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Crioconservazione di gameti ed embrioni Rosanna Ciriminna Adina Massacesi Centro Ambra- Palermo Centro Bios -Roma.

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Presentazione sul tema: "Crioconservazione di gameti ed embrioni Rosanna Ciriminna Adina Massacesi Centro Ambra- Palermo Centro Bios -Roma."— Transcript della presentazione:

1 Crioconservazione di gameti ed embrioni Rosanna Ciriminna Adina Massacesi Centro Ambra- Palermo Centro Bios -Roma

2 La criobiologia ha molto a che fare con l acqua: si può ricondurre infatti alla maniera di congelare l acqua intracellulare senza uccidere le cellule.

3 La crioconservazione è una branca della criobiologia che consente il mantenimento della vitalità cellulare per un tempo prolungato, tramite congelamento a temperatura di –196°C in azoto liquido. La crioconservazione è una branca della criobiologia che consente il mantenimento della vitalità cellulare per un tempo prolungato, tramite congelamento a temperatura di –196°C in azoto liquido.

4 Il principio fondamentale della crioconservazione è quello di interrompere i processi biochimici del metabolismo cellulare. Ciò si ottiene convertendo in ghiaccio (CONGELAMENTO), a temperature sufficientemente basse, lacqua presente allinterno delle cellule.

5 La crioconservazione è valida se il sistema biologico torna a temperatura normale (SCONGELAMENTO) senza dover sopportare insulti strutturali o biochimici che possano causarne la morte cellulare.

6 È POSSIBILE CRIOCONSERVARE Spermatozoi Spermatozoi Tessuto testicolare Tessuto testicolare Ovociti Ovociti Tessuto ovarico Tessuto ovarico Zigoti Zigoti Preembrioni prima della compattazione Preembrioni prima della compattazione Blastocisti Blastocisti

7 SPERMATOZOI E TESSUTO TESTICOLARE

8 BANCA DEL SEME Autoconservazione degli spermatozoi Soggetti ipofertili Soggetti con azoospermia Soggetti che si sottopongono a vasectomia Soggetti che devono sottoporsi a chemio e/o radioterapia Preservare la potenzialità riproduttiva

9 La crioconservazione è fondamentale nei casi in cui si assiste ad progressivo abbattimento dei valori di concentrazione, motilità e morfologia nemaspermica.

10 La possibilità di crioconservare il liquido seminale è di notevole vantaggio per la gestione dei protocolli terapeutici finalizzati alla procreazione assistita

11 La crioconservazione risulta essere una procedura prioritaria ed imprescindibile nei casi di AZOOSPERMIA quindi per SPERMATOZOI TESTICOLARI

12 PESAMESATESATESE ICSI Si procede alla CRIOCONSERVAZIONE TFNA Qualunque sia la tecnica di prelievo a livello testicolare

13 Vantaggi della crioconservazione di spermatozoi testicolari Possibilità di raccogliere e studiare campioni testicolari di pazienti gravemente oligoastenospermici o azoospermici in fase diagnostica, quindi prima che la partner venga sottoposta a stimolazione della crescita follicolare multipla per l esecuzione della fecondazione in vitro mediante ICSI.

14 La crioconservazione non modifica i risultati di fertilizzazione, formazione di embrioni e possibilità di gravidanza se la motilità degli spermatozoi è anche parzialmente conservata

15 OVOCITI ED EMBRIONI

16 Ci sono così poche pubblicazioni sulla crioconservazione di ovociti La tecnica è considerata poco efficiente La tecnica è considerata poco efficiente In alcuni paesi ci sono restrizioni legali (Francia) In alcuni paesi ci sono restrizioni legali (Francia) Le uniche indicazioni valide sono: rifiuto della crioconservazione di embrioni conservazione della fertilità divieto di congelare zigoti o embrioni.

