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MATERIALI POLIMERICI BIOMIMETICI COME SISTEMI PER IL RILASCIO DI FARMACI VERSO SPECIFICHE CELLULE MITOTICHE Individuazione dei segnali biochimici e dei.

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1 MATERIALI POLIMERICI BIOMIMETICI COME SISTEMI PER IL RILASCIO DI FARMACI VERSO SPECIFICHE CELLULE MITOTICHE Individuazione dei segnali biochimici e dei recettori cellulari che consentono ai materiali con funzione di drug-carrier di controllare il rilascio verso cellule specifiche Descrizione delle strategie seguite per la realizzazione di un efficiente rilascio mirato Individuazione di nuove metodologie per la preparazione e la funzionalizzazione di polimeri biomimetici, bioerodibili e non, in forma particellare contenenti i principi attivi

2 INTERAZIONI CELLULA-MATERIALE Interazioni non-specifiche: proprietà superficiale della cellula (carica negativa della membrana); Proteine di membrana Proteine ECM (extracellular) che mediano l’adesione non specifica alle superfici polimeriche Interazioni specifiche: Interazioni con strutture chimiche definite es. ligando- recettore- Maggior controllo Un materiale biomimetico è un materiale che mima un sistema biologico nell’indurre una proprietà desiderata (esclusi farmaci e biomateriali di origine naturale)

3 LIGANDI DI RECETTORI, MOLECOLE SEGNALE CHE SI LEGANO AD UN SITO SPECIFICO DEL RECETTORE INTEGRABILI NEL MATERIALE FINALE Primi sistemi biomimetici: La molecola bersaglio è il sito di legame dell’integrina I materiali contengono la sequenza RGD (Arginina- Glicina- Acido Aspartico) esposta sulla superficie Altri materiali sono preparati legando alla loro superficie alcuni fattori extracellulari chiamati citochine che favoriscono la moltiplicazione ed il differenziamento di molti tipi di cellule. Ciò consente di mirare ai recettori di cellule specifiche coinvolte nei processi di proliferazione o differenziazione (Mann et al., 2001)

4 SEGNALI DI FATTORI MORFOGENICI E MITOGENICI influenzano altri processi come la motilità, il differenziamento e la proliferazione delle cellule molecole bioattive per lo sviluppo di materiali biomimetici : fattori di crescita polipeptidi che dirigono le attività cellulari attraverso un complesso sistema di segnali a cascata coinvolti nella proliferazione, migrazione, differenziamento, adesione cellulare, espressione genica per ciascun tipo di fattore di crescita c’è uno specifico recettore o una classe di recettori che sono espressi sulla superficie di alcune cellule

5 RECETTORI TIROSINA CHINASI La più importante famiglia di recettori per i fattori di crescita e di differenziazione sono i recettori tirosina chinasi (RTK) –il ligando determina la dimerizzazione del recettore e la sua attività chinasica. Autofosforilazione di residui presenti nel loro dominio citosolico e fosforilazione di varie proteine substrato –recettori tirosina chinasi: per VEGF, FGF, EGF, IGF-I e molti altri.

6 CELLULE ENDOTELIALI-VASCOLARI (VEGF) Coinvolto nell’angiogenesi: svolge una specifica attività mitogenica nei confronti delle cellule endoteliali derivate da arterie, vene, vasi linfatici. VEGF come candidato ideale per favorire la rigenerazione tessutale dipendente dall’angiogenesi. formazione di nuovi vasi sanguigni che penetrano nella massa tumorale e la nutrono: 1.degradazione della lamina basale che circonda un capillare poco distante dalle cellule tumorali, 2.migrazione delle cellule endoteliali della parete interna del capillare nel tumore 3.divisione di queste cellule endoteliali e formazione di una nuova membrana basale attorno al capillare in formazione. Molte cellule tumorali secernono fattori di crescita che stimolano l’angiogenesi; altre c. inducono la sintesi e la secrezione di tali fattori nelle cellule normali circostanti. proteine naturali che inibiscono l’angiogenesi l’angiogenina e l’endostatina o antagonisti del recettore del VEGF come agenti terapeutici per impedire l’accrescimento di molti tumori. Mentre durante lo sviluppo embrionale continuamente si formano nuovi vasi sanguigni, nell’adulto normalmente se ne formano pochi, di conseguenza un inibitore specifico dell’angiogenesi potrebbe avere limitati effetti collaterali.

