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Raccomandazioni di AIOM e SIAPEC-IAP Nicola Normanno ISTITUTO NAZIONALE PER LO STUDIO E LA CURA DEI TUMORI FONDAZIONE G. Pascale – NAPOLI SC Biologia Cellulare.

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1 Raccomandazioni di AIOM e SIAPEC-IAP Nicola Normanno ISTITUTO NAZIONALE PER LO STUDIO E LA CURA DEI TUMORI FONDAZIONE G. Pascale – NAPOLI SC Biologia Cellulare e Bioterapie CENTRO RICERCHE ONCOLOGICHE MERCOGLIANO (AV) Laboratorio di Farmacogenomica

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3 BRIM-3 (NO25026): Phase III Study in Previously Untreated Patients with Metastatic Melanoma International, multicenter, randomized, open-label Phase III study This study is currently ongoing Co-primary endpoints: –Overall survival –PFS Key secondary endpoints: –Efficacy: BORR, time to response, duration of response, time to treatment failure –Safety and tolerability –Pharmacokinetics –Contribute to validation of cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Test Vemurafenib (960 mg BID orally) Dacarbazine (1000 mg/m 2 IV q3w) 1:1 o Estimated enrollment: 680 patients o Unresectable metastatic melanoma (stage IIIc/IV, AJCC) o BRAF V600 mutation positive, determined by cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Test o Chemo-naïve for advanced disease N=680 NCT Available at (last accessed August 10, 2010). Chapman P. et al Abs LBA4 ASCO 2011

4 Progression-free survival (%) No. at risk Hazard ratio 0.38 (95% CI: 0.32–0.46) Log-rank p<0.001 (post-hoc) Dacarbazine (n=338) Vemurafenib (n=337) Progression-free survival (February 01, 2012 cut-off) censored at crossover Time (months) Dacarbazine Vemurafenib Chapman P. et al. abs 8502 ASCO Ann. Meeting Chicago 2012

5 Overall survival (%) Vemurafenib (n=337) Median f/u 12.5 months Dacarbazine (n=338) Median f/u 9.5 months Overall survival (February 01, 2012 cut-off) censored at crossover Hazard ratio 0.70 (95% CI: 0.57–0.87) p<0.001 (post-hoc) Time (months) Dacarbazine Vemurafenib No. at risk Chapman P. et al. abs 8502 ASCO Ann. Meeting Chicago 2012

6 The trial enrolled 20 patients with non-V600E mutations (19 with V600K and 1 with V600D) 4 of 10 patients with the BRAF V600K mutation had a response to vemurafenib

7 BRAF Mutations Affect Kinase Activity Ninety percent of BRAF mutations in melanoma result in substitution at position V600 2 – All tested mutations at V600 are classified as high-activity mutants when compared with BRAF wild-type (WT) 3,4 – These mutations constitutively stimulate ERK phosphorylation 3 A unifying feature of the high- and intermediate-activity BRAF mutants is that they disrupt the hydrophobic interaction between the P loop and the activation segment of the kinase domain 4 – This results in destabilization of the inactive conformation of BRAF, thus stimulating its kinase activity and leading to increased ERK phosphorylation BRAF = rapidly accelerated fibrosarcoma isoform B; ERK = extracellular signalregulated kinase; WT = wild-type. 1. Forbes SA, et al. Nucleic Acids Res 2010;38:D652–7 2. Garnett MJ, et al. Cancer Cell 2004;6:313–9. 3. Wan PTC, et al. Cell 2004;116:855– Pritchard C, et al. Biochem Soc Trans 2007;35:1329–33. BRAF kinase domain structure. Position 600 is indicated in yellow. The BRAF activation segment is shown in purple; dashes indicate the region that was not resolved. The P loop is shown in green (adapted from Garnett MJ, et al). 2

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9 FDA NEWS RELEASE For Immediate Release: Aug. 17, 2011 FDA approves Zelboraf and companion diagnostic test for late-stage skin cancer Second melanoma drug approved this year that improves overall survival The U.S. Food and Drug Administration today approved Zelboraf (vemurafenib), a drug to treat patients with late-stage (metastatic) or unresectable (cannot be removed by surgery) melanoma, the most dangerous type of skin cancer. Zelboraf is specifically indicated for the treatment of patients with melanoma whose tumors express a gene mutation called BRAF V600E. The drug has not been studied in patients whose melanoma tests negative for that mutation by an FDA approved diagnostic. Zelboraf is being approved with a first-of-a-kind test called the cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test, a companion diagnostic that will help determine if a patients melanoma cells have the BRAF V600E mutation. The BRAF protein is normally involved in regulating cell growth, but is mutated in about half of the patients with late-stage melanomas. Zelboraf is a BRAF inhibitor that is able to block the function of the V600E-mutated BRAF protein.