17 2004 Legge 40 Art. 14 – Limite allapplicazione delle tecniche. E vietata la crioconservazione degli embrioni. Qualora il trasferimento nell'utero degli embrioni non risulti possibile per grave e documentata causa di forza maggiore relativa allo stato di salute della donna non prevedibile al momento della fecondazione e' consentita la crioconservazione degli embrioni stessi fino alla data del trasferimento, da realizzare non appena possibile.

18 TECNICHE DI CRIOCONSERVAZIONE Sloow cooling – congelamento lento Vitrificazione – congelamento rapido

19 Polak de Fried et al, FS 1998 Polak de Fried et al, FS ovociti fecondati : nascita di un maschio sano 2 ovociti fecondati : nascita di un maschio sano Antinori et al, ESHRE 1998 Antinori et al, ESHRE transfer : 2 gravidanze, 1 ongoing 38 transfer : 2 gravidanze, 1 ongoing Young et al, FS 1998 Young et al, FS ovociti congelati; 8 sopravvissuti ; 5 embrioni trasferiti: gravidanza trigemina (aborto a 10 ws) 9 ovociti congelati; 8 sopravvissuti ; 5 embrioni trasferiti: gravidanza trigemina (aborto a 10 ws) Trounson et al, ESHRE 2000 Trounson et al, ESHRE bambini nati 3 bambini nati OVOCITI IN Metafase II: risultati Molto incoraggianti ma solo l 1% di nati

20 Porcu et al., 2000 sopravvivenza 54% Fabbri et al., 2001 sopravvivenza 82% Fosas et al., 2003 sopravvivenza 89% Chen et al., Borini et al sopravvivenza 75-80% MODIFICHE AL PROTOCOLLO portano al miglioramento dei risultati in termini di sopravvivenza ovocitaria Ancora non soddisfacente il numero di bambini nati

21 Efficienza La crioconservazione degli ovociti è stata considerata una tecnica a bassa efficienza a causa della bassa sopravvivenza, fertilizzazione e capacità di divisione dellembrione. Il miglioramento dei protocolli di congelamento ha reso la tecnica più soddisfacente in termini di sopravvivenza degli ovociti allo scongelamento, Con l introduzione dell ICSI sono migliorati i risultati anche in termini di fecondazione, di formazione degli embrioni e di impianto. Crioconservazione di ovociti

22 La sopravvivenza allo scongelamento è lunico criterio per valutare la qualità degli ovociti crioconservati La sopravvivenza e la competenza allo sviluppo non sono necessariamente correlate con criteri clinici o morfologici. La sopravvivenza e la competenza allo sviluppo non sono necessariamente correlate con criteri clinici o morfologici. Lassenza di degenerazione dopo scongelamento non è un indicatore attendibile della vitalità. Lassenza di degenerazione dopo scongelamento non è un indicatore attendibile della vitalità. La sopravvivenza deve coincidere con la conservazione dei fattori morfofunzionali essenziali verificabili oggettivamente. La sopravvivenza deve coincidere con la conservazione dei fattori morfofunzionali essenziali verificabili oggettivamente.

23 VITRIFICAZIONE Si basa sul concetto fisico della solidificazione senza formazione di cristalli di ghiaccio così come avviene nel congelamento lento. Si basa sul concetto fisico della solidificazione senza formazione di cristalli di ghiaccio così come avviene nel congelamento lento.

24 Linteresse verso questa tecnica ha avuto un grosso incremento negli ultimi anni

25 Kuleshova et al., nel 1999 riportarono la prima nascita dopo vitrificazione e scongelamento di 17 ovociti Kuleshova et al., nel 1999 riportarono la prima nascita dopo vitrificazione e scongelamento di 17 ovociti

26 CONFRONTO TRA SLOW FREEZING E VITRIFICAZIONE AUTOREMETODO % SOPRAV % FERT N° OVO/GRAV Fabbri, 2001 SF Chen, 2005 SF Boldt, 2006 SF Yoon, 2003 VF Kuwayama, 2005 VF91905 Cobo, 2007 VF Yoon, 2007 VF

