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CHIMICA ANALITICA DEGLI INQUINANTI Docente : Daniele FABBRI

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1 CHIMICA ANALITICA DEGLI INQUINANTI Docente : Daniele FABBRI
corso di CHIMICA ANALITICA DEGLI INQUINANTI Laurea specialistica - Scienze Ambientali Università di Bologna - Ravenna Docente : Daniele FABBRI Parte VIII 1 - analisi inquinanti organici Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

2 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
SELETTIVITA’ : esprime la capacità di un metodo analitico di determinare un particolare analita senza interferenza dai componenti della matrice, ovvero di discriminare fra analita e sostanze strutturalmente simili. (Il termine specificità è spesso usato come sinonimo). La presenza di eventuali interferenti può essere riconosciuta attraverso l’analisi di opportuni bianchi (matrice, matrice fortificata con un sospetto interferente, …). L’interferente può: far ritenere che l’analita sia presente quando invece è assente (falso positivo); impedire l’identificazione dell’analita (falso negativo); influenzare il dato quantitativo. La selettività’ può essere conseguita nella varie fasi della procedura analitica: selettività nel trattamento del campione. I potenziali interferenti sono eliminati nella fase di trattamento del campione. Esempio: scelta opportuna delle condizioni di estrazione in fase solida (SPE), cromatografia di affinità, polimeri ad impronta molecolare, estrazione con un chelante, ecc. selettività nel sistema di separazione cromatografica. I potenziali interferenti eluiscono in tempi diversi dall’analita. Scelta opportuna delle condizioni di analisi GC e HPLC, GC multidimensionale (GCn). selettività nel metodo di rivelazione. L’analita è determinato preferenzialmente rispetto agli interferenti che co-eluiscono. In spettrometria di massa possono essere usate tecniche molto selettive. Esempio: HRMS (alta risoluzione), SIM (selected ion monitoring), SRM (selected reaction monitoring, in MS/MS). Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

3 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
All’aumentare del numero di passaggi gli errori possono aumentare ed il segnale diminuire, ma a vantaggio di un aumento del rapporto segnale/disturbo. passaggi dell’analisi intensità 1 2 3 4 segnale noise S / N RG Cooks, KL Busch, J.Chem.Educ. 59(1982)926. Esempio tipico : la MSn comporta una diminuzione dell’intensità del segnale all’aumentare di n, ma con un deciso aumento del rapporto segnale/disturbo. Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

4 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
gascromatografia capillare - CGC (GLC) R sistema di iniezione I gas di trasporto fase mobile forno colonna capillare rivelatore stazione dati MS AED ECD NPD FID fg pg ng mg intervallo di utilizzazione rivelatore selettività logIDL-LOD ID termoconducibilità TCD universale (gas) > ng tr ionizzazione di fiamma FID universale (idrocarburi) 6/ <ng tr cattura di elettroni ECD specifico RX (organoalogenati) 2/3 - pg tr/sp emissione termoionica NPD specifico N e P (pesticidi) 5/7 - pg tr/sp fotometrico di fiamma specifico P e S (pesticidi) < ng tr/sp emissione atomica AED elemnto specifico (TBT, RHg) spettrometria di massa - EI, PCI, NCI, MSn, HRMS… * tr: tempo di ritenzione; sp: specificità della tecnica Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

5 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
HPLC high performance liquid chromatography fase mobile liquido sistema di iniezione I R rivelatore stazione dati colonna rivelatore selettività sensibilità ID indice di rifrazione universale bassa tr assorbimento UV-vis- DAD cromofori (fenoli, IPA, der.) buona tr / spettro UN fluorimetria Fl fluorofori (IPA, derivatizz.) elevata tr / sp emissione atomica ICP-AES elemento specifico (R-As) spettrometria di massa - ESI, APCI, ICP-MS, MSn * tr: tempo di ritenzione; sp: specificità della tecnica Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

6 moderatamente polari non polari
Campi di applicazione POLARITA’ analita ionici, ionizzabili, polari ESI proteine peptidi APCI sterodi moderatamente polari non polari GC-MS VOC, IPA, POPs PESO MOLECOLARE analita volatili, semi-volatili Composti polari-ionici derivatizzabili: X-CH3, X-SiMe3, X-CO-CF3 Fenoli, acidi grassi, steroli, zuccheri, amminoacidi, alcaloidi (metaboliti) Macromolecole  degradazione chimica, pirolisi Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

7 Lo spettrometro di massa
spettrometria di massa Lo scopo analitico della spettrometria di massa è quello di convertire il campione in prodotti misurabili indicativi delle molecole originali. I prodotti sono ioni le cui masse (o i rapporti massa su carica) e abbondanze relative costituiscono lo spettro di massa. Lo spettrometro di massa separa gli ioni secondo il loro rapporto massa su carica m/z. Introduzione del campione conversione in una forma adatta alla ionizzazione GC-HPLC Elaborazione dati vuoto sorgente ionica analizzatore di massa Collettore. Rivelatore di ioni accelerarli formare ioni gassosi dell’analita Separarli nello spazio (deviandoli su traiettorie ) o nel tempo (traiettorie uguali in tempi ) in base al rapporto m/z (energia,velocità, momento). Misurare la loro abbondanza relativa. Elettromoltiplicatore Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