7 FATTORE DI CRESCITA DEI FIBROBLASTI (FGF) FGFs inducono attività mitogenica, chemiotattica e angiogenica ruolo molto importante nello sviluppo embrionale e nella riparazione dei tessuti a differenza del VEGF, sono fattori pleiotropici controllano anche effetti non apparentemente correlati e agiscono su diversi tipi cellulari: cellule endoteliali, cellule muscolari lisce, fibroblasti ed alcuni tipi di cellule epiteliali.

8 ENDOCITOSI processo biologico che consente alle cellule di assorbire materiale particellare dal mezzo esterno, attraverso la formazione di vescicole lipidiche derivate dalla membrana plasmatica attivare tale meccanismo utilizzando un materiale biomimetico significa aumentare la capacità di rilasciare più efficientemente farmaci o DNA all’interno della cellula endocitosi mediata da recettore: ligandi extrac. si legano a specifici recettori della superficie della cellula e sono internalizzati, con i loro recettori, all’interno di vescicole rivestite da clatrina.

9 RILASCIO MIRATO (DRUG TARGETING) sviluppo di sistemi a rilascio di farmaci verso specifici organi, tessuti o cellule Con i metodi di somministrazione in uso l’agente farmacologico risulta distribuito quasi uniformemente in tutto il corpo. il farmaco per raggiungere il sito di azione deve attraversare molte barriere biologiche: altri organi, c. e compartimenti intrac., dove può essere inattivato. il raggiungimento della conc. terapeutica nel target comporta la somministrazione di farmaco in quantità elevata, a compensare perdite nei normali tessuti, con effetti tossici a livello sistemico.

10 RILASCIO MIRATO (DRUG TARGETING) Il rilascio mirato (drug targeting) può rappresentare la soluzione a questi problemi. drug targeting : capacità di concentrare il farmaco in organi o tessuti in maniera selettiva e quantitativa, indipendentemente dal sito e metodo di somministrazione. vantaggi: i protocolli di somministrazione possono essere semplificati, la quantità di farmaco può essere ridotta, così come il costo della terapia e la concentrazione di farmaco nel sito target può essere aumentata senza effetti indesiderati nei tessuti sani.

11 RILASCIO MIRATO tre componenti: il farmaco, l’unità targeting capace del riconoscimento selettivo e un carrier usato per aumentare il numero di molecole di farmaco per singola unità targeting. carriers farmaceutici : polimeri solubili, microparticelle, microcapsule, cellule, lipoproteine, liposomi e micelle. schemi di rilascio mirato : 1.applicazione diretta del farmaco, 2.targeting di tipo passivo, fisico, magnetico, 3.targeting di tipo attivo; uso di molecole con elevata affinità verso la zona affetta

12 APPLICAZIONE DIRETTA DEL FARMACO rilascio mirato ottenuto semplicemente tramite somministrazione del farmaco direttamente nella regione affetta (organo o tessuto). Esempi : somministrazione intra-articolare di farmaci ormonali nella cura di artriti (A. S. Williams et al., 1996) o infusione intracoronarica di enzimi trombolitici nella cura di infarto del miocardio indotto da trombi (I. E. Chazov et al., 1976). possibilità di applicazione di questo metodo diretto piuttosto limitate.

13 TARGETING PASSIVO accumulo di farmaco o sistema a rilascio di farmaco causato da particolari condizioni anatomiche. aumento della permeabilità dell’endotelio vascolare o effetto EPR (Enhanced Permeability and Retention) in tumori solidi e danneggiamento delle pareti vasali in seguito ad angioplastica. In queste regioni con aumentata permeabilità vascolare anche particelle relativamente grandi come micelle e liposomi di diametro nm possono accumularsi negli spazi interstiziali. particelle caricate con farmaci opportuni si può avere rilascio del farmaco nella zona d’interesse terapeutico per degradazione del carrier. cutoff dimensionale per la penetrazione interstiziale variabile, parametro selettivo alla base del targeting passivo è la dimensione delle particelle caricate con il farmaco. requisito fondamentale: permanenza delle particelle in circolo per il tempo necessario a garantirne l’accumulo nell’organo bersaglio. Liposomi caricati con farmaci antitumorali e ricoperti di polietilen glicol per eludere il RES (sistema reticolo endoteliale) hanno mostrato ottimi risultati nella terapia dei tumori (V. P. Torchilin et al.,1996).

