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III Convegno SCAN 31 maggio 2005 IDENTIFICAZIONE DI AUTOANTIGENI ENDOTELIALI IN LES CON MANIFESTAZIONI PSICHIATRICHE Elena Ortona.

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1 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 IDENTIFICAZIONE DI AUTOANTIGENI ENDOTELIALI IN LES CON MANIFESTAZIONI PSICHIATRICHE Elena Ortona

2 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 Autoimmunità L'autoriconoscimento è un fenomeno fisiologico essenziale nell'omeostasi dell'immunita' e nel controllo delle risposte immunitarie. La risposta autoimmunitaria rappresenta un fenomeno secondario e privo di un rilevante significato patogenetico; es. transitoria comparsa in circolo di autoanticorpi in soggetti con infarto del miocardio, di autoanticorpi antimuscolo liscio nella gran parte delle virosi acute; di anticorpi antinucleari nell'epatite indotta da virus di tipo A o B, e di anticorpi anticute negli ustionati gravi. La denominazione " malattia autoimmune ", riguarda solo quei casi in cui le alterazioni strutturali e funzionali sono causate da risposte immunitarie rivolte verso costituenti propri dell'organismo. Il prototipo delle malattie autoimmuni cosi' definite viene considerato il " Lupus Eritematoso Sistemico " (LES).

3 III Convegno SCAN 31 maggio 2005

4 Autoanticorpi associati con il LES Autoanti corpo Frequen za(%) Specificità diagnostica ANA95-98Di screening ma non specifici Anti- dsDNA 50-60Alta. A titolo elevato nel LES con coinvolgimento renale e cerebrale Anti-RNP5-10Abbastanza alta. Nel LES con F.Raynaud ed interessamento polmonare Anti-Sm15-20Alta. Nel LES con coinvolgimento renale e cerebrale Anti- SSA/Ro Circa 30 Bassa. Fotosensibilità, LES cutaneo sub-acuto, Lupus neonatale, Lupus associato a deficit di complemento Anti- SSB/La Circa 10 Bassa.Nel Lupus neonatale in associazione con anti-SSA/Ro o nel LES con Sicca Sindrome Anti-Ku5-10Alta Anti- PCNA 3-4Alta

5 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 Il LES è una malattia cronica autoimmune sistemica con un ampio spettro di manifestazioni cliniche Lupus eritematoso sistemico 1.ARTRITE 2.GLOMERULONEFRITE 3.MANIFESTAZIONI CUTANEE 4.PLEURITE E PERICARDITE 5.ALTERAZIONI EMATICHE 6.MANIFESTAZIONI NEUROPSICHIATRICHE

6 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 Manifestazioni psichiatriche nel LES Reazioni psicologiche alla malattia cronica Aspetti legati all'effetto collaterale di alcuni farmaci assunti (cortisone in particolare) Eventuali aspetti riguardanti la personalita' premorbosa del paziente Manifestazioni neuropsichiatriche dovute a danni organici propri del Lupus Eritematoso Sistemico (NEURO-LES)

7 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 Acute confusional state Guillain-Barrè syndrome Anxiety disorder Aseptic meningitis Cerebrovascular disease Cognitive dysfunction Demyelinating syndrome Headache Mononeuropathy Transverse myelopathy Mood disorder Movement disorder Myasthenia gravis Autonomic neuropathy Plexopathy Polyneuropathy Psychosis Seizure disorders Sindromi neuropsichiatriche definite dal ACR Research Committee

8 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 Fattori patogenetici primari associati a LES con manifestazioni neuropsichiatriche Alterazioni vascolari Vasculopatie non infiammatorie Vasculiti Trombosi Citochine Interleuchine 2, 6, 8 e 10 Interferon Autoanticorpi Anticorpi anti-neuroni Anticorpi anti-proteina P ribosomale Anticorpi anti-fosfolipidi AECA

9 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 La sintesi degli autoanticorpi avviene in periferia e il passaggio nel CSF avviene a causa del danneggiamento della barriera emato-encefalica, per vasculopatie e microinfarti. La sintesi degli autoanticorpi avviene direttamente nel sistema nervoso. Le cellule B o le plasmacellule possono attraversare la barriera emato-encefalica a livello parenchimatico e secernere anticorpi a livello intratecale (aumento dellespressione di molecole di adesione). Presenza di autoanticorpi nel CSF DUE IPOTESI

10 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 Meccanismi patogenetici degli autoanticorpi coinvolti nelle manifestazioni neuropsichiatriche Anticorpi anti-cellule endoteliali aumentano la permeabilità del microcircolo Autoanticorpi cross-reattivi con recettori neuronali

11 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 Cross-reazioni tra anticorpi anti- DNA e il recettore NMDA Recentemente è stato dimostrato che: un subset di anticorpi anti-DNA in pazienti con NPSLE cross-reagiscono con recettori NMDA Tali anticorpi possono causare morte neuronale attraverso un meccanismo eccitotossico Gli anticorpi sono stati trovati anche nel CSF di pazienti con NPSLE. Nature Medicine 7:

12 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 AECA e manifestazioni psichiatriche No psychiatric group N=34 Normal Donors N=66 *P<10 -4 p< Conti et al. Arthritis Res Ther 2004