27 Risultati della vitrificazione di ovociti AUTORE N° CASI N° OVO SCONG SCONG SR % N° CG NATI Kuleshova, Wu, Yoon, Kim, Chian, Kuwayama, Katayama, Kyono, Lucena, Selman, Yoon, Antinori,

28 I migliori risultati pubblicati nel 2007 riportano: - sopravvivenza ovocitaria 85% - gravidanze 43,5 %

29 E IN CORSO UNO STUDIO MULTICENTRICO SULLA VITRIFICAZIONE DI OVOCITI proposto dalla Scopo Verificare lefficacia della vitrificazione di ovociti. Lo studio è stato approvato dal comitato di bioetica dellUniversità di Pisa è stato avviato a settembre 2007 e sono già stati vitrificati circa 150 ovociti.

30 OVOCITI O EMBRIONI? PRO Ovociti Superamento problemi etico-legali Superamento problemi etico-legali Preservazione della fertilità in pazienti oncologiche o con problemi diversi. Preservazione della fertilità in pazienti oncologiche o con problemi diversi. Recupero degli ovociti quando il seme non è disponibile Recupero degli ovociti quando il seme non è disponibile Embrioni Riproducibilità dei risultati Riproducibilità dei risultati Omogeneità degli standard operativi Omogeneità degli standard operativi Verifica sui nati Verifica sui nati

31 OVOCITI O EMBRIONI? CONTRO Ovociti Problemi biologici Problemi biologici Inevitabilità della ICSI Inevitabilità della ICSI Tecnica sperimentale Tecnica sperimentaleEmbrioni Problemi etici e legali Problemi etici e legali Embrioniabbandonati Embrioniabbandonati

32 ZIGOTI ELEVATA SOPRAVVIVENZA ALLA CRIOCONSERVAZIONE ELEVATA SOPRAVVIVENZA ALLA CRIOCONSERVAZIONE VERIFICA DELLA VITALITA VERIFICA DELLA VITALITA POTENZIALITA DI IMPIANTO SIMILE AGLI EMBRIONI FRESCHI POTENZIALITA DI IMPIANTO SIMILE AGLI EMBRIONI FRESCHI

33 EMBRIONI BUONA SOPRAVVIVENZA SE LA MORFOLOGIA E OTTIMALE LIMITATA POSSIBILITA DI OSSERVARE LA RIPRESA DELLE DIVISIONI DEI BLASTOMERI POTENZIALITA DI IMPIANTO INFERIORE AGLI EMBRIONI FRESCHI

34 BLASTOCISTI SELEZIONE DEGLI EMBRIONI PIU VITALI MINOR NUMERO DI CONGELAMENTI MAGGIORE NUMERO DI CELLULE MINORI DIMENSIONI DELLE CELLULE LE BLASTOCISTI OTTENUTE IN VITRO CON I TERRENI SEQUENZIALI RESISTONO MALE ALLA CRIOCONSERVAZIONE. Inner cell mass cavità trofoblasto

35 Rimangono ancora molti aspetti della criobiologia, soprattutto degli ovociti, che devono essere chiariti in modo da ottimizzare le tecniche. Rimangono ancora molti aspetti della criobiologia, soprattutto degli ovociti, che devono essere chiariti in modo da ottimizzare le tecniche. La crioconservazione di ovociti non può prescindere da altre tecniche quali la ICSI, la maturazione in vitro. La crioconservazione di ovociti non può prescindere da altre tecniche quali la ICSI, la maturazione in vitro. In conclusione

36 La cosa più importante è comunque porre la massima attenzione a che tutte le tappe dei procedimenti di congelamento e scongelamento siano effettuati con precisione e soprattutto alle giuste temperature. La cosa più importante è comunque porre la massima attenzione a che tutte le tappe dei procedimenti di congelamento e scongelamento siano effettuati con precisione e soprattutto alle giuste temperature.


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