14 TARGETING FISICO targeting fisico: le regioni affette da patologie possono differire dai tessuti sani in alcune caratteristiche chimico-fisiche come T e/o pH. regioni con infiammazioni e presenza di neoplasie mostrano spesso acidosi e ipertermia. Ciò rende possibile l’uso di carrier in grado di rilasciare il farmaco a valori di pH inferiori o temperature più elevate rispetto a quelle dei normali tessuti. Esempi di liposomi a rilascio di farmaci sensibili alla temperatura e al pH

15 TARGETING MAGNETICO Un rilascio mirato dovuto a forze esterne di natura fisica è il trasporto di farmaco per orientamento magnetico. farmaco disperso in un carrier particellare con proprietà ferromagnetiche, dovute alla presenza nella matrice polimerica di derivati a base di alluminio, nickel, cobalto, rame, argento, manganese o platino. dopo somministrazione intravenosa le particelle sono dirette verso il target mediante azione di un campo magnetico extracorporeo applicato in corrispondenza dell’organo bersaglio. La capacità di concentrare le particelle magnetiche in una specifica regione dipende dal flusso sanguigno nella stessa e dall’intensità del campo magnetico esterno.

16 USO DI UNITÀ TARGETING Spesso la regione malata non differisce molto dai normali tessuti in termini di permeabilità vascolare, temperatura o valore di pH locale. Per il rilascio mirato mediante orientamento magnetico ci sono limiti legati alla portata di flusso sanguigno nel target. per dotare di affinità verso il target un farmaco non specifico è possibile legare il farmaco stesso con un’unità (molecola segnale) capace di riconoscimento specifico e legame con il sito target. unità targeting sono: anticorpi e loro frammenti, proteine, lipoproteine, ormoni, mono-, oligo-, polisaccaridi e alcuni ligandi a basso peso molecolare come il folato.

17 SISTEMA TARGET : LEGAME DEL FARMACO CON LA MOLECOLA SEGNALE carriers solubili e insolubili, caricati con molte unità attive e coniugati con l’unità targeting, Il processo chimico di coniugazione deve mantenere la struttura originale del farmaco (affinché non venga persa l’attività terapeutica) e l’attività biologica dell’unità targeting, responsabile della specifica interazione ligando-recettore in vivo. Schema di preparazione di un sistema di targeting utilizzando un carrier polimerico

18 SISTEMI A RILASCIO MIRATO Mirati a vari compartimenti del corpo e patologie: 1.componenti del sistema cardiovascolare (sangue, pareti vascolari, cuore), 2.sistema reticolo endoteliale (fegato, milza), 3. sistema linfatico (linfonodi e vasi linfatici), 4. tumori, infiammazioni, infezioni. parametri che determinano l’efficacia di un sistema a rilascio mirato 1.dimensioni del target, 2.flusso sanguigno attraverso il target 3.numero di unità targeting per molecola di farmaco

19 ESEMPIO DI UN SISTEMA CONIUGATO PER RILASCIO MIRATO sistema polimerico bioconiugato per il targeting di cellule tumorali (Z. R. Lu) interazione specifica di un frammento di anticorpo monoclonale legato a un’unità metacrilica (MA-Fab’) con l’antigene OA-3 espresso nella maggior parte dei tumori ovarici.

20 SCHEMA DELLA STRUTTURA DELLA SPECIE MA-FAB ’ Frammenti MA-Fab’ copolimerizzati con N-(2- idrossipropil)metacrilammide e un’unità strutturale contenente il farmaco usando come spaziatore segmenti di poli(etilenglicol)

21 RILASCIO MIRATO La reattività di MA-Fab’ nella reazione di copolim. è influenzata dalla lunghezza dello spaziatore, ovvero dalla distanza tra il doppio legame reattivo e il frammento con elevato ingombro sterico. Il sistema ha mostrato una buona attività antitumorale in modelli animali. polimeri biocompatibili possono essere utilizzati come carriers solubili carriers insolubili comprendono: microparticelle, nanoparticelle, liposomi, micelle

22 MICROSFERE E NANOSFERE I sistemi microparticellari, cioè liposomi, microparticelle e nanoparticelle, anche se possono avere forma e dimensioni simili, si differenziano tra loro per la natura del materiale di cui sono costituiti. Microsfere: qualsiasi sistema di natura particellare contenente all’interno un materiale solido, liquido, gassoso. microsfere di interesse biomedico: 5 nm - 2  m e matrice polimerica di origine sintetica, semisintetica o naturale al cui interno è presente un principio farmacologicamente attivo.

