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LEZIONE 9 Ingegneria cellulare 2 Metodi di manipolazione del genoma cellulare Valeria Benedusi CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO.

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1 LEZIONE 9 Ingegneria cellulare 2 Metodi di manipolazione del genoma cellulare Valeria Benedusi CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA Titolare del corso: Adriana Maggi

2 Retrovirus Lentivirus (derivati da HIV) Adenovirus Virus adeno-associati Herpesvirus Plasmidi nudi Elettroporazione in vivo Liposomi Amine, proteine cariche positivamente Vettori virali: Vettori non virali:

3 Infezione con vettori virali I virus si sono evoluti per trasferire il loro DNA nelle cellule in maniera efficiente e specifica Infezione Iniezione del DNA ReplicazioneSintesi del capside Assemblaggio Lisi Vettori virali

4 Si ottengono inserendo il gene di interesse nel genoma di diversi tipi di virus, sotto il controllo di un promotore forte. In genere vengono introdotte modifiche in modo da rendere il virus incapace di riprodursi autonomamente. Questo è importante per evitare la diffusione di virus ricombinanti Il principale vantaggio consiste nellelevata efficienza di trasduzione (fino al 100% delle cellule).

5 Il genoma virale deve essere modificato Inserimento del gene di interesse Eliminazione dei late genes, codificanti per il capside, in modo da evitare la lisi della cellula infettata Virus difettivi Per la produzione del vettore virale si rendono necessarie coinfezioni con i virus helper oppure riproduzione inpackaging cell lines (linee cellulari capaci di complementare i difetti introdotti nel virus) Vettori virali

6 Linee cellulari transfettate stabilmente con geni virali codificanti per proteine strutturali del capside (late genes), necessarie per lassemblaggio dei virioni. La loro transfezione transiente con il DNA-vettore determina limpacchettamento del costrutto nel virione. Si ottiene in questo modo un vettore virale di transfezione completo. Packaging cell lines

7 Vettori virali Vantaggi: Alta efficienza di trasduzione (fino al 100% delle cellule) Possono essere specifici per una tipologia cellulare (minore risposta immunitaria e minori effetti off-target in vivo) Replicano naturalmente in colture cellulari Svantaggi:Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nellospite Mutagenesi inserzionale (se integrazione casuale) Molecole di DNA di dimensioni limitate Reazioni immunitarie Costi elevati Vettore ideale: tropismo per specifiche tipologie cellulari minima trasduzione di cellule off target alta efficienza di trasduzione durata dellespressione che permetta massimo effetto No risposta immunitaria o patogenesi

8 Vettori virali (Mutagenesi inserzionale) Affinità per diverse tipologie cellulari

9 Ciclo vitale dei Retrovirus Retrovirus (genoma a ssRNA) dsDNA non passa attraverso i pori nucleari, quindi integrazione avviene solo quando la cellula si sta dividendo

10 virus con envelope genoma di 10 Kb costituito da una molecola di RNAss dopo linfezione il genoma è retrotrascritto a DNAds integra nel genoma dellospite (possibile mutagenesi) infetta solo cellule in divisione LTR gagpolenv gag: codifica per le proteine del core pol: codifica per la trascrittasi inversa env: codifica per le proteine dellenvelope LTR: long terminal repeat, comprendono promotore/enhancers e sequenze necessarie per lintegrazione : sequenze per il packaging Retrovirus

11 Vettori retrovirali Per costruire un vettore retrovirale è necessario rimuovere i geni codificanti per gag (core virale), pol (trascrittasi inversa e integrasi) e env (involucro virale). Si ottiene così lo spazio per linserto di DNA ma la replicazione virale può verificarsi solo nelle packaging cell lines o in presenza di virus helper

12 Packaging cell lines

13 Le proteine virali necessarie per linfezione iniziale vengono fornite in trans da virus helper Virus helper

14 Vettori retrovirali Vantaggi: Non provocano malattie umane Scarsa risposta immunitaria Lunghezza inserti di DNA 8 kb Integrazione stabile nel DNA dellospite (transgene può essere espresso per tutta la vita dellospite) Ampio tropismo Alta efficienza di trasduzione Svantaggi: Incapacità di infettare cellule quiescenti Integrazione casuale nel genoma dellospite (mutagenesi inserzionale oncogenesi )

15 Vettori retrovirali Applicazioni Riparazioni ossee: vettori retrovirali usati per inviare fattori di crescita e di differenziamento a cellule ossee mature o cellule staminali Riparazione cartilagine Clinical trial per trattamento X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) infezione di cellule ematopoietiche con vettori retrovirali contenenti gene per IL2Rg miglioramento funzionalità linfociti T

