La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

CENTRO DI RICERCA SULLE TECNOLOGIE FARMACEUTICHE TRADIZIONALI ED INNOVATIVE NANOPARTICELLE PER IL DIREZIONAMENTO CEREBRALE DI FARMACI G. Tosi G. Tosi*,

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "CENTRO DI RICERCA SULLE TECNOLOGIE FARMACEUTICHE TRADIZIONALI ED INNOVATIVE NANOPARTICELLE PER IL DIREZIONAMENTO CEREBRALE DI FARMACI G. Tosi G. Tosi*,"— Transcript della presentazione:

1 CENTRO DI RICERCA SULLE TECNOLOGIE FARMACEUTICHE TRADIZIONALI ED INNOVATIVE NANOPARTICELLE PER IL DIREZIONAMENTO CEREBRALE DI FARMACI G. Tosi G. Tosi*, L. Costantino*, F. Gandolfi*, B. Ruozi*, F. Rivasi**, F. Forni*, M.A. Vandelli* * Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Università di Modena e Reggio Emilia,Via Campi 183, Modena **Dipartimento Integrato Servizi Diagnostici e di Laboratorio e di Medicina Legale, Università di Modena e Reggio Emilia, Via del Pozzo 71, Modena. 45° Simposio AFI 2005

2 DIREZIONAMENTO DI FARMACI al Sistema Nervoso Centrale Patologie cerebrali come tumori, demenza da HIV, ischemie Patologie cerebrali come tumori, demenza da HIV, ischemie Difficoltà di raggiungere concentrazioni sufficienti nei distretti cerebrali Difficoltà di raggiungere concentrazioni sufficienti nei distretti cerebrali Barriera Ematoencefalica (BEE) Barriera Ematoencefalica (BEE) Superamento della BEE Superamento della BEE 45° Simposio AFI 2005

3 Barriera Ematoencefalica Mancanza di fenestrature nelle cellule endoteliali di vasiMancanza di fenestrature nelle cellule endoteliali di vasi Giunzioni occludenti fra le cellule delle pareti vascolariGiunzioni occludenti fra le cellule delle pareti vascolari Alto numero di tight-junctionAlto numero di tight-junction Basso numero di vescicole pinociticheBasso numero di vescicole pinocitiche Processi metabolici alteratiProcessi metabolici alterati 45° Simposio AFI 2005

4 Passaggio attraverso BEE di sostanze A. Diffusione transcellulare; B. Diffusione paracellulare; C. Trasporto mediato da Carrier; D. Endocitosi in fase fluida; E. Endocitosi per assorbimento; F. Endocitosi mediata da recettore; G. Efflusso. 98% dei farmaci utilizzabili in patologie cerebrali non supera la BEE (peso molecolare, polarità) 45° Simposio AFI 2005

5 Approcci invasivi Rottura temporanea delle tight-junction Infusione intracerebrale, o impianti intracerebrali (Cateteri, microchip, sistemi polimerici) 45° Simposio AFI 2005

6 Approcci non invasivi Pro-drugPro-drug Coniugazione dei farmaci con un vettore di trasporto quali proteine modificate, anticorpi monoclonali, recettori di barrieraConiugazione dei farmaci con un vettore di trasporto quali proteine modificate, anticorpi monoclonali, recettori di barriera Nanoparticelle e liposomiNanoparticelle e liposomi 45° Simposio AFI 2005

7 Nanoparticelle Sistemi polimerici di dimensioni nanometriche di forma sferica Sistemi polimerici di dimensioni nanometriche di forma sferica Polimeri biodegradabili e biocompatibili Polimeri biodegradabili e biocompatibili Non tossici ed immunogenici Non tossici ed immunogenici Copolimero acido lattico e glicolico (PLGA) Copolimero acido lattico e glicolico (PLGA) 45° Simposio AFI 2005