8 RAPPORTO MASSA/CARICA
CARATTERISTICHE DI UNO IONE Mz+ MASSA Viene espressa in unità di massa atomica. unità di massa atomica u (chiamata anche dalton, Da) : 1/12 della massa di un atomo di 12C. 1 u = 1 Da = g. Massa media (o chimica): calcolata usando le masse atomiche medie (pesate sugli isotopi naturali di ogni elemento). Massa atomica media Am dell’elemento A che in natura ha n isotopi, ciascuno con massa Ai e abbondanza naturale Pi: Am = P1A1 + P2A2 + … + PnAn Massa nominale: calcolata usando il numero intero della massa dell’isotopo predominante di ciascun elemento. Ioni diversi che hanno la stessa massa nominale sono detti isobari. Massa monoisotopica: calcolata dalle masse degli isotopi predominanti di ciascun elemento. La misura della massa esatta di uno ione con sufficiente accuratezza definisce in modo univoco la composizione elementare dello ione. La massa esatta viene determinata con strumenti ad alta risoluzione (HR). CARICA unità di carica è la carica dell’elettrone e. e = C. Carica totale q = numero delle cariche z • carica dell’elettrone e: q = z • e RAPPORTO MASSA/CARICA Rapporto massa su carica m/z: se massa espressa in u e carica in e, unità thompson (Th). Numero adimensionale se m/z espressa in numero di massa e numero di carica. Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

9 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
esempi L’unità di massa atomica è un’unità di misura ibrida. Indica una scala relativa il cui riferimento è l’atomo 12C a cui è stato assegnato il valore di 12u esatte. L’atomo 12C ha massa …u. L’atomo di 35Cl ha una massa volte più grande del 12C quindi la sua massa atomica è 12 x = Da. La massa esatta del 35Cl è : Da (numero decimale) La massa nominale del 35Cl è : 35 Da. (numero intero) La massa atomica media è utilizzata nei calcoli stechiometrici. Br Massa media = P181Br + P279Br = x x = u Le masse monoisotopiche sono utilizzate in MS per indicare le masse molari. Br2 La massa di Br2 è 158u per convenzione, anche se la specie più abbondante ha massa 160u. 79Br79Br 158u 51% “peso molecolare” in MS 158 79Br81Br 160u 100% ione più abbondante 160 81Br81Br 162u 49% CH3Br Massa media : x = u Massa nominale: x = 94u Massa monoisotopica (12C1H379Br): x = u Gli ioni CO+ , N2+ e C2H4+ sono isobari: hanno masse nominali uguali (28 Da), ma masse esatte diverse: CO u N u C2H u Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

10 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
Caratteristiche di un analizzatore di massa Limite di massa : valore più alto di m/z che può essere misurato. Applicabilità. Trasmissione : rapporto tra il numero di ioni che raggiungono il rivelatore e il numero di ioni prodotto nella sorgente. Sensibilità. Potere risolutore (risolutivo) : capacità di separare ioni con m/z vicini. Prestazioni analisi qualitativa. Risoluzione R: quando due picchi, il più piccolo dei quali ha altezza h, di massa m e m+Dm, sono separati da una valle che ha un’altezza pari al 10% di h, allora R = m / Dm (10% valley definition) 10%h m Dm 5%h h R = m / Dm Altre definizioni: Per i quadrupoli si usa la 50% valley definition di R. La risoluzione per un picco isolato è la larghezza del picco (Dm) a un altezza x% dell’altezza del picco. Spesso si usa X%= 50% e la Dm è chiamata FWHM (full width at half-maximum). Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

11 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
RISOLUZIONE Doppia focalizzazione Singola focalizzazione Quadrupolo HRMS settore magnetico Q fino a <  103 (unitaria) Per il quadrupolo la R è variabile lungo l’intervallo di massa (Dm è costante), per l’analizzatore magnetico è costante (Dm variabile: aumenta all’aumentare delle masse). Picchi adiacenti sono distinguibili se i loro rapporti d’intensità sono minori di 1:10. Per separare CO+da N2+è necessaria una risoluzione : R = / ( ) = 2493 Per separare gli ioni molecolari del tridecilbenzene (C19H32+, ) dal fenilundecilchetone (C18H28O+, ) è necessaria una risoluzione : R = 260 / ( ) = 7100 All’aumentare della massa aumenta l’utilità informativa della composizione elementare, e aumentano le richieste di risoluzione e accuratezza. Per aumentare la risoluzione bisogna diminuire la dispersione del fascio ionico (es.riduzione fenditura), il che determina una riduzione della sensibilità (meno ioni raggiungono il collettore). Per un analizzatore magnetico ha R = 1000. Per uno ione di massa 100,0000 Dm = 0.1, per uno ione di massa 1000,0000 Dm = 1. Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

12 (a + b)n = an + nan-1b + [n(n-1)/2!]an-2b2 + …
Picchi isotopici Una molecola contiene n atomi di un elemento che ha due isotopi di abbondanza naturale a e b. L’abbondanza relativa dei picchi isotopici segue una distribuzione binomiale: (a + b)n = an + nan-1b + [n(n-1)/2!]an-2b2 + … L’abbondanza relativa della molecola che ha k isotopi del tipo a è : [n!/k!(n-k)!]akbn-k Per più elementi le relazioni sono del tipo (a+b)n(c+d)m… Esistono programmi per il calcolo o figure per le abbondanze relative di cluster isotopici Elementi A+1 C, O, N. Il rapporto di intensità A+1/A dà informazioni sulla composizione elementare dello ione (es. numero massimo di atomi di C; massimo perchè al picco A+1 possono contribuire altri ioni, impurezze, etc.). A+1/A = nb Per il 13C b = 1.08%, con deviazioni di ~ 2% (20 ‰) a seconda della fonte. Per comodità si usa il valore 1.1%, tenendo conto del piccolo contributo del 2H (b = 0.015%).(Infatti, considerando 1.5 H per atomo di C si ha per A+1 : 1.08% + 1.5x(0.015%) = 1.1%). Lo ione monoisotopico non è necessariamente il più abbondante. Esempio molecole organiche: se la molecola ha più di 91 atomi di C, lo ione A+1 (per 13C) è più iintenso è più intenso dello ione A. Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