16 Lentivirus (genoma a ssRNA) Sono una classe di retrovirus Il più comune lentivirus è lHIV e il più comune vettore lentivirale viene costruito da questo virus. Per la costruzione del vettore i geni codificanti per gag, pol, env e per altri geni regolatori e accessori vengono deleti e inseriti in plasmidi helper (come per i retrovirus) Virus HIV

17 Vettori lentivirali Vantaggi:Infezione di cellule in divisione o quiescenti lunghezza inserti di DNA di dimensioni 8 kb Espressione stabile del gene Integrazione stabile nel DNA dellospite (espressione del transgene per tutta la vita dellospite) Non vengono inattivati dal complemento Espressione duratura Svantaggi: Integrazione casuale nel genoma dellospite (mutagenesi inserzionale) Patogenesi Difficili da coltivare

18 Vettori lentivirali Applicazioni Grazie alla loro capacità di veicolare grossi geni vengono usati per la produzione di animali transgenici con espressione tessuto-specifica del transgene Utilizzati in cellule quiescenti (neuroni o cellule cardiache) Primo trial approvato –> Anti-HIV RNA therapy Adrenoleucodistrofia Morbo di Parkinson Beta-talassemia Cancro

19 virus senza envelope, struttura icosaedrica regolare genoma di 36 Kb costituito da una molecola di DNAds il genoma è fiancheggiato da sequenze ITR (inverted terminal repeats) che servono come origine di replicazione dopo linfezione il virus entra nel nucleo della cellula ospite e viene replicato non si integra nel genoma dellospite (resta episomale) infetta sia celule in divisione che non dotato di ampio tropismo Adenovirus (genoma a dsDNA)

20 Trascrizione DNA virale: Early phase: trascritti geni che portano la cellula ospite nella fase S della mitosi e ne inibiscono apoptosi, codificano per DNA Pol e altre proteine necessarie per replicazione DNA virale e inibiscono risposta cellulare allinfezione Late phase: replicazione DNA virale, assemblaggio nuove particelle virali e rilascio tramite lisi della cellula ospite Adenovirus Geni deleti nella generazione di vettori virali

21 E1A: coinvolto nellattivazione della trascrizione e nella promozione dellentrata della cellula ospite in fase S (lega Rb inducendo il rilascio del fattore di trascrizione E2F) E1B: blocca azione di p53, evitando entrata della cellula in apoptosi E2: codifica per 3 proteine coinvolte nella replicazione del DNA e nella modulazione della trascrizione (DNA-pol; proteina terminale e DNA-binding protein) E3: modula la risposta immunitaria E4: regola la trascrizione, la transizione dellespressione da early a late gene, la replicazione virale e lassemblamento dei virioni L1-5: coinvolti nella produzione e nellassemblaggio delle proteine del capside E1a E1b L1 L2 L3 L4 E3 L5 E2b E2a E Geni Early (E) e geni Late (L)

22 Generati sostituendo i geni E1a e E1b con il transgene di interesse, posto sotto il controllo di un elemento enhancer e di un promotore. Il vettore così ottenuto è replicazione-difettivo e le funzioni replicative vengono fornite in trans da un virus helper (privato della sequenza e di E1). Il vettore è cresciuto in E1-expressing cell-lines (es. cellule 293A che presentano una copia del gene E1 integrata stabilmente). Vettori adenovirali: helper dipendenti

23 Vettori adenovirali helper-dipendenti di nuova generazione: sono vettori ad alta capacità. Sfruttano il fatto che tutte le proteine adenovirali possono essere complementate in trans, quindi quasi tutta la sequenza codificante può essere sostituita dal transgene che può avere dimensioni comprese tra 100 b e 36 Kb. Le uniche sequenze essenziali in cis sono le ITRs e la sequenza. Vettori adenovirali: gutless

24 1.Vettore virale: contiene solo sequenze ITRs e + la cassetta di espressione del trangene 2.Cellule di packaging (293): esprimono gene E1 3.Virus Helper: E1-deleto, privo di sequenza. Fornisce elementi strutturali PRODUZIONE DI VETTORI GUTLESS

25 Vantaggi: Produzione di elevata quantità di virus Esprimono ad alti livelli Lunghezza inserti di DNA 8 kb, fino a 36 kb per i gutless AV Infezione di cellule in divisione e quiescenti Ampio tropismo Sicuri (non integrano nel genoma) Svantaggi: Risposta immunitaria Espressione genica transitoria Vettori adenovirali