23 MICROSFERE E NANOSFERE Microparticelle: entità relativamente rigide, distinguibili da sistemi elastici come cellule e liposomi, anche se non sempre la distinzione è netta Nanosfere: microsfere aventi dimensioni inferiori a 1  m microsfera omogenea: farmaco disciolto nella microsfera microsfera monolitica: farmaco finemente disperso nella matrice polimerica microsfera a riserva: farmaco in forma di nucleo interno immerso in una matrice polimerica

24 MICROSFERE E NANOSFERE Per controllare la velocità di rilascio del farmaco dalla particella, la microsfera può essere rivestita esternamente da uno strato di materiale polimerico (microsfera a doppia parete) di caratteristiche diverse da quello costituente la matrice interna. La velocità di rilascio del farmaco dalla particella dipende dalla diffusione del farmaco attraverso le maglie del reticolo polimerico. Se il materiale polimerico è bioerodibile, la cinetica di rilascio del farmaco dalla particella dipende principalmente da un fenomeno di erosione: dissoluzione e/o degradazione chimica o biochimica del polimero a contatto con i fluidi biologici.

25 MICROSFERE E NANOSFERE Le particelle con dimensioni  m, una volta introdotte nell’organismo, sono identificate come corpi estranei dal sistema immunitario e vengono rapidamente captate sia dalle cellule del sistema reticolo endoteliale (RES) che da parte dei leucociti polimorfonucleati del sistema immunitario. Tale fenomeno avviene soprattutto a livello del fegato e può rappresentare un vantaggio, qualora il sito di azione del farmaco sia rappresentato proprio da tali cellule. Al fine di ridurre il fenomeno di captazione da parte del RES la superficie della microsfera viene modificata mediante formazione di un legame chimico covalente oppure mediante un processo di adsorbimento. I materiali più utilizzati a questo scopo sono tensioattivi idrofilici, polimeri di natura idrofila quali poli(etilenglicol) e copolimeri a blocchi etilenglicol/propilenglicol (poloxamer), mono ed oligosaccaridi (J. K. Vasir et al., 2005).

26 LIPOSOMI strutture di natura sferica costituite da uno o più strati lipidici concentrici delimitanti internamente una fase acquosa. i liposomi si distinguono in vescicole multilamellari (strati lipidici concentrici separati l’uno dall’altro da uno strato di acqua) e vescicole unilamellari (per sonicazione delle vescicole multilamellari ) vescicole unilamellari costituite da un singolo strato lipidico esterno che racchiude internamente un nucleo acquoso. Il farmaco viene aggiunto durante la procedura di preparazione dei liposomi.

27 LIPOSOMI La struttura del materiale lipidico rappresentata da una “testa” polare e da una “coda” apolare. La struttura del doppio strato rispecchia la dualità nella struttura chimica del lipide, le teste polari completamente idratate e le code apolari dirette internamente a formare una sottile fase oleosa. I lipidi più utilizzati sono i fosfolipidi, tensioattivi naturali costituiti da monoesteri fosforici del glicerolo esterificato con due acidi grassi, saturi e/o insaturi, a atomi di carbonio.

28 LIPOSOMI I liposomi in vivo possono rilasciare il farmaco mediante tre meccanismi diversi: Fusione del liposoma con la membrana cellulare: il contenuto del liposoma viene rilasciato all’interno della cellula Endocitosi del liposoma: anche in questo caso il farmaco viene liberato nella cellula per interazione diretta della vescicola con la membrana cellulare. Assorbimento attraverso la membrana cellulare: il contenuto del liposoma viene diffuso attraverso la membrana cellulare. Le caratteristiche dei liposomi caricati analoghe a quelle delle microsfere. L’impiego di liposomi permette di mantenere livelli plasmatici di farmaco sufficientemente costanti per periodi prolungati. I liposomi, come le microsfere vengono captati dal RES. Liposomi costituiti da lipidi contenenti residui saccaridici, quali monosialoganglioside e fosfatidilinositolo, sembrano non essere riconosciuti dalle cellule del RES Anche la modifica superficiale del liposoma con polimeri idrofili, ad esempio poli(etilenglicol), può portare ad una stabilizzazione sterica verso la cattura da parte del RES

29 ERITROCITI MODIFICATI come sistemi di rilascio di varie sostanze, farmaci, enzimi, acidi nucleici e geni per il fegato e la milza. gli eritrociti sono rimossi dal circolo dopo circa 120 giorni dalla loro formazione e vengono distrutti proprio a livello di questi organi. Messe a punto metodologie per l’intrappolamento di farmaci all’interno degli eritrociti con una resa variabile 3,8 % - l’80%. osmosi, elettroporazione e endocitosi indotta da farmaci. Il principio di base è comune a tutti i metodi e si basa sulle caratteristiche di elasticità della membrana. OSMOSI: Eritrociti prelevati da un donatore vengono posti in un ambiente ipotonico, che induce la formazione nella membrana cellulare di pori aventi diametro Å, passaggio di sostanze, anche di elevato peso molecolare come le proteine, all’interno della cellula. successiva chiusura dei pori per contatto degli eritrociti così modificati con un ambiente isotonico a 37°C. il trattamento descritto non compromette né le proprietà morfologiche, biochimiche e immunologiche degli eritrociti né la loro sopravvivenza in circolo.

