (10) lavare in HCl 1 N freddo e poi in H 2 O distillata reattivo di Schiff lavare in metabisolfito di sodio [5 %] 2 lavare in H 2 O di fonte 15 contrasto citoplasmatico con verde luce [1 %] 1 lavare in H 2 O di fonte 2 disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) contrasto citoplasmatico con verde luce [1 %] 1 lavare in H 2 O di fonte 2 disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA FEULGEN reazione Risultati : il DNA si colora in modo elettivo in rosso magenta; citoplasma verde

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96 Metodi per la dimostrazione di acidi nucleici Metodi per la dimostrazione di acidi nucleici · Metodi qualitativi quantitativi quantitativi · Interesse in patologiaVIRUS · Distribuzione del DNA · Met. Feulgen · Metodi qualitativi quantitativi quantitativi · Interesse in patologiaVIRUS · Distribuzione del DNA · Met. Feulgen

97 Valutazione quantitativa Principi Variazione di assorbimento Lunghezza donda Principi Variazione di assorbimento Lunghezza donda Cell Luce

98 Metodi alternativi BRDU TIMIDINA TRIZIATA - Ibridizzazione in situ - Immunocitochimica - Autoradiografia - Citofluorimetria cell sorter cell sorterBRDU TIMIDINA TRIZIATA - Ibridizzazione in situ - Immunocitochimica - Autoradiografia - Citofluorimetria cell sorter cell sorter Laser

99 Autoradiografia Principi Potere di risoluzione Stripping Emulsione Marcatori H 3 / P4 / S Principi Potere di risoluzione Stripping Emulsione Marcatori H 3 / P4 / S

100 Tempo di Esposizione Principi (Conteggio granuli / fondo) Principi (Conteggio granuli / fondo) Timidina H 3 Ibridizzazione in situ Legame di affinità Timidina H 3 Ibridizzazione in situ Legame di affinità

101 Ibridizzazione in situ (ISH) Dimostrazione di geni su cromosomi (FISH) mRNA specifico - gene espressione (vantaggi rispetto a ICC) RNA / DNA virale Metodi- Sonde Dimostrazione di geni su cromosomi (FISH) mRNA specifico - gene espressione (vantaggi rispetto a ICC) RNA / DNA virale Metodi- Sonde Riboprobes Oligos Riboprobes Oligos Marcatura - Raidoatt. Auto-radiografia Non radioatt. Marcatura - Raidoatt. Auto-radiografia Non radioatt. Biotina Digoxiganina Fluorescina Biotina Digoxiganina Fluorescina ICC - S - H - pH - S - H - pH

102 Questa tecnica consente di identificare specifiche sequenze di DNA ed RNA e di rivelare in quali cellule tali sequenze sono espresse. La metodica si basa sulla capacità della doppia elica del DNA di dissociarsi (quando riscaldata a °C, o esposta ad ambiente basico a pH 13)[DENATURAZIONE] per poi ricostituirsi, partendo da due singole eliche complementari [IBRIDIZZAZIONE]. Se una delle due emieliche è marcata, si può rendere visibile l avvenuta ibridizzazione di doppie eliche neoformate costituite da probe e da acidi nucleici ad esso complementari. La marcatura del DNA avviene chimicamente per inserzione di un gruppo sulfone in 5 sull anello della Citosina che reagisce con un AbMc anti-sulfone, e quindi con un 2° Ab coniugato a fosfatasi alcalina (N.B. : inibire la fosfatasi alcalina endogena con esposizione ad 80° C x 5). Il trattamento con DNasi e\o RNasi elimina la comparsa di positività, mentre quello con solo uno dei due enzimi evidenzia selettivamente un unico tipo di acido nucleico. Questa tecnica consente di identificare specifiche sequenze di DNA ed RNA e di rivelare in quali cellule tali sequenze sono espresse. La metodica si basa sulla capacità della doppia elica del DNA di dissociarsi (quando riscaldata a °C, o esposta ad ambiente basico a pH 13)[DENATURAZIONE] per poi ricostituirsi, partendo da due singole eliche complementari [IBRIDIZZAZIONE]. Se una delle due emieliche è marcata, si può rendere visibile l avvenuta ibridizzazione di doppie eliche neoformate costituite da probe e da acidi nucleici ad esso complementari. La marcatura del DNA avviene chimicamente per inserzione di un gruppo sulfone in 5 sull anello della Citosina che reagisce con un AbMc anti-sulfone, e quindi con un 2° Ab coniugato a fosfatasi alcalina (N.B. : inibire la fosfatasi alcalina endogena con esposizione ad 80° C x 5). Il trattamento con DNasi e\o RNasi elimina la comparsa di positività, mentre quello con solo uno dei due enzimi evidenzia selettivamente un unico tipo di acido nucleico. IBRIDIZZAZIONE IN SITU I S H IBRIDIZZAZIONE IN SITU I S H