26 Applicazioni Cancro vettori esprimenti geni oncosoppressori come p53 o p16 alle cellule tumorali Suicide therapy usa proteine virali per metabolizzare farmaci non tossici a farmaci tossici Es: Cancro alla prostata: Adenovirus codificante per nitroreduttasi batterica in combinazione con profarmaco CB1954 Patologie del fegato siRNA contro PAI-1 nella fibrosi epatica Differenziamento cellule staminali AIDS Patologie cardiovascolari Tubercolosi

27 capside icosaedrico no envelope genoma fiancheggiato da sequenze ITRs, che contengono la sequenza di packaging solo due tipi di geni: cap (proteine del capside) rep (proteine necessarie per la replicazione e lintegrazione) per replicare necessita della presenza di un adenovirus o di un Herpes simplex virus (virus helper) in assenza di AV o HSV, i virus AAV integrano stabilmente nel genoma della cellula ospite con unalta frequenza, in una regione precisa del cromosoma 19 (19q 13,3q-ter) una successiva superinfezione con AV o HSV attiva la replicazione del virus integrato Virus adeno-associati (genoma a ssDNA)

28 Virus adeno-associati Per la costruzione di vettori virali vengono deleti geni Rep e Cap (necessari per replicazione DNA e assemblaggio capside) per creare spazio allinserto di DNA esogeno. Queste proteine necessarie vengono espresse da un plasmide coinfettato, eliminando la necessità di coinfettare la cellula con Adenovirus helper

29 Il vettore: è costruito sostituendo il transgene a Cap e Rep, in quanto le sequenze ITRs contengono tutte le informazioni necessarie per lintegrazione e per il packaging. Le cellule di packaging: linea cellulare 293 transfettata con un plasmide contenente i geni cap e rep e successivamente infettata con un adenovirus helper difettivo per E1 e privo della sequenza. Recentemente è stato sviluppato un nuovo sistema di produzione: il virus helper è sostituito con un plasmide mini-Ad (contiene parte del genoma di adenovirus) Vettori virali adeno-associati

30 Vantaggi: non patogeni per luomo Ampio tropismo Alta efficienza di trasduzione Infezione di cellule in divisione o quiescenti Mantiene alti livelli di espressione in vivo (anni) Integrazione sito-specifica nel genoma Prodotti in grosse quantità Svantaggi: Lunghezza inserti di DNA 4,1-4,9 kb non è in grado di replicarsi senza assistenza di virus helper (Es. Adenovirus) o Herpes virus Vettori virali adeno-associati

31 Adatti per ingegneria tissutale perché stabili in diversi tessuti fino a 1 anno (cervello, muscolo, occhio) Diversi sierotipi hanno diverse proteine del capside che conferiscono specificità tissutale: Es: AAV1 muscolo AAV6 polmone AAV7 fegato Sierotipi mosaico: combinazione di diversi vettori AAV Trials per terapia genica Patologie monogeniche e cancro Fibrosi cistica aerosol con vettore AAV contenente regolatore transmembrana della Fibrosi cistica Vettori adeno-associati Applicazioni

32 Vantaggi:Tropismo per cellule neuronali Lunghezza inserti diDNA di kb Possibilità di produrre alti titoli virali Svantaggi: Tossicità Rischio ricombinazione Mancata integrazione nel genoma dellospite Herpes simplex virus (genoma a dsDNA) Inizialmente effettua uninfezione produttiva nelle cellule epiteliali (ciclo litico), risale poi attraverso le terminazioni dei nervi sensoriali fino ai gangli dorsali. Qui stabilisce uninfezione latente (non necessita di espressione genica). Il ciclo litico viene riattivato periodicamente: le nuove particelle virali vengono trasportate con trasporto anterogrado e provocano lesioni a livello epiteliale

33 1.DISABLED HSV VECTORS Virus ricombinanti ottenuti eliminando uno o più geni precoci immediati. Vengono prodotti in cellule di packaging che complementano i geni mancanti. Vettori di ultima generazione: prodotti eliminando il gene che codifica per la glicoproteina-H di HSV-1 e cresciuti in una linea cellulare che complementa questa proteina. I virus ottenuti sono infettivi, ma possono effettuare un solo ciclo di infezione.