30 ERITROCITI MODIFICATI incapsulamento di farmaci non diffusibili negli eritrociti umani basata su due diluizioni ipotoniche consecutive seguite da una fase di concentrazione con emofiltro e risigillamento finale (apparecchiatura“red cell loader”). I metodi basati sull’osmosi sono stati applicati con successo per l’incapsulamento, in eritrociti di vari mammiferi e anche umani, di lipidi, di enzimi, di farmaci peptidici e di altre sostanze (Millan et al., 2004) elettroporazione, esposizione degli eritrociti ad un forte campo elettrico esterno, efficace per l’incapsulamento di idrogenasi alcoliche e aldeidiche e di farmaci come il diclofenac sodico (Lizano et al., 2001). metodo di endocitosi indotta da farmaco si basa sulla capacità di alcuni farmaci come l’idrocortisone e la cloropromazina di indurre la loro internalizzazione nel globulo rosso mediante la formazione di vescicole di membrana (Schrier at al., 1992).

31 ERITROCITI MODIFICATI eritrociti come drug carrier: rilascio di farmaci chemioterapici verso le cellule responsabili o capaci di eritrofagocitosi, localizzate nel RES, per il trattamento dei tumori epatici. esempi di farmaci incapsulati negli eritrociti contro il RES: actinomicina D, metatroxate, doxorubicina e bleomicina. Nel caso degli eritrociti con metotrexate, sono stati condotti studi per aumentare l’indirizzamento specifico di questi carrier verso i distretti del RES. In particolare la membrana degli eritrociti è stata sottoposta a trattamenti sia con glutaraldeide per aumentare la sua stabilità sia con il succinimidil-estere (NHS) della biotina per rendere gli eritrociti modificati più rapidamente riconoscibili dai macrofagi sia in vitro che in vivo (Mishra et al., 2002). La funzionalizzazione con biotina è uno dei metodi più efficaci per legare in maniera covalente, alla superficie dei globuli rossi, anticorpi specifici diretti contro antigeni presenti nel tessuto bersaglio.

32 MOLECOLE SEGNALE Attualmente tutti i tentativi di rilascio mirato attivo prevedono l’impiego di varie e differenti molecole segnale (targets e ligandi) che possono indirizzare il sistema contenente il farmaco verso specifiche cellule del corpo. Targets per le strategie di drug targeting si può agire a tre livelli principali: - 1) Recettori. La presenza di recettori sulla membrana consente di potenziare il rilascio mirato non solo indirizzando i sistemi di drug-carrier verso singole cellule bersaglio, ma anche facilitandone il trasferimento all’interno delle stesse, mediante endocitosi mediata da recettore –recettori per l’acido folico;

33 una delle strategie più di successo nella terapia tumorale è il targeting dell’acido folico ai sistemi di rilascio di farmaci specifici per i tumori. L’acido folico è una vitamina a basso peso molecolare che si lega specificatamente ai recettori del folato (FR) che si trovano sulla superficie delle cellule tumorali. Gli FR sono sovra-espressi sulla superficie di cellule cancerose nel caso di neoplasie epiteliali come quelle ovariche, colorettali e del seno mentre sono espressi a livelli bassi nei tessuti normali. L’acido folico è un composto stabile, poco costoso, non immunogenico ed ha un’alta affinità con il recettore della superficie cellulare.

34 METODICHE DI FUNZIONALIZZAZIONE I materiali biomimetici possono essere preparati secondo differenti procedure. Uno dei metodi consiste nella sintesi “de novo” di tutti i componenti comprese le molecole segnale della cellula. La realizzazione di un materiale biomimetico può avvenire alternativamente mediante assemblaggio dei diversi componenti; le molecole che sono impiegate come segnali per l’identificazione delle cellule costituiscono una porzione del materiale, al quale vengono legate, mediante gruppi funzionali presenti sul polimero. Ciò consente di legare le molecole bioattive alla superficie del materiale dopo aver processato il polimero nella sua forma finale.