103 Ibridizzazione in situ (ISH) Problemi Esami genico su singole cellule prelevate da sezioni (necessità di identificazione del tipo di cellule) Problemi Esami genico su singole cellule prelevate da sezioni (necessità di identificazione del tipo di cellule) Sensibilità Localizzazione (Definizione) Conservazione strutturale Sensibilità Localizzazione (Definizione) Conservazione strutturale Sistemi laser / catapulta

104 sezioni in H 2 O distillata trattare in soluzione di Lugol 10 lavare in H 2 O distillata 5 mettere le sezioni al buio a 60 °C nella soluzione argentica pre-riscaldata (10 ml di metenammina [3 %] ml di AgNO3 [5 %] ml di Borace [5 %]) o h. al buio RT lavare in H 2 O di fonte HAuCl 4 (cloruro oro) [1 %] sezioni in H 2 O distillata trattare in soluzione di Lugol 10 lavare in H 2 O distillata 5 mettere le sezioni al buio a 60 °C nella soluzione argentica pre-riscaldata (10 ml di metenammina [3 %] ml di AgNO3 [5 %] ml di Borace [5 %]) o h. al buio RT lavare in H 2 O di fonte HAuCl 4 (cloruro oro) [1 %] sodio tiosolfato [3 %] lavare in H 2 O di fonte contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) disidratare in etanolo 95° 4 disidratare in etanolo 100° 4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) sodio tiosolfato [3 %] lavare in H 2 O di fonte contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) disidratare in etanolo 95° 4 disidratare in etanolo 100° 4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA METODO DI GOMORI PER LA MELANINA Risultati : granuli di melanina nero; cheratina arancio; nuclei rosso intenso

105 sezioni in H 2 O distillata soluzione di Ferrocianuro di K [10 %] 5 soluzione di Ferrocianuro K [10 %] + HCl [10 %] (70 ml + 30 ml) 25 lavare H 2 O di fonte 5 lavare H 2 O distillata contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) sezioni in H 2 O distillata soluzione di Ferrocianuro di K [10 %] 5 soluzione di Ferrocianuro K [10 %] + HCl [10 %] (70 ml + 30 ml) 25 lavare H 2 O di fonte 5 lavare H 2 O distillata contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) lavare H 2 O di fonte 5 disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) lavare H 2 O di fonte 5 disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA PERLS x IL FERRO Risultati : i depositi di ferro si colorano in blu; i nuclei in rosso intenso N. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette) Risultati : i depositi di ferro si colorano in blu; i nuclei in rosso intenso N. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)

106 sezioni in H 2 O distillata soluzione di lavoro di Rhodanina [0.3 % in etanolo 100°] (6 ml / 100 ml H 2 O distillata) a 60° C lavare H 2 O di fonte 5 lavare H 2 O distillata contrasto nucleare con ematossilina Carrazzi 1 lavare H 2 O distillata sezioni in H 2 O distillata soluzione di lavoro di Rhodanina [0.3 % in etanolo 100°] (6 ml / 100 ml H 2 O distillata) a 60° C lavare H 2 O di fonte 5 lavare H 2 O distillata contrasto nucleare con ematossilina Carrazzi 1 lavare H 2 O distillata lavare in soluzione di Borace [0.5 %] (tetraborato di sodio) 2 lavare H 2 O distillata disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) lavare in soluzione di Borace [0.5 %] (tetraborato di sodio) 2 lavare H 2 O distillata disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA PER IL RAME Risultati : depositi di rame color rosa - rosso; nuclei blu scuro