13 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
pattern isotopici Cl 2 Cl 3 Cl 4 Cl Br 2 Br 3 Br 4 Br Cl+Br Cl+2Br Cl+3Br 2Cl+Br Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

14 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
Picchi isotopici Esempio: (a + b)n = an + nan-1b + [n(n-1)/2!]an-2b2 + … per 35Cl e 37Cl a = 1 e b=0.32. Se una molecola ha n = 2 atomi di cloro la probablilità delle combinazioni 35Cl35Cl, 35Cl37Cl(37Cl35Cl) e 37Cl37Cl è, rispettivamente, 1x1, 2(1x0.32), 0.32x0.32, quindi le abbondanze relative sono: 1 : 0.64 : 0.10. (a + b)2 = a2 + 2ab + b2 = x1x = 1:0.64:0.10 (a+b)n(c+d)m CCl2Br2: x (1: 0.64 : 0.10) = 0.51, 0.32, 0.051, -----, -----, 1.0 x (1 : 0.64 : 0.10) = , 1.00, 0,64, 0,10, -----, 0.49 x (1 : 0.64 : 0.10) = , , 0.49, 0.31, 0.049 intensità relative per M, M+2, M+4, M+6, M , 1, 0.89, 0.32, 0.04. Esempio: A + 1 per il nitrobenzene C6H5NO2, l’intensità relativa di A+1 rispettto A è: 13C 6 x 1.08% = 6.48 % 15N 1 x 0.37% = 0.37 % 2H 5 x 0.015% = 0.07 % 17O 2 x 0.04% = 0.08 % totale: 7.0%. Esempio. A+2 Esempi: abbondanza di A+2 rispetto A (100%) per Si e S: Si1 3.4 % Si2 7.1 % Si3 11% S1 4.4 % S2 8.8 % Si3 13% Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

15 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
Per composti con peso molecolare < 1000 (relativamente basso: LMW) la risoluzione è sufficiente per separare ioni che differiscono solo per la composizione isotopica Esempio ione monoisotopico dallo ione satellite che contiene un 13C. La richiesta di risoluzione aumenta all’aumentare del peso molecolare, e per composti a peso molecolare elevato (HMW) i picchi isotopici potrebbero non essere separati. Esempio: C35H48N8O11S ione monoisotopico Da satellite 13C Da Risoluzione 786 C284H432N84O79S7 ione monoisotopico Da aprotina satellite 13C Da Risoluzione 6485 La risoluzione richiesta per separare ioni molecolari non è influenzata dal numero di cariche sulle ione: [C284H432N84O79S7]7+ ione monoisotopico Da aprotina satellite 13C Da Risoluzione 6487 Per uno ione con 10 cariche la separazione di massa apparente fra 12C e 13C è di 0.1 Da. Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

16 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
OE ioni a elettroni dispari (contengono un elettrone spaiato) EE ioni a elettroni pari (tutti gli elettroni sono appaiati). Gli EE sono più stabili degli OE . Numero di anelli e insaturazioni: Numero totale di anelli e doppi legami per uno ione (C, Si, …)x(H, F, Cl,..)y(N, P,…)z(O, S,…)n n = x - ½ y + ½ z +1 Per ioni a numero pari di elettroni, n può essere seguito da “ .5”. Esempio: ione benzoile C6H5-CO+: N = = 5.5. (N = 5  4 doppi legami + 1 ciclo). Regola dell’azoto: se il peso molecolare di un composto è un numero dispari, la molecola contiene un numero dispari di atomi di azoto. Per molecole contenenti C, H, O, N, S, P, Si, As, alogeni, metalli alcalini. Infatti, fra questi elementi solo N ha massa pari e valenza dispari, gli altri hanno sia massa che valenza entrambe pari o dispari. Parità di massa/parità di carica: uno ione che contiene 0, 2 , 4,… atomi di azoto è a numero dispari di elettroni (radicalcatione OE•+ o radicalanione) se ha massa pari, e a numero pari di elettroni (es.EE+) se ha massa dispari. La scarsità di picchi importanti a massa pari, soprattutto nella parte a masse basse dello spettro, indica che lo ione molecolare ha massa pari. L’opposto non è sempre vero (l’abbondanza di ioni pari non indica necessariamente uno ione molecolare di massa dispari). Picchi intensi di OE sono meno probabili di EE sopratutto alle masse inferiori. Le serie omologhe (es. M/z 57, 71, 85 degli alcani), sono tipiche di ioni EE. Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

17 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
TIPI DI IONI IONI (PSEUDO) MOLECOLARI. Forniscono un’informazione importante: il peso molecolare dell’analita. Lo ione molecolare si genera dalla molecola di analita per perdita o acquista di uno o più elettroni. Per definizione è il monoisotopico. In ionizzazione elettronica (EI) è un OE  (ione radicalico M , oppure M- ). Potrebbe essere molto instabile e frammentarsi prima di arrivare al rivelatore. Lo ione pseudomolecolare è formato dalla molecola analita per perdita di un protone o uno ione idruro, o per associazione con uno ione stabile.(formazione di un addotto) Nelle tecniche di ionizzazione soft è uno ione EE relativamente stabile; frammentandosi poco può aumentare la sensibilità della tecnica. Un esempio tipico è la molecola protonata MH+ (nota: non è lo ione molecolare protonato). Esempio: ionizzazione chimica con CH4: MH+ MC2H5+ MC3H5+ ionizzazione elettrospray ESI : ioni positivi MH+ MNa+ MNH4+ MK+ ; ioni negativi (M-H)-. Nella tecnica ESI si possono avere ioni multicarica: MH MH66+ …. FRAMMENTAZIONE. Gli ioni che si ottengono dalla frammentazione di ioni precursori (es. ione molecolare) forniscono informazioni sulla struttura dell’analita, utili per l’analisi qualitativa (riconoscimento). La loro produzione può essere importante nell’analisi quantitativa (specificità, riduzione S/N; es. tandem MS). OE produce un EE per rottura di un legame, un OE per rottura di due legami (riarrangiamento, frammentazione anello). Generalmente gi EE producono solo EE . OE  EE + OE OE  OE + EEo EE  EE + EE° EE  OE + OE poco probabile (formazione di due siti radicalici). Lo ione si frammenta per l’elevata energia interna acquistata nelle condizioni di ionizzazione hard (es. EI).Lo ione viene indotto a frammentarsi per collisioni con altre molecole (es. tecniche tandem MS). Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