8 Modificazioni del polimero Limitata permeabilità della BEE da parte di Np di PLGA Limitata permeabilità della BEE da parte di Np di PLGA Modificazioni con molecole ligando-specifiche Modificazioni con molecole ligando-specifiche Internalizzazione mediata da recettore Internalizzazione mediata da recettore Peptidi oppioidi Peptidi oppioidi MMP-2200 (H 2 N-Tyr-D-Thr-Gly-Phe-Leu-Ser-O- -D- lactose-CONH 2 ) * MMP-2200 (H 2 N-Tyr-D-Thr-Gly-Phe-Leu-Ser-O- -D- lactose-CONH 2 ) * *R. Polt, M.M. Palian Glycopeptide analgesics, Drugs Fut. 26 (6) (2001) ° Simposio AFI 2005

9 Modificazione del polimero Sintesi di analogo peptidico * (H 2 N- Gly-Phe-D-Thr-Gly-Phe-Leu-X-CONH 2) Sintesi di analogo peptidico * (H 2 N- Gly-Phe-D-Thr-Gly-Phe-Leu-X-CONH 2) Sostituzione della molecole di Tyr con Phe per evitare leffetto oppioide ** Sostituzione della molecole di Tyr con Phe per evitare leffetto oppioide ** Coniugazione col polimero (PLGA) tramite legame ammidico Coniugazione col polimero (PLGA) tramite legame ammidico Caratterizzazione tramite NMR 200/400, Spettrometria di Massa Caratterizzazione tramite NMR 200/400, Spettrometria di Massa Ser-OH Ser-O- -D-glucose Ser-O- -D-galactose Ser-O- -D-xylose Ser-O- -D-lactose X * Costantino L., Vandelli M.A., Forni F., Peptidi per la veicolazione di farmaci., Italian Patent n° MI2004A002353, 2004 ** A. F. Casy, R.T. Parfitt, Opioid analgesics. Chemistry and receptors, Plenum, New York, 1986, pp ° Simposio AFI 2005PLGA CO NH-Peptide

10 Studi in vivo Studi in vivo Determinazione posizione delle Np Determinazione posizione delle Np 1. Farmaci radiomarcati ( 3 H) incapsulati in nanoparticelle 2. Farmaci fluorescenti incapsulati in nanoparticelle (6- cumarina 1, fluorescenza verde) 3. Polimero radiomarcato ( 14 C) 6-cumarina Approcci di letteratura Superamento BEE 1 Panyam J, et al. Fluorescence and electron microscopy probes for cellular and tissue uptake. Int J Phar 2003;262: ° Simposio AFI 2005

11 Limiti Sperimentazioni in vitro su colture cellulariSperimentazioni in vitro su colture cellulari Utilizzo di sostanze radioattiveUtilizzo di sostanze radioattive Valutazione quantitativa della radioattività in omogenati di tessuti (microcircolazione e parenchima) dopo sperimentazioni in vivoValutazione quantitativa della radioattività in omogenati di tessuti (microcircolazione e parenchima) dopo sperimentazioni in vivo Nessuna informazione sulla POSIZIONE delle nanoparticelle nei tessuti in vivo 45° Simposio AFI 2005

12 Modificazione del PLGA Modificazione del PLGA Utilizzo della microscopia a fluorescenza Utilizzo della microscopia a fluorescenza Fluoresceina Rodamina Np costituite da PLGA modificato con Fluoresceina (F-Np) Np costituite da PLGA modificato con Rodamina (R-Np) 45° Simposio AFI 2005