107 sezioni in H 2 O distillata soluzione acquosa di AgNO 3 (nitrato Argento) [3 %] 60 sviluppare in una soluzione di idrochinone [0.5 %] 3 lavare H 2 O di fonte 5 fissare in una soluzione di tiosolfato di sodio [5 %] 3 lavare H 2 O di fonte 5 lavare H 2 O distillata sezioni in H 2 O distillata soluzione acquosa di AgNO 3 (nitrato Argento) [3 %] 60 sviluppare in una soluzione di idrochinone [0.5 %] 3 lavare H 2 O di fonte 5 fissare in una soluzione di tiosolfato di sodio [5 %] 3 lavare H 2 O di fonte 5 lavare H 2 O distillata contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) lavare H 2 O di fonte 5 disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) lavare H 2 O di fonte 5 disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA METODO DI Von KOSSA x IL CALCIO Risultati : sali di calcio (fosfati e carbonati) nero; nuclei rosso intenso N. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette) Risultati : sali di calcio (fosfati e carbonati) nero; nuclei rosso intenso N. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)

108 sezioni in H 2 O distillata soluzione di lavoro secondo Fouchet : (acido Tricloroacetico (C 2 HCl 3 O 2 ) [25 %](50 ml) + Cloruro ferrico (FeCl 3 ) [10 %]( 5 ml) lavare H 2 O distillata soluzione di Van Gieson (fucsina acida [1 %] 5 ml + acido picrico 95 ml) 3 sezioni in H 2 O distillata soluzione di lavoro secondo Fouchet : (acido Tricloroacetico (C 2 HCl 3 O 2 ) [25 %](50 ml) + Cloruro ferrico (FeCl 3 ) [10 %]( 5 ml) lavare H 2 O distillata soluzione di Van Gieson (fucsina acida [1 %] 5 ml + acido picrico 95 ml) 3 lavare H 2 O distillata disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) lavare H 2 O distillata disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA DI FOUCHET x LA BILE Risultati : biliverdina color verde; collagene rosa - rosso; connettivo giallo

109 sezioni in H 2 O distillata soluzione di Luxol Fast Blue 2 G [0.1 % in alcool isopropilico] 60 disidratare in alcool isopropilico assoluto 5 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) sezioni in H 2 O distillata soluzione di Luxol Fast Blue 2 G [0.1 % in alcool isopropilico] 60 disidratare in alcool isopropilico assoluto 5 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) Tale colorazione, sebbene poco specifica per i fosfolipidi, li colora in modo soddisfacente, specie se disciolti in alcool isopropilico e quindi fornisce ottima colorazione della mielina integra (costituita dalla membrana cellulare della cellula di Schwann). COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA LUXOL FAST BLUE Risultati : la mielina appare in blu

110 PREPARAZIONE SOLUZIONI sol. A : Naftolo AS-D Cloroacetato [10 mg.] + Dimetilformamide [1 ml.] sol. B : buffer fosfato0.1 M [30 ml.] sol. C : Pararosanilina - HCl : Pararosanilina idrocloride [2 g.] + HCl 2n [50 ml] (sciogliere a caldo, raffreddare e filtrare) sol. D : Sodio Nitrato [400 mg.] + H 2 O distillata [10 ml.] sol. E : working Pararosanilina - HCl : sol. C [0.4 ml.] + sol. D [0.4 ml.] PREPARAZIONE SOLUZIONI sol. A : Naftolo AS-D Cloroacetato [10 mg.] + Dimetilformamide [1 ml.] sol. B : buffer fosfato0.1 M [30 ml.] sol. C : Pararosanilina - HCl : Pararosanilina idrocloride [2 g.] + HCl 2n [50 ml] (sciogliere a caldo, raffreddare e filtrare) sol. D : Sodio Nitrato [400 mg.] + H 2 O distillata [10 ml.] sol. E : working Pararosanilina - HCl : sol. C [0.4 ml.] + sol. D [0.4 ml.] sezioni in H 2 O distillata soluzione substrato : ( 0.8 ml. sol. E + 30 ml. sol. B; sistemare il pH a 6.3 e aggiungere la sol. A; mescolare e f iltrare) lavare con H 2 O distillata5 Emallume acido di Mayer, filtrato, 5 lavare H 2 O di fonte 10 soluzione satura Li 2 CO 3 15 lavare H 2 O di fonte 10 disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in resina sintetica sezioni in H 2 O distillata soluzione substrato : ( 0.8 ml. sol. E + 30 ml. sol. B; sistemare il pH a 6.3 e aggiungere la sol. A; mescolare e f iltrare) lavare con H 2 O distillata5 Emallume acido di Mayer, filtrato, 5 lavare H 2 O di fonte 10 soluzione satura Li 2 CO 3 15 lavare H 2 O di fonte 10 disidratare in etanolo 95°4 disidratare in etanolo 100°4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in resina sintetica COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA ISTOCHIMICA - ENZIMATICA : CLORO - ACETATO ESTERASI COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA ISTOCHIMICA - ENZIMATICA : CLORO - ACETATO ESTERASI Risultati : lattività enzimatica dell esterasi appare in rosa - rosso; i nuclei in blu - scuro