18 EI ionizzazione elettronica
Formazione degli ioni. Metodi di ionizzazione in GC EI ionizzazione elettronica anodo di scarica Selettore ionico filamento Elettrodi di accelerazione (5000 V) focalizzazione fenditura All’analizzatore + 4930V + 5030V + 5010V + 4100V 0V P = 10-5 torr T = 200°C E’ una tecnica di ionizzazione hard. Gli elettroni sono emessi da un filamento riscaldato, vengono accelerati da un potenziale che è di 70V nella camera di ionizzazione. L’elettrone e¯ interagisce con la molecola M ionizzandola: M + e¯ M + 2 e¯ (elettroni secondari) M è lo ione molecolare. La frazione di molecole ionizzate è ca. 1:105. La ionizzazione è un processo veloce: s. L’energia di ionizzazione adiabatica (minima, ai livelli vibrazionali zero di M e M ) è tipicamente intorno ai 10 eV per molecole organiche (per atomi : 25 eV per He, 3.9 eV per Cs). Gli e¯ hanno una distribuzione gaussiana di energie cinetiche attorno ad un massimo di 70 eV. Energie di ionizzazione di alcune molecole (IE in eV): CH3-CH NH Et2O 9.5 CH2=CH PH Et2S 8.4 EtOH Et2Se 8.3 EtNH2 8.9 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

19 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
CI ionizzazione chimica Vantaggi. La CI (chemical ionisation) è una tecnica di ionizzazione soft, utile per conoscere il peso molecolare, e per introdurre sensibilità e specificità. Composti con una elevata affinità protonica PA (ammine) possono essere rivelati dall’analisi di ioni positivi prodotti per protonazione (PCI, positive chemical ionisation). Composti con un’elevata affinità elettronica EA (nitro, ciano, alogeni) possono essere determinati per cattura elettronica (NCI, negative chemical ionisation). Difficoltà. Lo spettro di massa in CI dipende molto dalle condizioni di ionizzazione in cui si lavora. Fattori importanti sono: T e P, tuning dei vari parametri strumentali, purezza del gas reagente (es. Impurità contenenti ossigeno disturabano notevolmente la NCI in EC), ecc. Data la bassa riproducibilità nelle abbondanze relative dei vari ioni, non esistono librerie di spettri CIMS per l’identificazione dei composti. L’affinità protonica (PA) misura la tendenza della specie M ad addizionare un protone (basicità di M in fase gassosa). E’ il negativo del termine entalpico della reazione: M + H+ = (M+H)+ PA (M) = - [DHf (M) + DHf(H+) - DHf(M + H)+] Quanto più PA è grande tanto più la reazione di protonazione è favorita. Valori tipici per composti organici: PA = kJ/mol. L’affinità elettronica (AE) misura la tendenza di una specie M ad acquistare un elettrone trasformandosi in un anione: M + e–  X– Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

20 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
PCI La ionizzazione è causata da reazioni ione-molecola Un gas reagente R viene introdotto nella sorgente ionica a pressioni relativamente alte ( torr). Poiché R è in forte eccesso rispetto al campione (104:1), si ha ionizzazione della specie R per ionizzazione elettronica (EI): R + e–  R+° + 2e– Si utilizzano elettroni ad elevata energia (500 eV) per aumentare le penetrazione e rendere più efficace la ionizzazione R+° reagisce con altre molecole R per formare specie ioniche reattive (ioni reagenti): R + R+°  RH+ + (R -H)° R + R+°  RH° + (R -H)+ Gli ioni reagenti reagiscono con le molecole di campione M: Reazione controllata da 1) trasferimento protonico: M + RH+  MH+ + R PA (favorita se PA(M)>PA(RH+) 2) estrazione di idruro: M + (R -H)+  (M-H)+ + R 3) formazione addotti M + RH+  MRH+ 4) trasferimento di carica: M + R+°  M+° + R energia di ionizzazione IE 70 m/z % m/z % CI MH+ 116 EI Spettri di massa EI e CI della prolina PM = 115 70 98 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

21 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
Esempio: gas reagente metano. Reazione con l’analita M + CH5+  (M-H)+ + CH4 + H2 M + CH5+  MH+ + CH4 M + C2H5+  MH+ + C2H4 M + C2H5+  (M-H)+ + C2H6 M + C2H5+  MC2H5+ M + C3H5+ MC3H5+ Formazione ioni primari: CH4 + e–  CH4+° + 2 e– CH4+°  CH3+ + H° Formazione ioni reagenti: CH4+° + CH4  CH5+ + CH3° CH3+ + CH4  C2H5+ + H2 se P elevata si forma anche C3H5+ Gas reagenti. Come sceglierli gas reagente ione reagente PA CH4 CH H2O H3 O MeOH MeOH iso-C4H10 (CH3)3C+ 8.5 NH3 NH L’energia interna delle specie M ionizzate dipende dal reagente scelto. Se PA (M) > PA(R) la formazione di MH+ è favorita, ma se PA(M)>>PA(R) MH+ può avere elevata energia interna e frammentarsi. L’energia interna delle specie M ionizzate (e quindi la possibilità di frammentazione) dipende dal reagente scelto e dalla T e P della camera di ionizzazione. Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

