La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

DIAGNOSI IMMUNOLOGICA DELLA TUBERCOLOSI Enrico Tortoli.

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "DIAGNOSI IMMUNOLOGICA DELLA TUBERCOLOSI Enrico Tortoli."— Transcript della presentazione:

1 DIAGNOSI IMMUNOLOGICA DELLA TUBERCOLOSI Enrico Tortoli

2 La tubercolosi nel MONDO – morti allanno – nuovi casi allanno –1/3 della popolazione mondiale infettato in ITALIA –4.287 casi notificati nel 2001

3 Infezione da M. tuberculosis Malattia tubercolare Malattia tubercolare –se il sistema immunitario non riesce a controllare linfezione Infezione latente (assenza di malattia) Infezione latente (assenza di malattia) –se linfezione rimane sotto il controllo del sistema immunitario

4 M. tuberculosis, infezione Esposizione al M. tuberculosis Assenza di infezione (5%) Infezione (95%) TBC attiva (5%) (entro 2 anni) TBC latente (95%) Riattivazione (5%) nessuna riattivazione (90%)

5 Tempo Risposta ICM Moltiplicazione batterica Anticorpi infezione malattia Risposta immune allinfezione tubercolare

6 I linfociti T Cellula-T nativa = non venuta in contatto con lAg Cellula-T nativa = non venuta in contatto con lAg Cellula-T effettrice = cellula-T nativa venuta in contatto con lAg Cellula-T effettrice = cellula-T nativa venuta in contatto con lAg Cellula-T memoria = cellula effettrice dopo lallontanamento dellantigene Cellula-T memoria = cellula effettrice dopo lallontanamento dellantigene Cellula-T effettrice = cellula-T memoria in occasione di un nuovo contatto con lAg Cellula-T effettrice = cellula-T memoria in occasione di un nuovo contatto con lAg

7 La Mantoux Introdotta nel 1890, è il più vecchio test diagnostico ancora in uso Introdotta nel 1890, è il più vecchio test diagnostico ancora in uso Si basa sullinoculo intradermico del PPD, (miscela di antigeni del M. tuberculosis, alcuni dei quali sono presenti anche nel BCG e nei micobatteri non tubercolari) Si basa sullinoculo intradermico del PPD, (miscela di antigeni del M. tuberculosis, alcuni dei quali sono presenti anche nel BCG e nei micobatteri non tubercolari)

8 Mantoux Linfocita T Cellula presentante lAg richiamo e attivazione cellulare indurimento e arrossamento nel punto delliniezione Rilascio di IFN-, TNF e IL8

9 Punti di forza della Mantoux Utile per predire la TBC attiva Utile per predire la TBC attiva Il trattamento dei soggetti Mantoux-positivi riduce drasticamente il rischio di passaggio alla tubercolosi attiva Il trattamento dei soggetti Mantoux-positivi riduce drasticamente il rischio di passaggio alla tubercolosi attiva Basso costo Basso costo Non richiede lintervento del laboratorio Non richiede lintervento del laboratorio

10 Limiti della Mantoux Falsi positivi Falsi positivi -5-60% dei vaccinati Tempo trascorso dalla vaccinazione Tempo trascorso dalla vaccinazione Numero di vaccinazioni Numero di vaccinazioni Età al momento della vaccinazione Età al momento della vaccinazione - Esposizione a micobatteri non tubercolari (NTM) - Effetto booster -Anergia (soggetti immunodepressi, malnutriti, con tubercolosi avanzata) Falsi negativi Falsi negativi -Errori di inoculo -Errori di lettura (soggettività, inaccuratezza della misurazione) Problemi di ordine pratico Problemi di ordine pratico -Doppia presentazione del paziente -Mancata lettura nel 30% dei casi

11 Produzione di interferone- (IFN- ) Linfezione tubercolare stimola la risposta della cellule T Linfezione tubercolare stimola la risposta della cellule T Le cellule-T attivate secernono citochine Le cellule-T attivate secernono citochine –IFN- –IFN- –TNF –IL8 Le cellule-T effettrici producono IFN- entro poche ore dalla stimolazione Le cellule-T effettrici producono IFN- entro poche ore dalla stimolazione Le cellule-T memoria devono prima proliferare trasformandosi in cellule effettrici, non sono quindi in grado di produrre IFN- prima di 24h Le cellule-T memoria devono prima proliferare trasformandosi in cellule effettrici, non sono quindi in grado di produrre IFN- prima di 24h LIFN- non è normalmente presente in circolo, è stabile e misurabile LIFN- non è normalmente presente in circolo, è stabile e misurabile

