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RLH e NLR: il riconoscimento citoplasmatico del pericolo.

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Presentazione sul tema: "RLH e NLR: il riconoscimento citoplasmatico del pericolo."— Transcript della presentazione:

1 RLH e NLR: il riconoscimento citoplasmatico del pericolo

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3 (Alarmins) DAMP DAMP: Damage Associated Molecular Patterns

4 Come DC, Macrofagi e mastociti sentono il pericolo…

5 RLH (RIG-I like helicases) RIG-I retinoic acid inducible gene I MDA5 melanoma differentiation associated gene 5 LGP2 laboratory of genetics and physiology 2 Riconoscimento di virus a RNA Produzione di IFN di tipo I Risposta immunitaria anti-virale (apoptosi di cells infettate, resistenza antivirale, prodiuzione RLH, attivazione NK & T cells)

6 DExD/H-containing RNA helicases RIG-I: riconoscimento di ssRNA 5ppp MDA5: riconoscimento di dsRNA (poly I:C) LGP2: inibitore dei RLH, funzione fisiologica? Caspase Recruitment domain

7 Come si attiva RIG-I?

8 CTD --> C terminal domain, corrisponde a Repressor Domain CTD --> contiene il dominio di riconoscimento dellRNA In presenza ATP --> cambio conformazione helicasi --> rilascio di CARD --> interazioni con RIG-I/IPS

9 CARD dominio responsabile della cascata di trasduz. IPS (IFN promoter stimulator 1) o CARDIF TRAF3 (E3 ubiquitin ligasi) IKK-related kinasi: TBK-1 & IKKi Fosforilaz IRFs e formaz omo/etero dim ISRE (IFN-I stimulated response element)

10 NLR (NOD-Like Receptors): i NOD & lINFLAMMOSOMA 3 DOMINI: LRR --> riconoscimento ligando NACHT -> oligomerizzazione CARD/PYD/… --> reclutamento

11 NOD1 & NOD2 Cosa riconoscono… PEPTIDOGLICANO - PGN: componente parete batteri GRAM+ e GRAM- - Polimero di glicani che alterna N-acetiglucosamina (NAG) e acido N-acetilmuramico (NAM) -I polimeri NAM-NAG sono collegati da ponti peptidici

12 GRAM postive: Lysina GRAM negative: Acido meso-diapinopimelico

13 Come PGN entra in ocntatto coi NODs? Batteri intracellulari con ciclo replicativo nel citosol: LISTERIA, SHIGELLA accesibilità DIRETTA Batteri intracellulari che restano in fagosomi: SALMONELLA, MYCOBATTERIO Batteri estracellulari TRASOPRTATORI per muramildipeptide: CD14, PepT1, PepT2

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15 Riconoscimento dellAg --> cambio conformazionale --> oligomerizzazione via NACHT --> reclutamento di RICK (RIP2) via CARD Ubiquitinazione di RIP2 via TRAF (2/5; 6) --> reclutamento di TAK1 --> formazione del complesso TAK1/TAB1/2/3

16 Il complesso TAK1/TAB1/2/3 induce sia lattivazione di AP1 che del complesso IKK,, che porta allattivazione di NFkB TAK1 e RIP2 portano anche allattivazione di CARD9 e alla conseguente attivazione di p38

17 Mutazioni in NODs NOD2 --> frame-shift, induce NOD2 senza LRR terminale (no detection di PGN): MALATTIA DI CHRON, infiammazione aberrante a lvl intestinale, probabilm dovuta a mancata risposta a lvl delle mucose con conseguente induzione di risposta anti-batterica sistemica NOD1 --> mutazioni associate a ASMA, eczema atopico, …

18 LINFLAMMOSOMA LRR --> per riconscimento ligando NOD/NACHT --> per multimerizzazione CARD o PYD --> reclutamento caspasi

19 Ruolo dellattivazione dellINFLAMMOSOMA Attivazione della CASPASI-1 Trasformazione di pro-IL-1 e pro-IL-18 in IL-1 e IL-18

20 IL-1 e IL-18 Attivazione della cascata infiammatoria Effetto su cells immunità innata e sui tessuti BLOCCO diffusione patogeno

21 IL-1 IL-1 media numerose funzioni: a)Attivazione cells endoteliali b)Produzione IL-6 c)Shock endotossico indotto da LPS d)Attivazione linfociti

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23 Proprio per i sui effetti pleiotropici la produzione di IL-1 deve finemente regolata La produzione deregolata o eccessiva di IL-1 può causare danno tissutale (tossicità a lvl isole pancreas e neuroni) e patologie infiammatorie Doppia regolazione per la secrezione di IL-1 attiva: 1)Via PAMP e TLR viene indotta la sintesi del trascritto della pro-IL-1 2)Un secondo segnale -INFLAMMOSOMA- induce il taglio proteolitico della pro-IL-1 a IL-1