111 CONSIDERARE OGNI CAMPIONE BIOLOGICO COME POTENZIALMENTE INFETTO SOTTOPORSI ALLE PRINCIPALI VACCINAZIONI USARE CAMICI, GUANTI, CALZARI E MASCHERE PROTETTIVE USARE GUANTI ED OCCHIALI APPOSITI NEL MANEGGIARE AZOTO LIQUIDO USARE GUANTI ANTI-TAGLIO AL MICROTOMO E AL CRIOSTATO USARE CAPPE DI ASPIRAZIONE CON FILTRI SPECIFICI PER FORMALDEIDE E PER XILENE USARE GUANTI E LAME MONOUSO PER DISSEZIONE USARE MASSIMA CAUTELA NELL IMPIEGO DI ULTRA- CENTRIFUGHE, FORNO A MICROONDE, AUTOCLAVE, STIRRER ED APPARECCHIATURE ELETTRICHE DA LABORATORIO IN GENERE EVITARE DI CONTAMINARE IL PROPRIO POSTO DI LAVORO E TENERLO IL PIU PULITO POSSIBILE CONTROLLARE PERIODICAMENTE IL SISTEMA ANTI-INCENDIO, I SISTEMI DI ALLARME GAS E L ACCESSO ALLE VIE DI FUGA OSSERVARE CORRETTA VENTILAZIONE E RICAMBIO ARIA LOCALI NON FUMARE E NON CONSERVARE O CONSUMARE CIBI IN LABORATORIO CONSIDERARE OGNI CAMPIONE BIOLOGICO COME POTENZIALMENTE INFETTO SOTTOPORSI ALLE PRINCIPALI VACCINAZIONI USARE CAMICI, GUANTI, CALZARI E MASCHERE PROTETTIVE USARE GUANTI ED OCCHIALI APPOSITI NEL MANEGGIARE AZOTO LIQUIDO USARE GUANTI ANTI-TAGLIO AL MICROTOMO E AL CRIOSTATO USARE CAPPE DI ASPIRAZIONE CON FILTRI SPECIFICI PER FORMALDEIDE E PER XILENE USARE GUANTI E LAME MONOUSO PER DISSEZIONE USARE MASSIMA CAUTELA NELL IMPIEGO DI ULTRA- CENTRIFUGHE, FORNO A MICROONDE, AUTOCLAVE, STIRRER ED APPARECCHIATURE ELETTRICHE DA LABORATORIO IN GENERE EVITARE DI CONTAMINARE IL PROPRIO POSTO DI LAVORO E TENERLO IL PIU PULITO POSSIBILE CONTROLLARE PERIODICAMENTE IL SISTEMA ANTI-INCENDIO, I SISTEMI DI ALLARME GAS E L ACCESSO ALLE VIE DI FUGA OSSERVARE CORRETTA VENTILAZIONE E RICAMBIO ARIA LOCALI NON FUMARE E NON CONSERVARE O CONSUMARE CIBI IN LABORATORIO SICUREZZA IN LABORATORIO