13 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 RUOLO DEGLI ANTICORPI ANTI-CELLULE ENDOTELIALI (AECA) GLI AECA SONO PRESENTI NEL SIERO DEI PAZIENTI CON PATOLOGIE AUTOIMMUNI CARATTERIZZATE DA UN DANNO VASCOLARE EVIDENZE CLINICHE DIMOSTRANO CHE GLI AECA SONO COINVOLTI NELLA PATOGENESI DEL LES E SONO CORRELATI CON LATTIVITÀ DELLA MALATTIA LE MOLECOLE BERSAGLIO DEGLI AECA SONO PER LA MAGGIOR PARTE SCONOSCIUTE IN MODELLI SPERIMENTALI GLI AECA SONO IN GRADO DI ATTIVARE E DANNEGGIARE LE CELLULE ENDOTELIALI

14 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 Gli AECA causano attivazione, lisi e apoptosi delle cellule endoteliali

15 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 Identificazione delle molecole bersaglio degli AECA Comprensione dei meccanismi patogenetici Utilizzo come marcatori diagnostici e/o prognostici di manifestazioni psichiatriche

16 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 Identificazione di nuovi autoantigeni endoteliali mediante screening di librerie di espressione ed analisi proteomiche. Caratterizzazione della risposta immunologica specifica e valutazione del loro uso nella diagnosi e nel monitoraggio. Valutazione del ruolo patogenetico degli autoanticorpi specifici su linee cellulari e su modelli murini. OBIETTIVI DEL PROGETTO DI RICERCA

17 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 SCREENING DELLA LIBRERIA DI ESPRESSIONE HUAEC

18 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 Espressione e purificazione della proteina ricombinante La sequenza nucleotidica del cDNA clonato viene sequenziato con sequenziatore automatico.ABI Prism 310 Collection (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) Le sequenze vengono poi confrontate con le banche dati mediante Fasta e Blast Il cDNA viene clonato nel vettore di espressione QIA express vector, pQE30. La proteina di fusione è espressa in Escherichia coli SG e purificata per cromatografia di affinità con una resina di NI-NTA specifica per la coda di 6 istidine

19 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 NEDD5 C-T

20 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 NEDD5 APPARTIENE ALLA FAMIGLIA DELLE SEPTINE NEDD5 È UNA PROTEINA DEL CITOSCHELETRO ED APPARTIENE ALLA FAMIGLIA DELLE SEPTINE, UNA FAMIGLIA DI PROTEINE MOLTO CONSERVATE E COINVOLTE IN DIVERSI PROCESSI CELLULARI NEDD5 È UNA PROTEINA DI 361 aa ED UN PESO MOLECOLARE DI 41,5 kDa. ESSA È CARATTERIZZATA DA TRE DOMINI FUNZIONALI: NEDD5 È ESPRESSA IN MODO PREDOMINANTE NEL SISTEMA NERVOSO CENTRALE DOVE E COINVOLTA NELLA REGOLAZIONE DELLA SECREZIONE. NEDD5 CONTRIBUISCE INOLTRE ALLA FORMAZIONE DELLE LESIONI NEUROFIBRILLARI NELLA MALATTIA DI ALZHEIMER.

21 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 Caratterizzazione immunochimica di Nedd5

22 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 Localizzazione di NEDD5 in cellule HEP-2 e in cellule endoteliali

23 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 Apoptosi e Autoimmunità Le malattie autoimmuni come il lupus sono caratterizzate da un difetto della regolazione dellapoptosi e dallaccumulo di cellule apoptotiche. Le modificazioni di proteine intracellulari durante lapoptosi e la loro redistribuzione sulla superficie delle cellule apoptotiche portano allinduzione della risposta autoimmune. Come fa una proteina intracellulare a diventare autoantigenica?

24 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 DISTRIBUZIONE DI NEDD5 IN CELLULE ENDOTELIALI DURANTE LAPOPTOSI

25 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 IgG anti-Nedd5 in pazienti con LES divisi in base alla presenza di manifestazioni psichiatriche. * P= 0.04,# P= 0.034,° P= 0.003; ^ P=0.046; § P=0.007.

26 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 Conclusioni Nedd5 è un nuovo autoantigene nel LES. Lespressione di Nedd5 sulla superficie di cellule endoteliali in apoptosi giustifica la reattività autoimmune di questa proteina intracellulare. IgG anti-Nedd5 sono associate alla presenza di manifestazioni psichiatriche in pazienti con LES e possono essere un marcatore immunologico di tali manifestazioni. Ulteriori studi chiariranno se questi autoanticorpi siano patogenetici.

27 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 Prospettive future IgG anti-Nedd5

28 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 Immunoblotting di proteine di membrana di cellule endoteliali rivelate con IgG presenti nel liquor di 2 pazienti con lupus psichiatrico e di 2 soggetti senza malattie autoimmuni kDa

29 III Convegno SCAN 31 maggio 2005 Paola Margutti Federica Delunardo Ettore Piro Rachele Riganò Elisabetta Profumo Brigitta Buttari Alessandra Siracusano Maurizio Sorice Dipartimento Medicina Sperimentale e Patologia, Università La Sapienza, Roma. Fabrizio Conti Guido Valesini Dipartimento di Clinica e Terapia Medica Applicata, Cattedra di Reumatologia, Università La Sapienza, Roma. Ada Francia Simona Pontecorvo III Cattedra Neurologica, Università La Sapienza, Roma.


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