12 I test basati sullinterferone- γ I linfociti del soggetto in esame vengono posti in contatto con lantigene, con un controllo negativo privo di antigene e con un controllo positivo contiene fitoemoagglutinina I linfociti del soggetto in esame vengono posti in contatto con lantigene, con un controllo negativo privo di antigene e con un controllo positivo contiene fitoemoagglutinina Ricerca dellIFN- γ dopo opportuna incubazione Ricerca dellIFN- γ dopo opportuna incubazione –assenza di IFN- γ = ASSENZA DI INFEZIONE –presenza di IFN- γ = INFEZIONE presenza di IFN- γ nel controllo NEG = TEST NON VALIDO presenza di IFN- γ nel controllo NEG = TEST NON VALIDO assenza di IFN- γ nel controllo POS = DEFICIT IMMUNITARIO assenza di IFN- γ nel controllo POS = DEFICIT IMMUNITARIO

13 La scelta degli antigeni I linfociti T dei soggetti con infezione tubercolare producono interferone- γ se vengono in contatto con uno o più antigeni del M. tuberculosis I linfociti T dei soggetti con infezione tubercolare producono interferone- γ se vengono in contatto con uno o più antigeni del M. tuberculosis –PPD (purified proteic derivative) –ESAT-6 (early secretory antigenic target 6) –CFP-10 (culture filtrate protein 10) ESAT-6 e CFP-10 sono codificati in una regione genica (RD1) che manca nel BCG e in quasi tutti i MNT ESAT-6 e CFP-10 sono codificati in una regione genica (RD1) che manca nel BCG e in quasi tutti i MNT

14 Specificità di ESAT-6 and CFP-10 NTMAntigeni M abscessus-- M avium-- M branderi-- M celatum-- M chelonae-- M fortuitum-- M gordonae-- M intracellulare-- M kansasii++ M malmoense-- M marinum++ M genavense-- M scrofulaceum-- M smegmatis-- M szulgai++ M terrae-- M vaccae-- M xenopi-- Antigeni ESAT-6 CFP-10 EAST-6 CFP-10 M tuberculosis++ Ceppi BCG gothenburg-- moreau-- tice-- tokyo-- danish-- glaxo-- montreal-- pasteur--

15 Sangue eparinato ESAT-6CFP-10Mitogeno Trasferimento in pozzetti e aggiunta dellantigene Incubazione overnight a 37 o C Se sono presenti cellule-T effettrici viene secreto IFN- viene secreto IFN- Recupero del plasma e dosaggio dellIFN - γ (sandwich ELISA, incubazione 120 min) Lavaggio, aggiunta di substrato e lettura di substrato e letturaCOLORE Misura della DO e dosaggio dellIFN- Misura della DO e dosaggio dellIFN- contro una curva di taratura Metodo ELISA K - DO 450nm IFN- IU/ml

16 Metodo ELISA in-tube Raccolta del sangue in provette eparinate Incubazione per 16-24h a 37°C Recupero del plasma e dosaggio dellIFN - γ (sandwich ELISA, incubazione 120 min) Lavaggio, aggiunta di substrato e lettura COLORE K neg ESAT6 + CFP10 mitogeno centrifugazione Misura della DO e dosaggio dellIFN- Misura della DO e dosaggio dellIFN- contro una curva di taratura DO 450nm IFN- IU/ml

17 Sangue eparinato ESAT-6CFP-10Mitogeno Trasferimento dei linfociti ( cell.) in pozzetti coated con Ab anti-IFN-γ e aggiunta dellantigene Incubazione overnight a 37 o C Lavaggio e dosaggio dellIFN-γ (sandwich ELISA, incubazione 120 min) Conteggio degli spot, al microscopio o con lettore automatico K - Separazione e conteggio dei leucociti mononucleati COLORE Metodo ELISpot

18 Man mano che una cellula secerne IFN- γ questo viene legato dagli Ab sottostanti, si forma quindi uno spot Man mano che una cellula secerne IFN- γ questo viene legato dagli Ab sottostanti, si forma quindi uno spot POSITIVO: quando si hanno spot con almeno uno degli antigeni POSITIVO: quando si hanno spot con almeno uno degli antigeni –se il K- ha 0-4 spot ed il pozzetto dellAg ha più di 5 spot –se il K- ha >5 e 5 e <10 spot ed il pozzetto con lantigene ha un numero di spot almeno doppio NON VALIDO se K- >10 spot e/o K+ 10 spot e/o K+ <20 spot Metodo ELISpot: lettura

19 Test in vitro Test in vitro Nessun effetto booster Nessun effetto booster Specificità elevata Specificità elevata Non influenzati dalla vaccinazione con BCG Non influenzati dalla vaccinazione con BCG Praticità: occorre solo un prelievo di sangue e non è richiesta la collaborazione del paziente Praticità: occorre solo un prelievo di sangue e non è richiesta la collaborazione del paziente Interpretazione oggettiva Interpretazione oggettiva Eliminano il ricorso a trattamenti non necessari Eliminano il ricorso a trattamenti non necessari Vantaggi dei metodi basati su IFN- Vantaggi dei metodi basati su IFN-

20 Valutazione clinica dei test basati su IFN- Valutazione clinica dei test basati su IFN- Non esiste un gold standard per la tubercolosi latente Non esiste un gold standard per la tubercolosi latente –La sensibilità del test viene solitamente stimata in soggetti con tubercolosi attiva, usando la coltura come gold standard –La specificità viene solitamente stimata in soggetti ad alto rischio