112 RISCHIO BIOLOGICO : TUBERCOLOSI; BATTERI PIOGENI PER AEROSOL; VIRUS EPATITE - HBV - HCV-; HIV (AIDS); INFEZIONI DA LEGIONELLA E DA BLASTOMYCES; DERMATITI. RISCHIO CHIMICO : ESPOSIZIONE A FORMALDEIDE (oltre 1 ppm) e\o GLUTARALDEIDE; ESPOSIZIONE TOSSICA VERSO SOLVENTI ORGANICI (Xilene, Toluene, Benzene, Cloroformio, Alcool....); ESPOSIZIONE VERSO AMINE AROMATICHE(principali coloranti : ponceau,verde luce, fast red, sudan IV, blu toluidina ); ESPOSIZIONE VERSO LA DAB (benzidina - derivato); ESPOSIZIONE VERSO I METACRILATI (resine per inclusione in M.E., tossiche e corrosive); ESPOSIZIONE ALLERGICA VERSO IL LATTICE. RISCHIO NUCLEARE : ESPOSIZIONE VERSO ISOTOPI RADIOATTIVI USATI NEL MARCARE I PROBES ( 3 H, 14 C, 45 Ca, 32 P, 90 Sr, 35 S, 131 I). RISCHIO FISICO : PUNTURE, TAGLI, LACERAZIONI ED ABRASIONI CUTANEE(nell uso del microtomo o nella dissezione in sala anatomica); ESPLOSIONI ED INCENDI ACCIDENTALI (nella preparazione di reattivi o nello stoccaggio degli alcool), ATTI DOLOSI E CADUTE ACCIDENTALI. RISCHIO BIOLOGICO : TUBERCOLOSI; BATTERI PIOGENI PER AEROSOL; VIRUS EPATITE - HBV - HCV-; HIV (AIDS); INFEZIONI DA LEGIONELLA E DA BLASTOMYCES; DERMATITI. RISCHIO CHIMICO : ESPOSIZIONE A FORMALDEIDE (oltre 1 ppm) e\o GLUTARALDEIDE; ESPOSIZIONE TOSSICA VERSO SOLVENTI ORGANICI (Xilene, Toluene, Benzene, Cloroformio, Alcool....); ESPOSIZIONE VERSO AMINE AROMATICHE(principali coloranti : ponceau,verde luce, fast red, sudan IV, blu toluidina ); ESPOSIZIONE VERSO LA DAB (benzidina - derivato); ESPOSIZIONE VERSO I METACRILATI (resine per inclusione in M.E., tossiche e corrosive); ESPOSIZIONE ALLERGICA VERSO IL LATTICE. RISCHIO NUCLEARE : ESPOSIZIONE VERSO ISOTOPI RADIOATTIVI USATI NEL MARCARE I PROBES ( 3 H, 14 C, 45 Ca, 32 P, 90 Sr, 35 S, 131 I). RISCHIO FISICO : PUNTURE, TAGLI, LACERAZIONI ED ABRASIONI CUTANEE(nell uso del microtomo o nella dissezione in sala anatomica); ESPLOSIONI ED INCENDI ACCIDENTALI (nella preparazione di reattivi o nello stoccaggio degli alcool), ATTI DOLOSI E CADUTE ACCIDENTALI. RISCHI AMBIENTALI IN LABORATORIO

113 ARTEFATTI ISTOLOGICI Definizione Difetti o anomalie dei tessuti, da riferire non ad un processo naturale (fisiologico o patologico) ma allintroduzione di materiali estranei, a procedure non corrette di fissazione, inclusione, sezionamento, colorazione, montaggio dei vetrini. E importante riconoscere gli artefatti, per evitare di interpretarli (e diagnosticarli) come un processo patologico o una malattia del paziente. Definizione Difetti o anomalie dei tessuti, da riferire non ad un processo naturale (fisiologico o patologico) ma allintroduzione di materiali estranei, a procedure non corrette di fissazione, inclusione, sezionamento, colorazione, montaggio dei vetrini. E importante riconoscere gli artefatti, per evitare di interpretarli (e diagnosticarli) come un processo patologico o una malattia del paziente.

114 ARTEFATTI ISTOLOGICI 1)Artefatti causati prima del prelievo: 1.1. Polvere di talco 1.2. Materiale di sutura 1.3. Effetto da termocauterio 1.4. Effetto da agenti chimici 1.5. Particelle di carbone 6. Garza 1.7. Essicamento 1)Artefatti causati prima del prelievo: 1.1. Polvere di talco 1.2. Materiale di sutura 1.3. Effetto da termocauterio 1.4. Effetto da agenti chimici 1.5. Particelle di carbone 6. Garza 1.7. Essicamento