34 2.AMPLICON HSV VECTORS Si usa un amplicone, un plasmide contenente: unorigine di replicazione batterica (generalmente da Escherichia coli), unorigine di replicazione di HSV-1 (OriS) la sequenza di packaging di HSV-1 il transgene Il tutto viene inserito in una linea cellulare infettata da un virus helper contenente i geni regolatori e strutturali mancanti.

35 Baculovirus (genoma a dsDNA) Vantaggi:Non patogeno e non tossico Incapace di replicare in cellule di mammifero Si degrada nella cellula ospite col tempo Non immunogenico: poiché in natura infetta insetti e invertebrati, luomo non ha anticorpi o linfociti T contro questo virus Lunghezza inserti di DNA 30 kb Svantaggi: Rapida inattivazione da parte del sistema del complemento (vettore ricoperto con Polietilenimine per proteggerlo) Molto utilizzato in studi su animali per veicolare geni a diverse tipologie cellulari e per la produzione di proteine ricombinanti in insetti, sarà oggetto di futuri studi

36 Poxvirus (genoma a dsDNA) A questo gruppo appartiene il virus del vaiolo Tra i primi virus animali usati per costruire vettori per gene transfer Replicazione del genoma nel citoplasma e non nel nucleo Vantaggi:Incapacità di replicare nelle cellule umane (linee MVA e NYVAC) Lunghezza inserti di DNA 25 kb Alti livelli di espressione Svantaggi: Possibile citossicità

37 PoxvirusApplicazioni Studiati come vettori virali per suscitare risposta immunitaria in patologie diventate resistenti ai farmaci Cancro utilizzati per veicolare antigeni alle cellule tumorali che ne permettano il riconoscimento da parte del sistema immunitario

38 Vantaggi dei vettori non virali Impossibile la generazione di nuovi virus patogeni Riduzione del rischio di reazione immunitaria Possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono di trasdurre molecole di DNA anche molto grandi Possibilità di produzione in grandi quantità a basso costo Svantaggi dei vettori non virali Scarsa efficienza sia di trasduzione che di integrazione Se integrati possono a loro volta dare mutagenesi inserzionale Vantaggi dei vettori virali Svantaggi dei vettori virali Alta efficienza di trasduzione Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nellospite Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) Molecole di DNA di dimensioni limitate Reazioni immunitarie Costi elevati

39 Caratteristiche del vettore ideale per la TERAPIA GENICA Efficiente (trasdurre un numero di cellule elevato). Dovrebbe garantire una prolungata produzione della proteina terapeutica (a livelli adeguati). Capace di incorporare DNA di varie dimensioni. Dovrebbe garantire la regolazione (trascrizionale, traduzionale o post-traduzionale) dellespressione del gene terapeutico Non dovrebbe essere patogeno. Somministrabile direttamente nel paziente. In grado di raggiungere specificamente le cellule bersaglio. Ben tollerato. Non dovrebbe avere componenti che inducono risposta immune. Facile da produrre in maniera riproducibile.

40 Integrazione di DNA esogeno nel genoma cellulare Gene trapping ( integrazione casuale nel genoma di un costrutto contenente un gene reporter (entrapment vector)) Gene targeting (integrazione sito-specifica mediante ricombinazione omologa)

41 SA Endogenous gene X SA pA P' pA Vector Integration DNA RNA protein Spliced transcript β-gal Neo R Gene Trapping SA PROTEIN X Vector lac Z neo lac Z neo lac Z neo Promotore ASSENTE Introne gene X Promotore e pA INDIPENDENTI Distruzione GENE X e ANALISI ESPRESSIONE

42 Gene Trapping

43 Il GENE TRAPPING consente 1)Identificazione NUOVI GENI 2)Produzione di TOPI TRANSGENICI (KO) 3)ANALISI dellESPRESSIONE di GENI

44 GENE TARGETING Mutagenesi MIRATA mediante ricombinazione omologa in cellule ES Permette la creazione di una mutazione in un gene PREDETERMINATO Questa mutagenesi può avere come risultato: 1)INATTIVAZIONE dellespressione di un gene (KNOCK-OUT) 2)DIMINUZIONE dellespressione di un gene (KNOCK-DOWN) 3)INSERZIONE di un gene difettivo/selvatico (correzione) (KNOCK-IN) IL GENE TARGETING SFRUTTA LA RICOMBINAZIONE OMOLOGA

45 DNA esogeno DNA genomico La ricombinazione omologa è il processo alla base della integrazione sito specifica Es. di gene targeting