10 Types of BRAF mutation Arkenau BJC 2011

11 Classificazione Istopatologica Istotipi principali: melanoma a diffusione superficiale melanoma su lentigo maligna melanoma acrale lentigginoso melanoma nodulare Varianti con caratteri citologici peculiari quali il melanoma a piccole cellule, a cellule fusate, a cellule ad anello con castone, il melanoma rabdoide, il melanoma plasmocitoide. Istotipi rari: melanoma desmoplastico melanoma nevoide melanoma spitzoide melanoma su nevo melanoma mucoso lentigginoso nevo blu maligno

12 Fattori prognostici morfologici istopatologici Lo spessore del tumore, valutato istologicamente dal punto più profondo di invasione sino allo stato granuloso dellepidermide; La presenza di ulcerazione; Il numero di mitosi/mm 2 ; Levidenza di satellitosi microscopica La presenza o assenza di metastasi linfonodali o a distanza.

13 BRAF Mutations in Melanoma There is a strong inverse correlation between age and the likelihood of BRAF mutation in melanoma 1 –Age <55 years is the single most predictive factor of BRAF mutation reported 2 –This group of patients also presented with metastases to regional nodes more frequently 2 Melanomas positive for oncogenic BRAF are reported to show distinct morphological features 2 –Increased upward migration and nest formation of intraepidermal melanocytes –Thickening of the involved epidermis, with sharper demarcation to the surrounding skin –Larger, rounder, and more pigmented tumor cells 1. Flaherty KT, et al. Cancer 2010;116:4902– Viros A, et al. PLoS Med 2008;5:e120. NestingCell shapePigmentation RoundSpindledAbsentVery high No nesting Extensive nesting Grading of cellular morphological features. Examples indicate the extent of nesting, cell shape, and pigmentation (adapted from Viros A, et al). 2

14 Frequency distribution of genetic alterations in BRAF, NRAS, and KIT in melanoma Curtin JCO 2006

15 Il campione istologico Il campione istologico può essere rappresentato da lesioni primitive o metastatiche (cutanee, linfonodali o viscerali). E comunque preferibile un campione di lesioni metastatiche, nelle quali la componente di cellule neoplastiche è in genere maggiormente rappresentata rispetto a quanto osservato nei melanomi primitivi. Il tessuto tumorale può essere prelevato mediante una biopsia incisionale o essere costituito da un campione operatorio. Lindagine molecolare può essere eseguita: 1) su tessuto fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE); 2) su campione tissutale fresco; 3) su tessuto congelato a -80°C.

16 Consistency Between BRAF/NRAS Mutation Status in Primary and Secondary Lesions in Patients With Melanoma Colombino JCO 2012

17 Polyclonality of BRAF mutations in melanoma Lin BJC 2011

18 Heterogeneity of BRAF mutations in melanoma Yancowitz Plos One 2012

19 Dissezione tessutale La possibilità di identificare mutazioni puntiformi in genere è condizionata dalla percentuale di cellule tumorali ed in parte anche dalla quantità di pigmento melanico. È pertanto utile per questo tipo di tumore una macro- microselezione al fine di arricchire il campione, e di ridurre il più possibile le potenziali interferenze del pigmento melanico sulla qualità del DNA estratto. Le procedure di arricchimento contemplano le metodiche di dissezione (micro e macrodissezione tissutale) e/o di carotaggio Può essere utile sottoporre le sezioni ad un protocollo di decolorazione (melanin bleach).

20 Il campione citologico Il materiale di archivio di campioni citologici è costituito da: preparati citologici strisciati, colorati e montati su vetrino; materiale citologico incluso in blocchi di paraffina (citoinclusi); campioni citologici in sospensione per allestimento di strisci su strato sottile.