115 ARTEFATTI ISTOLOGICI 2) Artefatti causati nellintervallo tra il prelievo ed il trattamento istologico 2.1. Effetti di schiacciamento 2.2. Essiccazione 2.3. Congelamento 2.4. Chinatura 2.5. Introduzione di materiali estranei quali grani di polvere 2) Artefatti causati nellintervallo tra il prelievo ed il trattamento istologico 2.1. Effetti di schiacciamento 2.2. Essiccazione 2.3. Congelamento 2.4. Chinatura 2.5. Introduzione di materiali estranei quali grani di polvere

116 ARTEFATTI ISTOLOGICI 3) Artefatti durante la fissazione 3.1. Autolisi durante la fissazione 3.2. Fissazione inadeguata o incompleta 3.3. Effetti da fissazione con Fiss. di Zenker (coartazione) 3.4. Deposito di cristalli di Sublimato mercurico 3.5. Effetti di estrazione da fissazione in formalina 3.6. Depositi di Emateina acida da fiss. in formalina 3) Artefatti durante la fissazione 3.1. Autolisi durante la fissazione 3.2. Fissazione inadeguata o incompleta 3.3. Effetti da fissazione con Fiss. di Zenker (coartazione) 3.4. Deposito di cristalli di Sublimato mercurico 3.5. Effetti di estrazione da fissazione in formalina 3.6. Depositi di Emateina acida da fiss. in formalina

117 ARTEFATTI ISTOLOGICI 4)Artefatti legati a procedure di inclusione 4.1. Inadeguata fissazione 4.2. Inadeguata disidratazione 4.3. Presenza di residui di liquidi chiarificanti 4.4. Inadeguata infiltrazione di paraffina 4.5. Uso di paraffina troppo calda 4)Artefatti legati a procedure di inclusione 4.1. Inadeguata fissazione 4.2. Inadeguata disidratazione 4.3. Presenza di residui di liquidi chiarificanti 4.4. Inadeguata infiltrazione di paraffina 4.5. Uso di paraffina troppo calda

118 ARTEFATTI ISTOLOGICI 5) Artefatti legati alle procedure dinclusione 5.1. Inclusione di frammenti multipli di diversa durezza 5.2. Orientamento scorretto dei frammenti 5.3. Prolungata esposizione a paraffina sciolta 5) Artefatti legati alle procedure dinclusione 5.1. Inclusione di frammenti multipli di diversa durezza 5.2. Orientamento scorretto dei frammenti 5.3. Prolungata esposizione a paraffina sciolta

119 ARTEFATTI ISTOLOGICI 6)Artefatti da sezionamento erroneo 6.1. Angolo di taglio sbagliato 6.2. Lama o blocchetto mal fissati (effetto tende alla veneziana) 6.3. Lame poco affilate 6.4. Raccolta di frammenti di tessuto anomalo pesci 6)Artefatti da sezionamento erroneo 6.1. Angolo di taglio sbagliato 6.2. Lama o blocchetto mal fissati (effetto tende alla veneziana) 6.3. Lame poco affilate 6.4. Raccolta di frammenti di tessuto anomalo pesci

120 ARTEFATTI ISTOLOGICI 7) Errori nella raccolta delle sezioni sui vetrini 7.1. Contaminazione dei vetri da muffe o pollini 7.2. Uso di quantità eccessive di adesivo 7.3. Raccolta di frammenti di altri blocchetti 7.4. Pieghe nelle sezioni 7.5. Bolle daria sotto le sezioni 7.6. Uso di acqua troppo calda per stendere le sezioni 7) Errori nella raccolta delle sezioni sui vetrini 7.1. Contaminazione dei vetri da muffe o pollini 7.2. Uso di quantità eccessive di adesivo 7.3. Raccolta di frammenti di altri blocchetti 7.4. Pieghe nelle sezioni 7.5. Bolle daria sotto le sezioni 7.6. Uso di acqua troppo calda per stendere le sezioni

121 ARTEFATTI ISTOLOGICI 8) Artefatti da colorazione I 8.1. Mancata sparaffinatura 8.2. Effetti di bolle tra sezione e vetro 8.3. Sbagli nella colorazione con: 8.4. Ematossilina di Harris 8.5. Emallume di Mayer 8.6. Eosina 8.7. Imperfetta disidratazione prima del montaggio 8) Artefatti da colorazione I 8.1. Mancata sparaffinatura 8.2. Effetti di bolle tra sezione e vetro 8.3. Sbagli nella colorazione con: 8.4. Ematossilina di Harris 8.5. Emallume di Mayer 8.6. Eosina 8.7. Imperfetta disidratazione prima del montaggio