22 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
Per molti strumenti MS, basta cambiare le polarità per passare dalla rivelazione degli ioni positivi a quella degli ioni negativi. Esistono due processi principali per formare ioni negativi NCI cattura elettronica MX + e–  MX– estrazione di protone. B¯ + M  BH + [M - H]¯ agisce come acido di Bronsted cedendo un protone ad uno ione reagente Cattura elettronica (electron capture mass spectrometry, ECMS): Formazione di uno ione negativo per cattura di un elettrone a bassa energia (~ 0 eV) da parte del LUMO di un elettroforo MX. Un gas moderatore (es.metano, azoto a 1 torr) è bombardato con elettroni ad elevata energia ( es. 100 eV) prodotti da un filamento allo scopo di produrre elettroni secondari e ‘raffreddarli’ attraverso collisioni anelastiche. Il gas tampone stabilizza gli ioni negativi limitando la dissociazione. La cattura elettronica può essere: non-dissociativa: MX + e–  MX– dissociativa: MX + e–  M + X– La struttura molecolare e la T determinano il meccanismo predominante. Il processo non-dissociativo fornisce informazioni sul peso molecolare, e spesso è quello che si vuol favorire. La NCI è molto più sensibile della EI o PCI per certi analiti, anche perchè la velocità di cattura elettronica è molto maggiore di quella della reazione ione-molecola (gli elettroni hanno elevata mobilità). Però il processo è efficace per molecole con elevata affinità elettronica, EA, come composti organoalogenati. Un elettroforo contiene elementi elettronegatvi (F, Cl elevata EA) o sistemi coniugati (carotenoidi, orbitale vuoto a bassa energia). Selettività : pochi composti sono forti elettrofori (es. PCB, toxafeni). Sensibilità : elevata efficienza di cattura, formazione di un anione dominante. Derivatizzazione: per composti che non sono elettrofori: bromuro pentafluorobenzile. La diminuzione della selettività può richiedere HRMS, MS/MS. Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

23 Tecniche di ionizzazione a pressione atmosferica (API)
Metodi di ionizzazione in HPLC. Problema interfacciamento HPLC che opera con fasi liquide a pressione P atmosferica e flussi tipici di 1 mL/min con MS che opera in fase gassosa a P basse. Tecniche di ionizzazione a pressione atmosferica (API) Con i moderni HPLC-MS la Ionizzazione avviene a P atmosferica direttamente dalla soluzione all’interno dell’interfaccia. Lo spettrometro di massa è utilizzato per separare gli ioni e rilevarli. In generale, la ionizzazione dell’analita prevede i seguenti processi: formazione di goccioline dall’eluato HPLC. formazione di cariche sulle goccioline. eliminazione del solvente (desolvatazione). formazione di ioni dall’analita. Principali metodi di interfacciamento/ionizzazione in HPLC: elettrospray ESI ionizzazione chimica a pressione atmosferica APCI fotoinonizzazione a pressione atmosferica APPI Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

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ESI L’interfaccia electrospray (ESI) eluato HPLC Spray elettrostatico Elettrodo cilindrico Capillare ad elevato voltaggio Drying gas (N2 riscaldato) Skimmer contro elettrodo P atmosferica vuoto crescente alto vuoto analizzatore Nozzle Componenti: Capillare, ago metallico ad elevato voltaggio da cui esce la soluzione che viene spruzzata in un intenso campo elettrico Campi di 2-6 kV per ioni positivi; minori e a polarità inversa per ioni negativi. Le gocce elettricamente cariche sono dirette verso un contro-elettrodo che le attrae. Flusso di gas inerte caldo per favorire l’evaporazione del solvente (desolvatazione). Ottica ionica: campi elettrici che focalizzano il raggio ionico verso l’analizzatore. I principali vantaggi dell’ESI: E’ una tecnica di ionizzazione soft che permette l’analisi di composti termolabili e molto polari. Genera ioni multicarica. Si formano addotti con più protoni o ioni sodio (M + nH)n+ (M + nNa)n+ Composti ad elevato peso molecolare (HMW) formano macroioni molecolari multicarica che possono essere così rilevati con analizzatori MS che hanno limiti di massa minori della massa molecolare dell’analita. Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

25 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
Meccanismo di ionizzazione ESI + - - + + N2 N2 + + + + + MS - + + + - + + + + Nebulizzazione e ionizzazione all’uscita dell’ago. Formazione di goccioline (ca. 1 um) che vengono caricate elettricamente per azione del forte campo elettrico (5-10 kV cm-1). Desolvatazione ad opera del drying gas. Il solvente nelle goccioline evapora. Coulombic explosion. Dopo circa 100 us le dimensioni delle gocce sono ridotte al punto che le forze elettrostatiche di repulsione vincono le forze coesive della tensione superficiale. Le gocce esplodono producendo goccioline più piccole ( circa 10% del diametro iniziale). Ionizzazione dell’analita. I processi di desolvatazione e “collasso” delle goccioline continuano fino a che si formano ioni dell’analita in fase gassosa che vengono convogliati nell’analizzatore MS. Ci sono diverse ipotesi sul meccanismo di ionizzazione dell’analita: ion evaporation : se la goccia è sufficientemente piccola l’analita evapora in forma ionizzata<dalla goccia; charge-residue model: le successive esplosioni coulombiche generano gocce contenenti alla fine un solo ione; lo ione è trasferito nella fase gassosa a causa dell’evaporazione del solvente. Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