35 CONIUGAZIONE MEDIANTE CARBODIIMMIDE Le carbodiimidi appartengono alla classe degli agenti reticolanti a lunghezza zero, in quanto inducono la formazione di legami senza la necessità di introdurre atomi addizionali o spaziatori. la loro applicazione è possibile sia in solventi acquosi sia in solventi organici Le carbodiimidi sono generalmente usate per attivare gruppi carbossilato mediante la formazione di intermedi altamente reattivi di O- acilisourea (Tabella 2a). Queste specie attive possono reagire con nucleofili amminici formando legami ammidici stabili. Le carbodiimidi solubili in acqua come l’1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)- carbodiimide cloridrato (EDC) favoriscono la reazione di coniugazione acquosa di molecole targeting a polimeri solubili in acqua. Esempi di coniugazione mediante carbodiimide riportati in letteratura sono: a) l’anticorpo T 101 direttamente coniugato alla poli- l-lisina (PLL) (Merwin et al., 1995), b) l’acido folico legato covalentenemente al poli (aminopolietilenglicol) cianoacrilato-6-esadecilcianoacrilato)( Stella at al., 2000), c) l’acido folico legato a gruppi ossidrilici terminali del blocco di polietilenglicol (PEG) nel copolimero di PLL-co-PEG (Lee et al., 2003).

36 AMMINAZIONE RIDUTTIVA L’amminazione riduttiva consiste in una reticolazione a lunghezza zero tra componenti aldeidici e amminici che forma legami amidici stabili senza introdurre ossidrili addizionali. I carboidrati nativi contengono gruppi aldeidici come agenti riducenti e possono essere direttamente accoppiati con molecole contenenti ammine portando alla formazione di un intermedio noto come base di Schiff. scarsa efficienza per la ridotta concentrazione di strutture aperte in soluzione acquosa rispetto alla concentrazione della forma emiacetalica ciclica. i carboidrati spesso contengono gruppi ossidrilici su atomi di carbonio adiacenti che possono essere ossidati a gruppi aldeidici reattivi usando il periodato di sodio (Bobbitt, 1956). Carboidrati come il galattosio sono stati direttamente legati alla polietilenimmina (PEI) mediante ammidazione riduttiva, mentre la transferrina (una glicoproteina) è stata ossidata usando il metodo di ossidazione del periodato prima della coniugazione con la componente amminica del PLL (Wagner et al, 1991).

37 POLIMERI PER LA PREPARAZIONE DI NANOPARTICELLE DESTINATE AL RILASCIO DI FARMACO Copolimeri a blocchi a base di poliacrilati Nanoparticelle rivestite con PEG sono state preparate mediante precipitazione del copolimero poli(amminoetilenglicol)cianoacrilato- co-esadecil cianoacrilato) (poli(H 2 NPEGGCA-co-HDCA)) di nuova sintesi. l’NHS estere dell’acido folico è stato selettivamente attaccato al gruppo terminale del blocco idrofilico PEG delle nanoparticelle preformate a base di poli(H 2 NPEGGCA-co-HDCA). Molecole di DNA sono state incapsulate all’interno delle nanoparticelle mediante la tecnica di evaporazione del solvente acqua-olio- acqua e la transferrina è stata attaccata al gruppo terminale amminico delle catene di PEG via ammidazione riduttiva, definendo in tal modo un potenziale sistema di rilascio di geni terapeutici alle cellule bersaglio. preparazione di nanoparticelle reticolate con una morfologia core-shell che le rende innovative come sistema biocompatibile a lento rilascio di farmaco. Nanoparticelle a base di acido poliacrilico-b-poliisoprene

38 MOLECULAR IMPRINTING funzionalizzazione dei carrier polimerici alternativa a quella che prevede l’impiego dei processi chimici di coniugazione precedentemente descritti. Si tratta, in breve, di utilizzare la tecnologia ad impronta molecolare per realizzare materiali polimerici dotati di siti di riconoscimento specifici e selettivi nei confronti di determinati recettori o mediatori delle cellule bersaglio con l’obiettivo di ottenere efficienti sistemi di drug targeting attivo

39 POLIMERI A IMPRONTA MOLECOLARE Il concetto del riconoscimento molecolare ebbe le sue origini negli anni ’30 nel campo dell’immunologia con gli studi di Breinl, Haurowitz e Mudd, successivamente elaborati da Pauling, sulla costituzione degli anticorpi (Ramstrom, 1996). Secondo la loro teoria, la specificità dei complessi anticorpo- antigene era dovuta all’interazione tra i gruppi funzionali dell’anticorpo e dell’antigene durante la formazione dell’anticorpo stesso: ogni unità strutturale dell’anticorpo sarebbe stata scelta e orientata all’atto della sintesi per adattarsi alla configurazione locale della superficie dell’antigene. Sebbene queste teorie si siano rivelate inesatte, hanno contribuito, a partire dagli anni ’70, allo sviluppo della tecnologia dell’imprinting molecolare, con la quale è possibile introdurre in un materiale polimerico siti di riconoscimento per determinate specie attraverso la polimerizzazione del monomero in presenza della molecola di interesse, chiamata template, oppure sciogliendo il polimero preformato in una soluzione che la contiene.