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25 IL18: ruolo fondamentale nellattivazione delle cellule NK In vitro exps: NK cells BM-DCs wt/KO spleen DC-NK cell coculture ELISA for IFN- γ wt/KO bone marrow Y LPS recombinant cytokines neutralizing Abs O.N. GM-CSF

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27 ifnb -/-, il18 -/-, il2 -/-,tlr4 -/- B6 or WT 100% GFP-DOG Double transgenic B6: Ub-GFP DOG (CD11c promoter-DTR) 10-day DT treatment 20% 80% Mixed BM chimera ICS for IFN- γ CD11c hi DCs NK cells/BM cells % KO 80% GFP-DOG 20% KO 80% GFP-DOG 100% KO >20% KO <80% GFP-DOG Lethally irradiated A, Mixed BM chimera experimental design. B, ICS for IFN gamma: 5h after LPS injection, spleens were collected and NK cell analyzed for their capacity to produce IFN gamma. IL18: ruolo fondamentale nellattivazione delle cellule NK In vivo exps:

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29 Linflammosoma è una PIATTAFORMA di proteine il cui assemblaggio porta allattivazione della CASPASI in grado di tagliare le pro-IL a dare le interleukine funzionali La base di questa piattaforma è data dai NLR (14 NALP + Ipaf + NAIP)

30 NALP3 INFLAMMOSOMA

31 Lattivazione dellinflammosoma porta alla attivazione della CASPASI-1 o ICE (IL-1 Converting Enzyme). ICE è il prototipo delle CASPASI INFIAMMATORIE. Caspasi proinfiammatorie: CASPASI 1, 4 e 5 in uomo CASPASI 1, 11 e 12 in topo Unico substrato noto: IL-1 e IL-18 per ICE Quando WESTERN BLOT ha permesso di distinguere pro-IL-1 (31kD) e IL-1 (17kD) da estratti frazionati di monociti umani in grado di indurre qto processo è stata isolata ICE

32 Caspasi-11 (topo) e 4/5 (uomo): Topi resistenti a shock settico (Caspasi-1!!!) Attivatore a monte di caspasi 1 Caspasi-12: Selezione positiva durante evoluzione di una forma di caspasi-12 troncata in dominio CARD Topi ko hanno migliore clearance dei batteri e maggiori lvl di IL-1, IL-6 IPOTESI: decoy caspasi che controbilancia effetti caspasi-1

33 CASPASI --> Cysteine proteasi che tagliano dopo un acido aspartico originariamente scoperte nellattivazione del porcesso apoptotico Tutte le caspasi esistono come zymogeni Le caspasi esecutive sono le capsasi-3, -6 e -7 che sono attivate da caspasi iniziatrici (2, 8, 9, 10) e che inducono lattivazione del processo APOPTOTICO. Per essere attivate qte caspasi devono essere assemblate su una piattaforma che utilizza la porteina Apaf che ha tre domini: 1)CARD per reclutare capsasi-9 2)NB-ARC per oligomerizzare 3)WD repeat per sentire il rilascio del citocromo C dai mitocondri

34 CASPASI INFIAMMATORIE attivate da NLR. Tre gruppi principali di INFLAMMOSOMI:

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37 Cosa induce lattivazione di NALP:

38 Antrace LeTx --> azione su NALP1 (topi ko resistenti) Forse no Pyd (--> ASC) utilizzato MA CARD-CARDINAL

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40 PATOLOGIE ASSOCIATE A DEREGOLAZIONE NELLA PRODUZIONE DI IL-1 CRIOPIRINOPATIE: Sottofamiglia di sindrome febbrile periodica ereitaria (SFPE), caratterizzata da ricorrenti fenomeni febbrili inspiegabili e processi infiammatori molto forti. NO segni autoimmunità (auto-Ab/T autoreative) Mutazione MISSENSO in NACHT di NALP3 --> GAIN OF FUNCTION --> alti livelli di IL-1 --> Pazienti rispondono a trattam con IL-1Ra MALATTIE AUTOINFIAMMATORIE FMF E PAPA: 2 patologie dovute ad alterazione dominio PYR di NALP3.

41 GOTTA: Alterazione del metabolismo delle purine --> formazione di cristalli di acido urico (MSU) nelle genture --> attivazione NALP3 --> pazienti rispondono a IL1Ra VITILIGINE: Depigmentazione della pelle per assenza porgressiva melanociti. Associazioni genetiche a locus NALP1 Mutaz attivatoria --> maggiore IL1 --> aumentata attivazione T cells --> cloni T autoreattivi

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