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DIAGNOSI IMMUNOLOGICA DELLA TUBERCOLOSI

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Presentazione sul tema: "DIAGNOSI IMMUNOLOGICA DELLA TUBERCOLOSI"— Transcript della presentazione:

1 DIAGNOSI IMMUNOLOGICA DELLA TUBERCOLOSI
Enrico Tortoli

2 La tubercolosi nel MONDO in ITALIA 2.000.000 morti all’anno
nuovi casi all’anno 1/3 della popolazione mondiale infettato in ITALIA 4.287 casi notificati nel 2001

3 Infezione da M. tuberculosis
Malattia tubercolare se il sistema immunitario non riesce a controllare l’infezione Infezione latente (assenza di malattia) se l’infezione rimane sotto il controllo del sistema immunitario

4 M. tuberculosis, infezione
Esposizione al M. tuberculosis Assenza di infezione (5%) TBC attiva (5%) (entro 2 anni) Infezione (95%) TBC latente (95%) Riattivazione (5%) nessuna riattivazione (90%)

5 Risposta immune all’infezione tubercolare
ICM Moltiplicazione batterica Anticorpi Tempo infezione malattia

6 I linfociti T Cellula-T nativa = non venuta in contatto con l’Ag
Cellula-T effettrice = cellula-T nativa venuta in contatto con l’Ag Cellula-T memoria = cellula effettrice dopo l’allontanamento dell’antigene Cellula-T effettrice = cellula-T memoria in occasione di un nuovo contatto con l’Ag

7 La Mantoux Introdotta nel 1890, è il più vecchio test diagnostico ancora in uso Si basa sull’inoculo intradermico del PPD, (miscela di antigeni del M. tuberculosis, alcuni dei quali sono presenti anche nel BCG e nei micobatteri non tubercolari)

8 Mantoux richiamo e attivazione cellulare Linfocita T
Cellula presentante l’Ag Rilascio di IFN-, TNF e IL8 richiamo e attivazione cellulare indurimento e arrossamento nel punto dell’iniezione

9 Punti di forza della Mantoux
Utile per predire la TBC attiva Il trattamento dei soggetti Mantoux-positivi riduce drasticamente il rischio di passaggio alla tubercolosi attiva Basso costo Non richiede l’intervento del laboratorio

10 Limiti della Mantoux Falsi positivi Falsi negativi
5-60% dei vaccinati Tempo trascorso dalla vaccinazione Numero di vaccinazioni Età al momento della vaccinazione - Esposizione a micobatteri non tubercolari (NTM) - Effetto booster Anergia (soggetti immunodepressi, malnutriti, con tubercolosi avanzata) Falsi negativi Errori di inoculo Errori di lettura (soggettività, inaccuratezza della misurazione) Problemi di ordine pratico Doppia presentazione del paziente Mancata lettura nel 30% dei casi

11 Produzione di interferone- (IFN-)
L’infezione tubercolare stimola la risposta della cellule T Le cellule-T attivate secernono citochine IFN- TNF IL8 Le cellule-T effettrici producono IFN- entro poche ore dalla stimolazione Le cellule-T memoria devono prima proliferare trasformandosi in cellule effettrici, non sono quindi in grado di produrre IFN- prima di 24h L’IFN- non è normalmente presente in circolo, è stabile e misurabile

12 I test basati sull’interferone-γ
I linfociti del soggetto in esame vengono posti in contatto con l’antigene, con un controllo negativo privo di antigene e con un controllo positivo contiene fitoemoagglutinina Ricerca dell’IFN-γ dopo opportuna incubazione assenza di IFN-γ = ASSENZA DI INFEZIONE presenza di IFN-γ = INFEZIONE presenza di IFN-γ nel controllo NEG = TEST NON VALIDO assenza di IFN-γ nel controllo POS = DEFICIT IMMUNITARIO

13 La scelta degli antigeni
I linfociti T dei soggetti con infezione tubercolare producono interferone-γ se vengono in contatto con uno o più antigeni del M. tuberculosis PPD (purified proteic derivative) ESAT-6 (early secretory antigenic target 6) CFP-10 (culture filtrate protein 10) ESAT-6 e CFP-10 sono codificati in una regione genica (RD1) che manca nel BCG e in quasi tutti i MNT

14 Specificità di ESAT-6 and CFP-10
Antigeni NTM Antigeni ESAT CFP EAST-6 CFP-10 M abscessus - - M tuberculosis + + M avium - - M branderi - - M celatum - - M chelonae - - Ceppi BCG M fortuitum - - M gordonae - - gothenburg - - M intracellulare - - moreau - - M kansasii + + tice - - M malmoense - - M marinum + + tokyo - - M genavense - - danish - - M scrofulaceum - - glaxo - - M smegmatis - - montreal - - M szulgai + + M terrae - - pasteur - - M vaccae - - M xenopi - -

15 Metodo ELISA COLORE K - ESAT-6 CFP-10 Mitogeno Sangue eparinato
Trasferimento in pozzetti e aggiunta dell’antigene Incubazione overnight a 37oC Se sono presenti cellule-T effettrici viene secreto IFN-g COLORE DO 450nm IFN-g IU/ml Recupero del plasma e dosaggio dell’IFN-γ (‘sandwich’ ELISA, incubazione 120 min) Lavaggio, aggiunta di substrato e lettura Misura della DO e dosaggio dell’IFN-g contro una curva di taratura