26 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
Composti analizzabili in ESI: Analiti che sono già in forma ionica in soluzione (es. acidi, basi). Composti neutri/polari che possono essere ionizzati per protonazione (M+H)+ e deprotonazione (M-H)-. composti non-polari che possono essere ossidati (ioni positivi) o ridotti (ioni negativi) nella punta del capillare. ESI Spettro di massa ESI di un composto HMW. Formazione di ioni multicarica. 687 773 884 fra due picchi consecutivi la carica cambia di un unità m/z 700 800 900 Spettro ESI del citocromo c M = Da Possono formarsi ioni per aggiunta di protoni: esempio (M+5H)5+ di ioni sodio esempio (M+5Na)5+ Determinazione del peso molecolare. dati sperimentali : (m/z)1 dello ione 1, (m/z)2 dello ione 2, …; incognita: peso molecolare M dell’analita; si assume che la carica dello ione 1 sia dovuta all’addizione di n1 protoni, dello ione 2 con n2 protoni, ecc. Per ioni consecutivi n2 = 1 + n1, ecc. M può essere calcolato per ogni coppia di ioni 1, 2, … del cluster di ioni molecolari di carica z1 = n1, z2 = n2, ecc. utilizzando le equazioni (esemplificate per la copppia di ioni 1 e 2): (m/z)1 = (M + n1(massa protone)) / n1 = (M + n1) / n1 (m/z)2 = (M + n2) / n2 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

27 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
APCI Metodi di ionizzazione in HPLC. atmospheric pressure chemical ionisation la fase liquida che esce dalla colonna HPLC è dispersa in piccole gocioline per azione del calore e di un gas nebulizzante. Lo spray è desolvatato e fatto passare in una regione calda dove viene vaporizzato. Le specie neutre passano in una regione dove si ha una scarica a corona (corona discharge) che ionizza il gas. Per interazione degli elettroni con le specie principali si ha formazione di ioni reagenti. Nella modalità di ioni positivi sono in genere le molecole di solvente protonato (in quella negativa, ioni O2-). Gli ioni reagenti ionizzano le molecole di analita in modo simile alla ionizzazione chimica convenzionale attraverso reazioni ione-molecola. Tipi di ioni: è una tecnica di ionizzazione soft. Si formano ioni molecolari con bassa energia, che hanno una scarsa tendenza a frammentarsi. Es. modalità ioni positivi modalità ioni negativi (M + H)+ , (M + NH4)+ (M - H)- (M + CH3COO)- I componenti dell’interfaccia sono simili a quelli dell’ESI; in alcuni HPLC-MS le due tecniche sono interscambiabili. Il meccansimo di ionizzazione è diverso da quello dell’ESI, per cui le due tecniche sono complementari. L’APCI è un processo di ionizzazione in fase gassosa, applicabile a molecole volatili e poco polari. Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

28 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
ESI forma macroioni multi-carica; adatta per analisi composti HMW (proteine, polimeri). Misure indipendenti di peso molecolare da un singolo spettro adatta per analisi composti polari e già ionizzati in soluzione (la ionizzazione si ha direttamente dalla soluzione). tecnica molto soft; adatta per analisi composti termolabili. Lo ione si forma direttamente nella fase mobile; il risultato dipende molto dalle condizioni sperimentali. Con opportuni sistemi per diminuire il flusso dell’HPLC convenzionale; possibilità di operareda nL/min a ml/L. APCI non forma ioni multicarica; non adatta per compostii HMW (limite di massa tipico 2000 Da). adatta per analisi composti volatili (LMW) e poco polari. Meno adatta per composti già ionizzati in soluzione. E’ una tecnica soft, ma richiede condizioni più drastiche dell’ESI. Composti termolabili non sempre analizzabili. ionizzazione simile alla CI convenzionale in fase gassosa; meno sensibile alle condizioni sperimentali e composizione fase mbile (tampone, Abbinamento diretto ai flussi tipici HPLC (1-2 mL/min). Tecniche soft. Produzione di ioni molecolari; spesso non informativi da punto di vista strutturale (analisi qualitativa); analisi dei frammenti ionici (indotta per collisione con molecole di gas oppure dissociazione nel sistema di ionizzazione Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

29 focalizzazione fascio ionico campo oscillante Vcoswt
analizzatori di massa QUADRUPOLO Q quadrupolo lineare Gli ioni sono separati in base al rapporto m/z sfruttando la stabilità delle loro traiettorie in campi elettrici oscillanti. - F° gli ioni con un determinato m/z attraversano il quadrupolo focalizzazione fascio ionico + F° formazione ioni gli ioni sono rilevati 2r° Alle aste viene applicato un potenziale totale F° dato dalla somma di un potenziale diretto U (non oscillante, DC) e un potenziale oscillante alla frequenza n (frequenza angolare w=2pn) di ampiezza V. F° = U + V coswt. Tipicamente U=5002000volt; V =-3000  +3000; n campo radiofrequenze (RF) campo oscillante Vcoswt campo costante U Le traiettorie degli ioni (soluzioni dell’equazione di Mathieu) sono stabili (e gli ioni arrivano al rivelatore) se i valori di x e y rimangono < ro; altrimenti gli ioni si scaricano contro le aste. y z x Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

30 triangolo di stabilità di m3
Per un dato quadrupolo ro e w sono costanti. Le variabili sono U e V. Per determinate coppie di valori U, V gli ioni con dato m/z hanno traiettorie stabili e sono rivelati. Aumentando U e V, e mantenendo il rapporto U/V costante, i vari ioni vengono rivelati in successione al crescere di m/z; si effettua così una scansione (scan). Diagramma di stabilità per ioni con masse m1 < m2 < m3 (z =1). U è variato linearmente in funzione di V, gli ioni m1 < m2 < m3 sono rivelati in successione. triangolo di stabilità di m3 V U m1 m2 m3 Per U=O (quadrupolo con solo RF) la risoluzione è zero. Il valore di V determina il valore minimo di m che deve avere lo ione per essere rivelato. V1 Es. Per V > V1 gli ioni con m<m1 sono instabili Hoffmann & Stroobant, Mass Spectrometry, 2002 Hubschmann, Handbook of GC/MS, 2001 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