122 ARTEFATTI ISTOLOGICI 8) Artefatti da colorazione II Sbagli nelle colorazioni speciali: 8.5. PAS 8.6. PAS-diastasi 8.7. Rosso Congo 8.8. Giemsa 8.9. Feulgen Metenamina-argento per i funghi 8) Artefatti da colorazione II Sbagli nelle colorazioni speciali: 8.5. PAS 8.6. PAS-diastasi 8.7. Rosso Congo 8.8. Giemsa 8.9. Feulgen Metenamina-argento per i funghi

123 ARTEFATTI ISTOLOGICI 9) Errori nel montaggio con coprioggetto 9.1. Contaminazione del liquido di montaggio 9.2. Uso di coprioggetto troppo piccoli 9.3. Erroneo posizionamento del vetrino 9.4. Intrappolamento di bolle daria 9.5. Montante troppo abbondante 9.6. Montante troppo scarso 9) Errori nel montaggio con coprioggetto 9.1. Contaminazione del liquido di montaggio 9.2. Uso di coprioggetto troppo piccoli 9.3. Erroneo posizionamento del vetrino 9.4. Intrappolamento di bolle daria 9.5. Montante troppo abbondante 9.6. Montante troppo scarso

124 ARTEFATTI IN CITOLOGIA c.1.) Errori nella raccolta delle cellule c.1.1. Cellule sovrapposte c.1.2. Cellule troppo rade c.1.3. Eccessiva quantità di sangue c.1.4. Mancato uso di adesivo c.1.5. Effetto da citocentrifuga c.1.6. Contaminazione batterica (nelle urine) c.1.7. Stiramento delle cellule per compressione c.1.) Errori nella raccolta delle cellule c.1.1. Cellule sovrapposte c.1.2. Cellule troppo rade c.1.3. Eccessiva quantità di sangue c.1.4. Mancato uso di adesivo c.1.5. Effetto da citocentrifuga c.1.6. Contaminazione batterica (nelle urine) c.1.7. Stiramento delle cellule per compressione

125 ARTEFATTI IN CITOLOGIA c.2.) Errori nella fissazione delle cellule c.2.1. Effetti di essiccamento prima della fissazione (nella col. di Papanicolau) c.2.2. Effetti di essiccamento troppo lento (nella col. di Giemsa) c.2.) Errori nella fissazione delle cellule c.2.1. Effetti di essiccamento prima della fissazione (nella col. di Papanicolau) c.2.2. Effetti di essiccamento troppo lento (nella col. di Giemsa)

126 ARTEFATTI IN CITOLOGIA c.3) Errori nella colorazione delle cellule con la col. di Papanicolau c.3.1. Col. Nucleare troppo debole c.3.2. Col. Nucleare troppo intensa c.3.3. Col. con Orange G troppo debole c.3.4. Col. con Orange G troppo intensa c.3.5. Col. con Verde luce troppo debole c.3.6. Col. con Verde luce troppo intensa c.3) Errori nella colorazione delle cellule con la col. di Papanicolau c.3.1. Col. Nucleare troppo debole c.3.2. Col. Nucleare troppo intensa c.3.3. Col. con Orange G troppo debole c.3.4. Col. con Orange G troppo intensa c.3.5. Col. con Verde luce troppo debole c.3.6. Col. con Verde luce troppo intensa

127 ARTEFATTI IN CITOLOGIA c.4) Errori nel montaggio con coprioggetto c.4.1. Contaminazione del liquido di montaggio c.4.2. Uso di coprioggetto troppo piccoli c.4.3. Erroneo posizionamento del vetrino c.4.4. Intrappolamento di bolle daria c.4.5. Montante troppo abbondante c.4.6. Montante troppo scarso c.4) Errori nel montaggio con coprioggetto c.4.1. Contaminazione del liquido di montaggio c.4.2. Uso di coprioggetto troppo piccoli c.4.3. Erroneo posizionamento del vetrino c.4.4. Intrappolamento di bolle daria c.4.5. Montante troppo abbondante c.4.6. Montante troppo scarso


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