40 POLIMERI A IMPRONTA MOLECOLARE In entrambi i casi, i gruppi funzionali del monomero (o polimero) e del template si dispongono nello spazio secondo una precisa orientazione che viene mantenuta dal polimero anche dopo la rimozione del template e in questo modo il sito di riconoscimento costituisce una ”memoria” selettiva del polimero nei confronti del template. Da una parte l’entità di tali interazioni dovrebbe essere piuttosto forte, per dare origine a una struttura stabile anche nelle operazioni successive alla polimerizzazione, dall’altra il template dovrebbe essere rimosso in modo semplice e veloce (flessibilità della matrice).

41 POLIMERI A IMPRONTA MOLECOLARE Queste interazioni possono essere covalenti, come nelle ricerche di G. Wulff, 1995, oppure non covalenti, ad esempio di natura ionica, metallica o ponti a idrogeno, studiate da Andersson et al., 1996: entrambe le scelte offrono numerose possibilità di applicazione, ma i successi maggiori si sono avuti nel secondo caso, per la varietà di interazioni che possono essere impiegate e la flessibilità che ne deriva, mentre il maggior vantaggio offerto dalle interazioni covalenti è la precisione con cui i gruppi funzionali sono fissati nello spazio.

42 POLIMERI A IMPRONTA MOLECOLARE La principale difficoltà nell’uso di legami covalenti è la bassa velocità di riassorbimento del template riscontrata sperimentalmente, tanto che è indicato impiegarli quando è possibile accelerarla con l’utilizzo di opportuni catalizzatori. La velocità di rimozione e di formazione dei legami dopo l’estrazione è assai più rapida nel caso di interazioni non covalenti, mentre l’apparente debolezza di questi legami è superata grazie all’elevato numero dei gruppi funzionali che agiscono simultaneamente.

43 PREPARAZIONE DI UN MATERIALE POLIMERICO CON LA TECNOLOGIA DELL’IMPRINTING MOLECOLARE procedura in tre fasi.: I fase: formazione delle interazioni tra i gruppi funzionali del monomero e del template, che saranno responsabili del successivo riconoscimento del template stesso da parte del polimero; miscelamento del polimero e del template, nel caso di polimero già sintetizzato. II fase: polimerizzazione del monomero in presenza del template, che prevede l’utilizzo di un agente reticolante ad elevata concentrazione in modo da avere un polimero rigido e insolubile; per un polimero preformato, il solvente viene eliminato e quello che resta è il polimero contenente il template. III fase: rimozione del template dal polimero, che diventa una matrice in cui restano le “impronte” dei gruppi funzionali del template per il legame selettivo della molecola del template.

44 SCELTA DEL SISTEMA AD IMPRONTA MOLECOLARE La scelta del sistema deve esser condotta tenendo conto di alcune considerazioni : deve formarsi un complesso tra monomero e template che deve mantenersi stabile anche durante il processo di polimerizzazione, così come deve essere possibile il miscelamento omogeneo tra polimero e template; deve essere possibile la rimozione del template dal polimero in quantità apprezzabili; la reazione di riassorbimento del template dopo la sua estrazione deve essere veloce; Queste condizioni sono fortemente legate alle caratteristiche della matrice polimerica, in particolare: a)la rigidità permette la conservazione della forma dei siti di riconoscimento anche dopo l’estrazione del template, garantendo così un’alta selettività, b)la buona flessibilità, in contrasto con la rigidità suddetta, è essenziale per la cinetica di rilegame del template, c)la morfologia della matrice polimerica deve rendere accessibile il maggior numero possibile di siti di riconoscimento, d)la resistenza meccanica è fondamentale in molte applicazioni, e)la stabilità termica rende possibile l’impiego del polimero anche ad alte temperature, alle quali la cinetica di rilegame è favorita.