46 vettori utilizzati per GENE TARGETING 1)VETTORI DI INSERZIONE (per produzione di TOPI KNOCK-OUT) 2) VETTORI DI SOSTITUZIONE (per produzione di TOPI KNOCK-IN) Gene di interesse M: marker esterno alla regione omologa Gene di interesse M: marker interno alla regione omologa Singolo evento di ricombinazione Distruzione del locus genico: KO Doppia ricombinazione Sostituzione di parti del locus genico 1)Per correggere un gene 2)Per produrne forma inattiva

47 C 9 H 13 N 5 O 4 peso molecolare: Gancyclovir, un analogo della 2-deossi-guanosina che puo essere fosforilato ad un analogo della deossi-guanosina trifosfato (dGTP) da parte dellenzima timidina chinasi di Herpes simplex. Venendo incorporato nel DNA al posto della dGTP inibisce per competizione lincorporazione di dGTP da parte della DNA polimerasi virale, portando alla terminazione dellelongazione del DNA virale.

48 A neo r tk A* A neo r A tk neomicina A neo r A tk gancyclovir Integrazione sito-specifica Integrazione random Nessuna inserzione Cellule uccise dalla neomicina Cellule resistenti alla neomicina, uccise da gancyclovir A neo r Cellule resistenti sia alla neomicina che al gancyclovir Regioni di omologia Tk = timidina kinasi GENE knock-out; GENE Knock-in

49 Mutanti tk - non sopravvivono in terreno HAT (contenente ipoxantina, aminopterina e timidina) se la via di salvataggio non è praticabile Timidino chinasi Nucleotidi: Biosintesi ex novo o salvataggio Lenzima tk è necessario alla via di salvataggio 5-fosforibosil-1- pirofosfato Uridina monofostato Inosina monofostato Timidina monofostato AMINOPTERINA Guanina monofostato Adenina monofostato Ipoxantina Timidina Blocca sintesi purine e pirimidine

50 3. Modalità di trasfezione Transfezione transiente o stabile Tecnologia per la transfezione

51 Transfezioni transienti o stabili Transfezioni transienti: il gene esogeno entra nel nucleo e viene trascritto dalla RNA pol II ma non si integra nel genoma della cellula transfettata. Serve marcatore dellefficienza di transfezione. A ogni mitosi raddoppiano le cellule e si dimezza la quantità di DNA trasfettato in rapporto alle cellule che viene perso dopo pochi cicli replicativi Transfezioni stabili: il gene esogeno viene integrato nel genoma della cellula ed in presenza di una adeguata pressione selettiva (gene marcatore che conferisce alla cellula la capacità di crescere in un terreno selettivo) viene mantenuto per numerosi passaggi in coltura duplicandosi con il genoma cellulare. La probabilità di integrazione stabile è dellordine di 10 -4, sul totale delle cellule transfettate

52 Transfezione stabile Durante le prime 48 ore dopo la transfezione, fino al 50% delle cellule contengono il DNA esogeno. In seguito, a causa della degradazione e della diluizione, le cellule che non hanno integrato tale DNA nel loro genoma lo perdono. Per isolare le cellule transfettate stabilmente occorre applicare una pressione selettiva, utilizzando un apposito marker di selezione.

53 Marcatori di selezione per cellule di mammifero Tk fosforila la timidinaAminopterina (Inibisce sintesi timidina-P) Timidina chinasi (Tk) XGPRT sintetizza GMPAcido micofenolico (Inibisce sintesi GMP) Xantina-guanina fosforibosil transferasi (XGPRT) Inattiva Xyl-A9- -D-furanosil (Xyl-A) (danneggia DNA) Adenosina deaminasi (ADA) HPH inattiva igromicinaIgromicina B (Inibitore sintesi proteica) Igromicina fosfotransferasi (HPH) Variante resistente DHFR Metotrexate (Inibisce DHFR) Diidrofolato reduttasi (DHFR) APH inattiva G418G418 (Inibitore sintesi proteica) Aminoglicoside fosfotransferasi (APH) MECCANISMO FARMACOENZIMA

54 Transfezione transiente - applicazione Studio della regolazione dellespressione genica con sistemi reporter Studio dei meccanismi di trasduzione del segnale Identificazione di molecole attive su enzimi o recettori Studi di correlazione struttura attività di mutanti

55 Transfezione stabile - applicazioni Generazione di linee cellulari con caratteristiche specifiche per la produzione di biofarmaci o lo screening di molecole farmacologicamente attive. Servono markers specifici per poter selezionare le cellule transfettate


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