21 La risposta IFN- ad ESAT-6/CFP-10 è predittiva del passaggio a TBC attiva? La risposta IFN- correla con lesposizione La risposta IFN- correla con lesposizione Circa il 90% dei pazienti risponde Circa il 90% dei pazienti risponde In Etiopia, un follow up di 2 anni di contatti conviventi col caso indice, ha dimostrato la correlazione della risposta ad ESAT-6 (ma non al PPD) con la progressione verso la malattia In Etiopia, un follow up di 2 anni di contatti conviventi col caso indice, ha dimostrato la correlazione della risposta ad ESAT-6 (ma non al PPD) con la progressione verso la malattia Doherty et al (JCM 2002) Doherty et al (JCM 2002)

22 Correlazione IFN- γ/ Mantoux IFN- γ Mantoux Sensibilità89.0%(105/118)65.7% (50/76; 5 mm) Specificità98.2%(213/217)35.4% (73/113; 10 mm) Mori et al Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2004

23 Test IFN- γ vs. Mantoux Sensibilità relativa ai casi di TBC attiva: SOVRAPPONIBILE Sensibilità relativa ai casi di TBC attiva: SOVRAPPONIBILE Sensibilità nei casi di sospetta infezione latente: MAGGIORE per IFN- γ Sensibilità nei casi di sospetta infezione latente: MAGGIORE per IFN- γ I casi con Mantoux NEG e IFN- γ POS sono generalmente associati con lesposizione I casi con Mantoux NEG e IFN- γ POS sono generalmente associati con lesposizione I casi con Mantoux POS e IFN- γ NEG non sono generalmente associati con lesposizione I casi con Mantoux POS e IFN- γ NEG non sono generalmente associati con lesposizione

24 AJRCCM, Mori, 2004 IFN- γ e gruppi di rischio

25 Studio dei contatti Caso indice: uno studente di una scuola danese Caso indice: uno studente di una scuola danese Stratificazione dei contatti: Stratificazione dei contatti: –Soggetti che cantavano nello stesso coro del caso indice –Compagni di classe –Altri studenti della scuola Forte correlazione della risposta IFN- γ con lesposizione Forte correlazione della risposta IFN- γ con lesposizione Forte correlazione della Mantoux con la vaccinazione Forte correlazione della Mantoux con la vaccinazione AJRCCM Brock, 2004

26 Studio dei contatti Caso indice: una partoriente in un ospedale italiano Caso indice: una partoriente in un ospedale italiano Stratificazione dei contatti: Stratificazione dei contatti: –Ricoverate nella stessa stanza –Neonati –Visitatori Positività al test a base di IFN- fortemente correlata con lesposizione Positività al test a base di IFN- fortemente correlata con lesposizione Mantoux quasi sempre negativa Mantoux quasi sempre negativa AJRCCM Richeldi, 2004

27 Altri studi Nessuna correlazione con la vaccinazione Nessuna correlazione con la vaccinazione Nessuna correlazione con le micobatteriosi Nessuna correlazione con le micobatteriosi Nessuna variazione in corso di terapia Nessuna variazione in corso di terapia Alta riproducibilità Alta riproducibilità Maggior sensibilità negli immunodepressi Maggior sensibilità negli immunodepressi

28 Da approfondire Sensibilità negli immunodepressi Sensibilità negli immunodepressi Sensibilità nei bambini Sensibilità nei bambini Sensibilità nella tubercolosi extrapolmonare Sensibilità nella tubercolosi extrapolmonare Utilità nel monitoraggio della terapia Utilità nel monitoraggio della terapia Specificità nei pazienti con micobatteriosi Specificità nei pazienti con micobatteriosi

29 ATS: soggetti da testare Soggetti con fibrosi polmonare Soggetti con fibrosi polmonare Soggetti provenienti da paesi ad alta endemia (in particolare se arrivati da meno di un anno) Soggetti provenienti da paesi ad alta endemia (in particolare se arrivati da meno di un anno) Soggetti appartenenti a categorie sociali particolari (senza fissa dimora, carcerati) Soggetti appartenenti a categorie sociali particolari (senza fissa dimora, carcerati) Operatori sanitari Operatori sanitari Contatti stretti (> 4h/settimana) di soggetti con tubercolosi Contatti stretti (> 4h/settimana) di soggetti con tubercolosi HIV-positivi HIV-positivi Soggetti con Mantoux-conversione recente (< 2 anni) Soggetti con Mantoux-conversione recente (< 2 anni) Pazienti affetti da silicosi, neoplasie ematologiche, tossicodipendenti, immunosoppressi Pazienti affetti da silicosi, neoplasie ematologiche, tossicodipendenti, immunosoppressi


Scaricare ppt "DIAGNOSI IMMUNOLOGICA DELLA TUBERCOLOSI Enrico Tortoli."

Presentazioni simili


Annunci Google