21 Estrazione del DNA Per lestrazione e purificazione del DNA da tessuto paraffinato sono oggi disponibili vari kits commerciali, in genere basati sul principio della cromatografia I kit consentono di accorciare notevolmente i tempi necessari per lestrazione e, al contempo, favoriscono la standardizzazione delle procedure Una volta estratto, il DNA viene risospeso in tampone adeguato, quindi valutato sotto il profilo qualità/quantità mediante lettura spettrofotometrica o tramite visualizzazione su gel dagarosio. Per la valutazione dellamplificabilità del DNA purificato da tessuti in paraffina, una PCR quantitativa può risultare molto più accurata della spettrofotometria

22 MethodLimit of detection (ie, minimum % of mutant alleles in a wild type background required for reliable mutation detection) Analytical sensitivity Range of mutations detected Sequencing/PCRAround 20-30%80-85%Comprehensive PLA-LNA clampReportedly below 1%Limited ARMS (Therascreen)Up to 1%90-95%Limited PCR Invader®Limited Pyro-sequencingReportedly 1-10%90-95%Near comprehensive High-ResolutionMelting (HRM)10-20%80-85%Near comprehensive SNaPshot®5–10% PCR/flRFLP5-10% Fragment analysisApproximately 5%90-95%Insertions/deletions CE-SSCP/DHPLC5-10%90-95%Near comprehensive How do methods compare by performance?

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24 Molecular testing in melanoma Woodman CCR 2012

25 Kit commerciali o metodiche sviluppate in laboratorio? I kit diagnostici presentano numerosi vantaggi rispetto al sequenziamento diretto: risultano più rapidi e sensibili, utilizzano protocolli standardizzati, sono in genere forniti di adeguati controlli positivi e negativi, ed in alcuni casi sono stati anche approvati per limpiego clinico in Europa (CE-IVD). Sebbene questultimo punto non sia al momento un requisito indispensabile per lattività di diagnostica molecolare, lapprovazione di un saggio per limpiego clinico rappresenta sicuramente un valore aggiunto rispetto a metodiche sviluppate a scopo di ricerca. Per le metodiche sviluppate autonomamente, i laboratori devono dimostrare la loro sensibilità e specificità

26 Sequenziamento diretto del prodotto di PCR Le mutazioni attivanti il gene BRAF, attualmente indispensabili per luso di farmaci inibitori di BRAF nel trattamento del melanoma metastatico, sono localizzate nellesone 15 del gene. Pertanto, lintero esone o parte dellesone devono essere amplificati prima di procedere allanalisi mutazionale mediante sequenziamento.

27 Sequenziamento diretto del prodotto di PCR Allestire le reazioni PCR sotto cappa a flusso laminare, in un ambiente diverso da quello utilizzato per lanalisi dei prodotti di amplificazione, impiegando materiali dedicati e con le opportune precauzioni onde evitare contaminazioni. Introdurre almeno un controllo positivo per mutazione ed un controllo negativo. Per ogni campione da analizzare, effettuare due distinte reazioni PCR che saranno sottoposte a sequenziamento in forward e reverse, in modo da ottenere un numero di 3-4 sequenze per campione. Considerare il campione come positivo per mutazione solo se questa è presente in almeno due diverse sequenze (una forward ed una reverse) ottenute da PCR indipendenti. Ad intervalli di sequenze, sequenziare dei DNA di controllo per verificare lassenza di contaminazioni e la qualità della processo. Verificare che lefficienza della procedura garantisca un corretto risultato in almeno il 97% dei campioni e che la sensibilità del metodo non risulti superiore al 20%.

28 Analisi mediante Pirosequenziamento Le metodiche di pirosequenziamento hanno alcuni vantaggi rispetto al sequenziamento standard, tra cui la maggiore sensibilità (riportata tra il 5 ed il 10%) e la possibilità di sequenziare frammenti piuttosto corti di DNA, superando in tal modo eventuali problematiche legate alla frammentazione del DNA. Sono disponibili in commercio alcuni Kit per la determinazione delle mutazioni del gene BRAF basati sul pirosequenziamento

29 Analisi mediante Real Time PCR Le metodiche di RealTime PCR, in generale, possiedono una maggiore sensibilità rispetto agli approcci basati su PCR/sequenziamento. Le metodiche di Real Time PCR presentano anche il vantaggio di poter ottenere un buon livello di amplificazione anche in caso di DNA frammentato Limpiego della RealTime PCR è facilitato dallosservazione che nel melanoma le mutazioni predittive di risposta al vemurafenib sono concentrate nel codone 600