31 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
Caratteristiche tipiche di un analizzatore a quadrupolo: Limite di massa < 4000 Th Risoluzione bassa (‘unitaria’, picchi separati se differiscono di almeno un’unità di massa) La risoluzione è ~ 3000 (oltre 3000 u i cluster isotopici non sono risolti; R aumenta aumentando L). Il potere risolutore è variabile lungo l’intervallo di massa (Dm costante); (scansione a velocità uniforme). Elevata sensibilità. Non richiede focalizzazione del raggio ionico all’ingresso. Elevata velocità di scansione; può superare i 1000Th/s; adatto per accoppiamento con GC. Analizza anche ioni negativi (indipendente dalla polarità). Altre caratteristiche: L’analisi non dipende dall’energia cinetica degli ioni che entrano nell’analizzatore (il tempo per attraversare il Q deve essere però breve rispetto alla scansione da una massa all’altra e abbastanza lungo da permettere alcune oscillazioni, per cui l’energia cinetica deve essere dell’ordine di eV). Gli ioni possono essere focalizzati al centro delle barre. Hoffmann & Stroobant, Mass Spectrometry, 2002 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

32 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
TRAPPOLA IONICA - IT IT La IT può essere immaginata come un quadrupolo piegato su se stesso a formare un anello chiuso: l’asta interna svanisce in un punto, l’asta esterna diventa un elettrodo circolare, l’asta inferiore e superiore due elettrodi a calotta. Il potenziale Fo è dato da un potenziale diretto DC U, e da un potenziale alternato RF, V: Fo = U + V coswt. Gli ioni sono tutti intrappolati da questo potenziale all’interno della sorgente in traiettorie stabili chiuse (orbite); nella trappola è presente He (10-3Torr) per far diminuire l’energia cinetica degli ioni tramite collisioni e concentrare gli ioni al centro della trappola, processo controbilanciato dalla repulsione elettrostatica. Le traiettorie stabili sono quelle che non superano i confini della trappola: r < ro, z < zo. La geometria della IT (ro,zo)èdefinita; fissata la frequenza n = 2pw, si opera a U=0, e si imposta V in modo da intrappolare tutti gli ioni che interessano. Aumentando V, gli ioni a valori di m/z crescenti raggiungono il limite di stabilità superato il quale vengono espulsi in sequenza lungo la direzione z; il 50% esce dalla calotta inferiore e colpiscono il rivelatore. z0 r0 filamento calotta superiore calotta inferiore elettrodo ad anello uscita ioni elettromoltiplicatore sezione trasversale della IT Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

33 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
ANALIZZATORE A SETTORE MAGNETICO B sorgente ionica (EI) regione di accelerazione. Gradiente di potenziale V. rivelatore settore magnetico Il campo magnetico agisce  alla direzione del moto; lo ione è deflesso in una traiettoria circolare Forza magnetica  F. centripeta = F.centrifuga zevB = mv2 / r r = mv2 / zeB ioni solo gli ioni con un determinato m/z hanno una curvatura r corrispondente a quella del settore magnetico. Variando l’intensità del campo elettrico V o magnetico B si misurano ioni con diverso m/z. All’uscita della regione di accelerazione uno ione di massa m e carica z ha un’ energia cinetica : zeV = ½ mv2 m/z = B2r2e / 2V a Limiti alla risoluzione. Cause : divergenza angolare del fascio ionico aberrazione energetica : v = (2zeV/m)1/2 ± Dv Formazione di ioni con velocità vi differenti in modulo e direzione (distribuzione di Boltzmann delle energie termiche dei precursori degli ioni, disomogeneità di campo). v + vi le traiettorie tendono a essere perpendicolari alle linee di campo equipotenziali (FOCALIZZAZIONE) ma c’è una certa divergenza de fascio ionico (a). Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

34 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
Spettrometri a doppia focalizzazione HRMS (high resolution mass spectrometry) Guadagno di risoluzione incorporando due analizzatori: a campo elettrostatico e campo magnetico. La HRMS permette la determinazione delle masse esatte (composizione elementare) e la separazione di ioni isobari, ma è una strumentazione molto costosa. divergenza angolare fascio ionico  focalizzazione della direzione operata dall’analizzatore magnetico dispersione energetica degli ioni  focalizzazione delle velocità operata analizzatore eletrostatico Analizzatore elettrostatico (ESA) Campo radiale V’ L’ESA uniforma le energie traslazionali compensando differenze nelle velocità iniziali. Ioni con troppa (poca) energia colpisono il polo positivo (negativo) + piano focale della direzione piano focale della energia punto di doppia focalizzazione (fenditura d’uscita, rivelatore) Analizzatore magnetico F.elettrica  F.centripeta =F.centrifuga zeV’ = mv2/r r = mv2 / zeV’ = 2V /V’ sorgente ionica regione di accelerazione zeV’ = mv2 / r zeV = 1/2 mv2/r Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

35 SELECTED ION MONITORING SIM
Tecniche combinate. GC-MS HPLC-MS METODI DI ACQUISIZIONE FULL SCAN Registrazione di tutti gli ioni di un determinato intervallo di massa (es. da m1 = 50 a m2 = 500 per monopositivi). Fornisce lo spettro di massa utile per l’identificazione (analisi qualitativa) La sensibilità può non essere sufficiente per l’analisi in tracce. La sensibilità diminuisce al diminuire del dwell time, Dt degli ioni. m1 m2 m(u) t(ms) scan time Nel Q gli ioni con un determinato m/z sono registrati per un tempo breve (ca. 1 ms) durante la scansione. Es. Dt = scan time/mass range = = 500 ms/(550-50)u = 1 ms/u m1 m3 m(u) t(ms) scan time m2 SELECTED ION MONITORING SIM Nel Q il tempo della scansione viene utilizzato per misurare solo alcuni ioni con determinati m/z.Non si ottiene lo spettro di massa totale, ma aumenta la sensibilità, perché aumenta il Dt.Es. 3 ioni analizzati, total scan time 500 ms  Dt ~ 550/3 = 166 ms per ione Il guadagno in sensibilità è proporzionale al tempo speso dallo strumento sullo ione nell’analisi in SIM rispetto a quella in TIC. Es.: nell’analisi in TIC un intervallo di 500u viene registrato in 2 sec, tempo speso sullo ione 2/500 = 4 ms; guadagno in sensibilità nell’analisi in SIM (sempre 2 s utilizzati per la rivelazione) di (2000 ms/4 ms=) 500 volte. Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