16 Metodo ELISA in-tube COLORE Raccolta del sangue in provette eparinate
Incubazione per 16-24h a 37°C K neg ESAT6 + CFP10 mitogeno centrifugazione COLORE DO 450nm Recupero del plasma e dosaggio dell’IFN-γ (‘sandwich’ ELISA, incubazione 120 min) Lavaggio, aggiunta di substrato e lettura IFN-g IU/ml Misura della DO e dosaggio dell’IFN-g contro una curva di taratura

17 Metodo ELISpot COLORE K - ESAT-6 CFP-10 Mitogeno Sangue eparinato
Separazione e conteggio dei leucociti mononucleati Trasferimento dei linfociti ( cell.) in pozzetti coated con Ab anti-IFN-γ e aggiunta dell’antigene COLORE Incubazione overnight a 37oC Lavaggio e dosaggio dell’IFN-γ (‘sandwich’ ELISA, incubazione 120 min) Conteggio degli spot, al microscopio o con lettore automatico

18 Metodo ELISpot: lettura
Man mano che una cellula secerne IFN-γ questo viene legato dagli Ab sottostanti, si forma quindi uno spot POSITIVO: quando si hanno spot con almeno uno degli antigeni se il K- ha 0-4 spot ed il pozzetto dell’Ag ha più di 5 spot se il K- ha >5 e <10 spot ed il pozzetto con l’antigene ha un numero di spot almeno doppio NON VALIDO se K- >10 spot e/o K+ <20 spot

19 Vantaggi dei metodi basati su IFN-
Test in vitro Nessun effetto booster Specificità elevata Non influenzati dalla vaccinazione con BCG Praticità: occorre solo un prelievo di sangue e non è richiesta la collaborazione del paziente Interpretazione oggettiva Eliminano il ricorso a trattamenti non necessari

20 Valutazione clinica dei test basati su IFN-
Non esiste un gold standard per la tubercolosi latente La sensibilità del test viene solitamente stimata in soggetti con tubercolosi attiva, usando la coltura come gold standard La specificità viene solitamente stimata in soggetti ad alto rischio

21 La risposta IFN- correla con l’esposizione
La risposta IFN- ad ESAT-6/CFP-10 è predittiva del passaggio a TBC attiva? La risposta IFN- correla con l’esposizione Circa il 90% dei pazienti risponde In Etiopia, un follow up di 2 anni di contatti conviventi col caso indice, ha dimostrato la correlazione della risposta ad ESAT-6 (ma non al PPD) con la progressione verso la malattia Doherty et al (JCM 2002)

22 Correlazione IFN-γ/Mantoux
Sensibilità 89.0% (105/118) 65.7% (50/76; 5 mm) Specificità 98.2% (213/217) 35.4% (73/113; 10 mm) Mori et al Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2004

23 Test IFN-γ vs. Mantoux Sensibilità relativa ai casi di TBC attiva: SOVRAPPONIBILE Sensibilità nei casi di sospetta infezione latente: MAGGIORE per IFN-γ I casi con Mantoux NEG e IFN-γ POS sono generalmente associati con l’esposizione I casi con Mantoux POS e IFN-γ NEG non sono generalmente associati con l’esposizione

24 IFN-γ e gruppi di rischio
AJRCCM, Mori, 2004

25 Studio dei contatti Caso indice: uno studente di una scuola danese
Stratificazione dei contatti: Soggetti che cantavano nello stesso coro del caso indice Compagni di classe Altri studenti della scuola Forte correlazione della risposta IFN-γ con l’esposizione Forte correlazione della Mantoux con la vaccinazione in the groups respectively. Choir practiced 3 nights a week and went on tour of the US together – very high exposure. AJRCCM Brock , 2004

26 Studio dei contatti Caso indice: una partoriente in un ospedale italiano Stratificazione dei contatti: Ricoverate nella stessa stanza Neonati Visitatori Positività al test a base di IFN- fortemente correlata con l’esposizione Mantoux quasi sempre negativa in the groups respectively. Choir practiced 3 nights a week and went on tour of the US together – very high exposure. AJRCCM Richeldi, 2004

27 Altri studi Nessuna correlazione con la vaccinazione
Nessuna correlazione con le micobatteriosi Nessuna variazione in corso di terapia Alta riproducibilità Maggior sensibilità negli immunodepressi

28 Da approfondire Sensibilità negli immunodepressi
Sensibilità nei bambini Sensibilità nella tubercolosi extrapolmonare Utilità nel monitoraggio della terapia Specificità nei pazienti con micobatteriosi

29 ATS: soggetti da testare
Soggetti con fibrosi polmonare Soggetti provenienti da paesi ad alta endemia (in particolare se arrivati da meno di un anno) Soggetti appartenenti a categorie sociali particolari (senza fissa dimora, carcerati) Operatori sanitari Contatti stretti (> 4h/settimana) di soggetti con tubercolosi HIV-positivi Soggetti con Mantoux-conversione recente (< 2 anni) Pazienti affetti da silicosi, neoplasie ematologiche, tossicodipendenti, immunosoppressi


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