30 Analisi mediante Real Time PCR Esistono in commercio numerosi kit per la determinazione delle mutazioni di BRAF mediante RealTime PCR. Questi saggi sono in genere basati sulla metodica della discriminazione allelica, alcuni impiegano anche tecniche per la amplificazione preferenziale del DNA mutato (PNA clamp, primer ARMS, etc.). La maggioranza dei kit disponibili è stata disegnata per individuare la sola mutazione V600E. Tuttavia, alcuni kit presentano una documentata reattività crociata anche per altre mutazioni di BRAF in posizione V600, quali la V600K e la V600D, e pertanto sono in grado di rilevare anche queste mutazioni.

31 cobas ® BRAF V600 Mutation Test Luke CCR 2012

32 Analisi mediante Real Time PCR È possibile anche progettare e validare in proprio metodiche di Real Time PCR per la individuazione delle mutazioni di BRAF. In questo caso, la metodica deve essere disegnata in modo da rilevare le principali mutazioni V600 di BRAF. La sensibilità minima raccomandata è del 10%.

33 Raccomandazioni per lanalisi mediante Real Time PCR La elevata sensibilità della Real Time PCR può essere fonte di contaminazioni. Le reazioni devono essere allestite sotto cappa a flusso laminare, in un ambiente diverso da quello utilizzato per lanalisi dei prodotti di amplificazione, impiegando materiali dedicati e con le opportune precauzioni Appropriati controlli positivi e negativi devono essere sempre inclusi in ogni singola determinazione Le reazioni devono di norma essere eseguite in duplicato In caso di metodiche sviluppate nei laboratori, queste devono essere validate, ovvero è indispensabile stabilire la sensibilità e lambito di specificità del saggio

34 Analisi mediante Ibridazione molecolare su filtro È disponibile sotto forma di kit commerciale un saggio per lidentificazione della sola mutazione BRAF V600E basato sulla PCR e sullibridazione inversa. La procedura prevede lamplificazione tramite PCR con primer biotinilati del DNA in analisi e libridazione dei prodotti amplifi cati su una striscia contenente sonde oligonucleotidiche allele-specifiche. Il saggio identifica la mutazione V600E con una sensibilità dell1% circa ed è stato approvato per limpiego clinico. Il kit è corredato di vari controlli che permettono di monitorare lefficienza della reazione PCR e dellibridazione molecolare.

35 BRAF mutations: Sequencing vs COBAS Anderson Arch Pathol Lab Med 2012

36 BRAF mutations: Sequencing vs COBAS Halait Diagn Mol Pathol 2012

37 Refertazione - Diagnostica istopatologica Il referto istopatologico di melanoma deve comprendere le seguenti informazioni: 1.Una descrizione macroscopica che identifichi i margini di resezione chirurgici e la distanza della neoplasia dal margine più vicino 2.Una descrizione microscopica che indichi i parametri istopatologici prognostici importanti ai fi ni della stadiazione patologica, ed indicazioni ad ulteriori eventuali procedure di stadiazione (biopsia del linfonodo sentinella). 3.Qualora siano eseguite colorazioni immunoisto- citochimiche queste devono riportate specificando gli anticorpi utilizzati e/o eventuali metodiche FISH con lindicazione del cut-off utilizzato nella valutazione.

38 Refertazione – Analisi mutazionale di BRAF Il referto della determinazione dello stato mutazionale di BRAF deve contenere le seguenti informazioni: 1. Identificazione del paziente 2. Identificazione del medico/struttura che ha richiesto lanalisi 3. Materiale utilizzato 4. Percentuale di cellule tumorali 5. Metodica/metodiche impiegata/e 6. Mutazioni indagate 7. Risultati del test con specificazione del tipo di mutazione eventualmente rilevata.

39 Refertazione – Analisi mutazionale di BRAF Il referto deve essere compilato su un modello prestabilito, e firmato dallanatomo-patologo e dallesecutore del test molecolare. In considerazione dellimpatto dellesito del test sulla strategia terapeutica, il tempo per la refertazione non deve superare le due settimane dalla richiesta della determinazione.


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