13 Sequenza glicopeptidica, molecola direzionante verso la BEE (P-PLGA) Sequenza glicopeptidica, molecola direzionante verso la BEE (P-PLGA) PLGA modificato con marker fluorescenti F-PLGA R-PLGA PLGA modificato con marker fluorescenti F-PLGA R-PLGA Np costituite da 80% P-PLGA e da 20% F-PLGA o R-PLGA Np costituite da 80% P-PLGA e da 20% F-PLGA o R-PLGA Np con una molecola ligando-specifica per BEE e con Fluoresceina e Rodamina come marker per la fluorescenza (F-L-Np) (R-L-Np) Np con una molecola ligando-specifica per BEE e con Fluoresceina e Rodamina come marker per la fluorescenza (F-L-Np) (R-L-Np) NP Pep Rodamina Pep Fluor Preparazione delle Np 45° Simposio AFI 2005

14 Caratterizzazione della superficie delle Np modificate Electron Spectroscopy for Chemical Analysis (ESCA) per valutare la posizione dei peptidi sulla superificie delle Np Electron Spectroscopy for Chemical Analysis (ESCA) per valutare la posizione dei peptidi sulla superificie delle Np 45° Simposio AFI 2005 Presenza dellAzoto sulla superficie delle Np Dislocazione del Peptide verso lesterno della NP NP Pep Pep Pep Pep Pep Pep Pep Pep

15 Sperimentazione in vivo Perfusione cerebrale (In situ brain perfusion technique) Perfusione cerebrale (In situ brain perfusion technique) Infusione in vena femorale. Infusione in vena femorale. Ratti maschi Wistar Hannover (n° 50), 300 g. Ratti maschi Wistar Hannover (n° 50), 300 g. Takasato Y, Rapaport SI, Smith QR. An in situ brain perfusion technique to study cerebrovascular transport in the rat. Am J Physiol 1984;247:H ° Simposio AFI 2005

16 Fluorescenza Trattamento degli organi (cervello, fegato, reni, milza): azoto liquido Trattamento degli organi (cervello, fegato, reni, milza): azoto liquido Cervello suddiviso in tre aree: anteriore, mediana, posteriore Cervello suddiviso in tre aree: anteriore, mediana, posteriore Taglio con criotomo di campioni di 5 m Taglio con criotomo di campioni di 5 m DAPI (4'-6-Diamidino-2-fenilindolo)* DAPI (4'-6-Diamidino-2-fenilindolo)* Interazione con le catene del DNA e colorazione Blu dei complessi Interazione con le catene del DNA e colorazione Blu dei complessi Microscopio a fluorescenza con filtro FITC, TRITC e DAPI Microscopio a fluorescenza con filtro FITC, TRITC e DAPI Trattamento con Ematossilina eosina per struttura morfologica Trattamento con Ematossilina eosina per struttura morfologica * Xu Z, et al. Modulation of nucleic acid structure by ligand binding: induction of a DNA·RNA·DNA hybrid triplex by DAPI intercalation. Bioorg & Med Chem 1997;5(6): SUDDIVISIONE DELLENCEFALO DEL RATTO COLORAZIONE CON EMATOSSILINA-EOSINA PER MORFOLOGIA PER MORFOLOGIA Vaso cerebrale DAPI-Nuclei 45° Simposio AFI 2005

17 PERFUSIONE CEREBRALE

18 F-Np Vasocerebrale Vaso cerebrale Localizzazione nei vasi cerebraliLocalizzazione nei vasi cerebrali Integrità della BEEIntegrità della BEE 12 Nuclei-DAPI Perfusione cerebrale di Np fluorescenti NON modificate (100% F-PLGA) 45° Simposio AFI 2005

19 1. Adesione alla parete dei vasi 2. Localizzazione cellulare delle nanoparticelle F-P-Np Vasocerebrale Parenchimacerebrale Parenchimacerebrale Parenchimacerebrale Perfusione cerebrale di Np fluorescenti modificate (F-P-Np) 45° Simposio AFI 2005

20 Perfusione cerebrale di Np fluorescenti modificate (R-P-Np) R-P-Np 45° Simposio AFI 2005 Parenchimacerebrale Np superano BEE in virtù della presenza della modificazione sul polimeroNp superano BEE in virtù della presenza della modificazione sul polimero