45 I COMPONENTI DEI MIP come template sono stati usati con successo amminoacidi (fenilalanina, tirosina), carboidrati (galattosio, glucosio), proteine (ureasi), ormoni (cortisolo), pesticidi (atrazina), coenzimi e farmaci (teofillina, morfina) come monomeri i più adatti sono risultati gli acidi carbossilici (acido acrilico, acido metacrilico, acido vinilbenzoico) e come polimeri quelli corrispondenti. gli agenti reticolanti hanno la funzione di dare rigidità al polimero per mantenere la configurazione assunta in presenza del template, in modo che i gruppi funzionali situati lungo la catena polimerica conservino l’orientazione voluta. Dopo l’essiccamento del polimero i pori presenti nella matrice possono cambiare dimensione e questo potrebbe ostacolare il riassorbimento del template. La porosità della struttura polimerica, quindi, è determinante affinchè il template possa raggiungere i gruppi funzionali e stabilire le interazioni volute. necessario un compromesso tra la rigidità della matrice polimerica per avere la selettività desiderata e un appropriato grado di flessibilità, indispensabile per una buona accessibilità dei siti di riconoscimento. agenti reticolanti solubili nella miscela monomero-template e quelle più comuni sono il divinilbenzene, l’etilenglicoldimetacrilato e il trimetilolpropano trimetacrilato.

46 I COMPONENTI DEI MIP Risulta di fondamentale importanza anche il ruolo del solvente. In genere la polimerizzazione ha luogo in un solvente inerte che agisce da porogeno, influenzando la morfologia del polimero, funzione svolta anche dal solvente in cui viene sciolto il polimero preformato. Se l’uso di solventi polari indebolisce i legami tra il template e la matrice, con il risultato di un riconoscimento molecolare meno efficace, la porosità che conferiscono al polimero comporta un’elevata area superficiale e quindi una maggiore accessibilità ai siti attivi. vengono in genere utilizzati sia solventi non polari come il toluene e il diclorometano, sia solventi polari, come l’acetonitrile (Ramstrom, 1996).

47 TECNOLOGIA DELL’IMPRONTA MOLECOLARE La tecnologia dell’imprinting molecolare è una valida alternativa ai sistemi di riconoscimento molecolare presenti nei sistemi biologici, ad esempio gli anticorpi. caratteristiche che ne rendono l’impiego vantaggioso rispetto a quello dei sistemi presenti in natura, in particolare l’elevata resistenza termica, chimica e meccanica. Questi materiali possono essere stabili agli sforzi, alle alte temperature e pressioni, agli acidi, alle basi, agli ioni metallici e ai trattamenti con una vasta gamma di solventi. il prodotto immagazzinato a temperatura ambiente ha una durata che arriva anche a molti anni senza alcuna apparente riduzione delle prestazioni ed è possibile un uso ripetuto del materiale fino a 100 volte lasciandone inalterata la “memoria”. Tali caratteristiche vantaggiose hanno alimentato le ricerche verso numerosi campi di applicazione. I polimeri MIP sono in genere sintetizzati in massa per poi essere frantumati per ottenere granuli di dimensioni di alcune decine di micron. Il rischio maggiore è che il template resti intrappolato in modo permanente nella matrice dopo la polimerizzazione.

48 PROGETTAZIONE E REALIZZAZIONE DI NUOVI MATERIALI “INTELLIGENTI” ATTRAVERSO LA TECNICA DELL’IMPRONTA MOLECOLARE siti di riconoscimento per molecole coinvolte nei processi di adesione, proliferazione, differenziamento, reclutamento cellulare per l’ingegnerizzazione di tessuti cardiovascolare, osseo e nervoso.

49 Per la sintesi di microsfere MIP monodisperse, è essenziale la scelta di un adeguato solvente di reazione. un buon solvente deve soddisfare le seguenti caratteristiche: Non deve interferire sulla “forza motrice” alla base della formazione del complesso monomero funzionale-template; Deve essere miscibile con i monomeri e l’iniziatore; Deve essere un non-solvente per il polimero formato; In condizioni di diluizione spinta del monomero, i comuni solventi utilizzati per l’imprinting non covalente, come l’acetonitrile, il cloroformio, il diclorometano, l’etanolo ed il toluene, portano alla formazione di particelle distinte ad esempio di poliacrilato o di polistirene reticolate. esempio di polimerizzazione non covalente per la formazione di MIP: acido metacrilico come monomero funzionale, reticolante acrilico trifunzionale denominato trimetilolpropano trimetacrilato (TRIM) (in taluni casi può essere preferibile l’utilizzo di un agente reticolante a maggior grado di idrofilicità come il pentaeritritol triacrilato PETRA), azoisobutirronitrile (AIBN) come iniziatore, acetonitrile come solvente porogeno e come template un principio attivo che può essere ad esempio rappresentato da un agente proteico, un peptide o un farmaco.


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