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Basi della citofluorimetria a flusso Cellule in sospensione passano in singola fila attraverso una camero di flusso Riflettono/rifrattono la luce ed emettono.

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Presentazione sul tema: "Basi della citofluorimetria a flusso Cellule in sospensione passano in singola fila attraverso una camero di flusso Riflettono/rifrattono la luce ed emettono."— Transcript della presentazione:

1 Basi della citofluorimetria a flusso Cellule in sospensione passano in singola fila attraverso una camero di flusso Riflettono/rifrattono la luce ed emettono fluorescenza La luce emessa viene raccolta, filtrata e convertita ad un valore digitale che viene inviato al computer

2 Il primo momento della analisi citofluorimetrica è rappresentato dal passaggio delle cellule in sospensione attraverso il raggio laser, in fila. granulocito linfocito monocito Nel caso del campione riportato in figura, viene analizzata una sospensione di globuli bianchi contente linfociti, monociti e granulociti

3 Scatter Frontale (Forward Angle Light Scatter, FALS) Laser granulocito linfocito monocito Sensore per il FALS Il semplice passaggio delle cellule attraverso il laser dà origine ad un segnale che viene captato dal sensore che raccoglie la luce dello scatter frontale (forward), e che dà informazioni sul volume cellulare.

4 Quando viene utilizzata una sorgente laser, la quantita di luce scatterata nella direzione frontale (lungo lo stesso asse attraverso cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel canale del Forward Scatter Lintensita del Forward Scatter e proporzionale alla dimensione, forma, ed omogeneita ottica delle cellule (o delle altre particelle analizzate)

5 Scatter Laterale (90 Degree Light Scatter) Il passaggio delle cellule dà anche origine ad un secondo segnale che viene captato dal sensore che raccoglie la luce dello Scatter Laterale, a 90 gradi e che dà informazioni sulla densità/granularità (compreso il rapporto nucleo/citoplasma) delle cellule che passano attraverso il laser granulocito linfocito Sensore FALS Laser monocito Sensore per il 90 O LS

6 Quando si utilizza una sorgente laser, la quantita di luce scatterata lateralmente (perpendicolare allasse attraverso cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel canale del Side Scatter Anche lintensita del side scatter e proporzionale alla dimensione, forma ed omogeneita ottica delle cellule (o delle altre particelle analizzate)

7 Il Forward Scatter tende ad essere piu sensibile alle proprieta della superficie cellulare delle particelle e pertanto puo essere usato per distinguere cellule vive da cellule morte Il Side Scatter tende ad essere piu sensibile alle inclusioni presenti allinterno della cellula e pertanto puo essere usato per distinguere cellule granulate da quelle non-granulate. Proprietà tipiche del Forward e del Side Scatter

8 Sistema ottico del citofluorimentro cella di flusso filtri dicroici filtri bandpass Fotomoltiplicatori (PTMT) I fotomoltiplicatori, che raccolgono ed amplificano il segnale luminoso filtrato e ricevuto. In questo specifico caso, il PMT1 funziona come scatter a 90 gradi, e raccoglie la luce rifratta/diffratta (scatterata) dalle cellule. I filtri dicroici, i bandpass filtri permettono il passaggio della luce solo ad una certa lunghezza donda.

9 Filtri ottici: rilevamento dei parametri fisici Sorgente luminosa Luce trasmessa Forward Scatter Filtro dicroico/specchio a 45 gradi

10 Esempio di analisi dei leucociti e gating elettronico Forward Scatter 90 Degree Scatter si possono facilmente identificare tre popolazioni: - linfociti, - monociti - granulociti. Si puo disegnare un gate elettronico che permetterà in seguito lanalisi del segnale di fluorescenza proveniente soltanto dalla popolazione scelta Leucociti del sangue periferico

11 Lo studio dei parametri fisici applicato a nuclei isolati (provenienti da cellule trattate con una soluzione ipotonica) permette anche di discriminare immediatamente cellule normali da cellule apoptotiche, i cui nuclei sono infatti condensati e raggrinziti, ovvero diminuiscono il FSC ed aumentano il SSC. Nuclei di linfociti normali o apoptotici Forward scatter 90 Degree scatter

12 I filtri ottici hanno il compito di pemettere il passaggio della luce emessa dai fluorocromi eventualmente legati alle cellule soltanto ad una certa lunghezza donda. Esempi di filtri ottici Standard Long Pass Filters 520 nm Long Pass Filter Sorgente luminosaLuce trasmessa Il filtro raccoglie la luce verde (tipicamente designata FL1),

13 Standard Short Pass Filters 575 nm Short pass Filter Sorgente luminosa Luce trasmessa Il filtro raccoglie la luce arancione (FL2). < 575 nm

14 Standard Band Pass Filters 630 nm Band Pass Filter Sorgente luminosa Luce trasmessa nm Un terzo filtro può raccogliere la luce emessa ad una lunghezza donda ancora maggiore (in questo caso, nella regione del rosso profondo).

15 In questo esempio, riferito ad un paziente con infezione da HIV, sono stati identificati i linfociti in base al Forward e Side scatter, e su queste cellule è stata fatta lanalisi delle sottopopolazioni con anticorpi anti-CD3 (in FL1), anti-CD4 (in FL2) ed anti-CD8 (in FL3). Raccolta della fluorescenza da una popolazione Fluorescence detectors Laser

16 Il Sorting cellulare FALS sensor Fluorescence detector Piastre cariche elettricamente Cellule singole separate dentro diverse provette FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting


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