21 PERFUSIONE FEMORALE

22 Uptake epatico Uptake epatico Parenchima epatociti Tempo: 0-30 minuti Perfusione femorale di F-P-Np e R-P-Np F-P-NpR-P-Np 45° Simposio AFI 2005

23 Tempo minuti Perfusione femorale di Np fluorescenti modificate (R-P-Np) Parenchima epatico 45° Simposio AFI 2005 Parenchima splenico R-P-Np

24 Tempo minuti Perfusione femorale di Np fluorescenti modificate (R-P-Np) Parenchima cerebrale 45° Simposio AFI 2005 By pass del uptake epatico By pass del uptake epatico Selettività verso BEE Selettività verso BEE Superamento della BEE Superamento della BEE R-P-Np

25 Studi al microscopio confocale 45° Simposio AFI 2005 F-P-Np R-P-Np Singolo piano nello spessore del campioneSingolo piano nello spessore del campione Np e Cellule Cerebrali sono co-localizzate e in stretto contattoNp e Cellule Cerebrali sono co-localizzate e in stretto contatto

26 Microscopio confocale: Ricostruzione Tridimensionale Np e parenchima cerebrale F-P-NpR-P-Np 45° Simposio AFI 2005

27 Conclusioni Sintesi di un nuovo eptapeptide simil-oppioide come molecola ligando specifica per il superamento della barriera ematoencefalica Sintesi di un nuovo eptapeptide simil-oppioide come molecola ligando specifica per il superamento della barriera ematoencefalica Coniugazione PLGA con peptide e marker fluorescenti (Fluoresceina e Rodamina) Coniugazione PLGA con peptide e marker fluorescenti (Fluoresceina e Rodamina) Test in vivo di perfusione cerebrale e femorale Test in vivo di perfusione cerebrale e femorale Studi di microscopia a fluorescenza e confocale Studi di microscopia a fluorescenza e confocale 45° Simposio AFI 2005

28 Conclusioni Perfusione Cerebrale Perfusione Cerebrale Internalizzazione delle Np modificate col ligando specifico (F-P-Np e R-P-Np) Internalizzazione delle Np modificate col ligando specifico (F-P-Np e R-P-Np) Evidenza di una extravasazione delle Np modificate rispetto alle analoghe non modificate la cui localizzazione è limitata ai vasi Evidenza di una extravasazione delle Np modificate rispetto alle analoghe non modificate la cui localizzazione è limitata ai vasi Ipotizzabile passaggio della BEE in conseguenza della modificazione della Np Ipotizzabile passaggio della BEE in conseguenza della modificazione della Np Perfusione Femorale Perfusione Femorale Np modificate bypassano uptake epatico per localizzarsi a livello cerebrale Np modificate bypassano uptake epatico per localizzarsi a livello cerebrale 45° Simposio AFI 2005

29 Si ringrazia: Centro Interdipartimentale Grandi Strumenti (CIGS) dellUniversità di Modena e Reggio Emilia Centro Interdipartimentale Grandi Strumenti (CIGS) dellUniversità di Modena e Reggio Emilia Dipartimento integrato Servizi Diagnostici e di Laboratorio e di Medicina Legale, Sezione di Anatomia Patologica, Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia Dipartimento integrato Servizi Diagnostici e di Laboratorio e di Medicina Legale, Sezione di Anatomia Patologica, Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia Fondazione Cassa di Risparmio di Modena e Reggio Emilia Fondazione Cassa di Risparmio di Modena e Reggio Emilia 45° Simposio AFI 2005


Scaricare ppt "CENTRO DI RICERCA SULLE TECNOLOGIE FARMACEUTICHE TRADIZIONALI ED INNOVATIVE NANOPARTICELLE PER IL DIREZIONAMENTO CEREBRALE DI FARMACI G. Tosi G. Tosi*,"

Presentazioni simili


Annunci Google