36 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
TOTAL ION CHROMATOGRAM - TIC Somma delle correnti ioniche di tutti gli ioni dello spettro di massa per ogni scansione spettrale. E’ un diagramma corrente ionica totale vs. numero di scansione (tempo). L’intensità dipende dall’ampiezza dell’intervallo di scansione. MASS CHROMATOGRAM - MC È un estratto dei dati ottenuti dall’analisi in TIC, in cui vengono riportate solo le intensità di ioni selezionati in funzione del numero di scansioni (tempo d’analisi). Aumenta la selettività rispetto al TIC (elimina ioni interferenti) e aumenta S/N. E’ quindi adatta all’analisi quantitativa ed è sempre possibile l’identificazione dei composti dallo spettro di massa totale. 17 13 14 15 16 18 5 10 MCounts 20 40 kCounts TIC MC a m/z 152 acenaftilene minuti 50 76 126 152 m/z Esempio: analisi GC-MS estratti di sedimento. Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

37 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
Scelta degli ioni specifici dell’analita. tra i più abbondanti dello spettro di massa in genere quelli di massa più elevata (> 200Th) che danno S/N migliori (la probabilità che i composti presenti in una miscela producano ioni caratteristici con lo stesso m/z diminuisce all’aumentare di m/z) verificare l’assenza di ioni interferenti nel campione in genere si scelgono tre-quattro ioni per confermare l’identità, e uno ione per l’analisi quantitativa. Criteri per l’identificazione in SIM (descriptors). Esempio: corrispondenza esatta di tre ioni caratteristici ai tempi di ritenzione dello standard con le corrette abbondanze relative (entro un certo intervallo di incertezza; es.  10% EI,  20% CI. S/N del picco almeno > 3. Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

38 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
scelta degli ioni in SIM 342 344 313 315 279 238 triazolam 303 254 230 118 chlorambucil 134 91 58 methamphetamine triazolam : gli ioni a m/z 342 e 313 sono ioni a masse relativamente alte e abbondanti. Lo ione a m/z 313 è preferito rispetto al 344 perché la perdita di - 29 u (342  313) è più significativa dello ione M+2, prodotto da ogni ione che contiene cloro. Gli ioni a m/z 344 o 315 possono essere scelti per la conferma; se dovesse esserci un fondo elevato in queste zone di m/z, rimane sempre la possibilità di scelta dello ione a m/z 238. chlorambucil : lo ione a m/z 254 è sicuramente scelto per l’analisi quantitativa. Più problematica la scela degli ioni per la conferma. Lo ione 303 è a valori di m/z relativamente alti, ma è poco intenso, per cui la sua scelta può essere problematica a basse concentrazioni di analita. In alternativa si può scegliere lo ione M+2 come specificità della presenza di cloro. methamphetamine : scelta problematica. Lo ione a m/z 58 va bene per l’analisi quantitativa, ma è uno ione a masse basse poco specifico (tipico delle ammine), per cui la scelta di uno ione per la conferma è cruciale. Il secondo ione più abbondante a m/z 91 è poco specifico (comune a composti contenenti il gruppo benzilico). Lo ione ai valori più alti di m/z (134) è poco intenso, e comunque cade sempre in una zona di m/z bassi dove l’interferenza dovuta al fondo può essere significativa. Considerare tecniche di ionizzazione soft per fornire maggiore specificità attraverso la formazione dello ione molecolare a valori m/z più alti. Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri B.Ardrey LC-MS. An introduction, 2003

39 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
Esempio: analisi eptaclorodibenzo-p-diossine in scarichi municipali. Identità molecolare formula bruta C12HO2Cl7 peso molecolare (massa monoisotopica : 422 Da isomeri Spettro di massa banche-MS, siti web (NIST), letteratura, … 428 432 426 430 424 422 434 m/z es. isotope distribution calculator (www.sisweb.com) calcola abbondanze relative cluster ioni molecolari inserendo la formula bruta Analisi soluzione standard: GC tempi di ritenzione; MS scelta degli ioni: ioni selezionati m/z 422, 424 e misurazione abbondanze relative : 44 / 100 / 97. Analisi campione SIM a m/z 422, 424, 426. Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

40 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
RISULTATI Analisi campione SIM a m/z 422, 424, 426. Analisi eptaclorodibenzo-p-diossina B D 36605 31428 F m/z 422 96785 86598 28818 m/z 424 85983 97067 m/z 426 time cromatogramma su tre caratteristici ioni dell’eptaclorodibenzofiossina nell’analisi GC-MS SIM degli estratti. Tratta da FW Karasek, RE Clement, Basic GC-MS, 1988 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

41 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
Analisi eptaclorodibenzo-p-diossina Analisi qualitativa: Picchi B,D confermati: presenti gli ioni caratteristici a m/z 422, 424, 426. con rapporti delle aree che rispettano abbondanze relative (entro errore tipico 10-20%): 31400 / / = 36 / 100 / 99; / / = 38 /100 / 98 Confermati i tempi di ritenzione determinati dall’analisi dello standard. picco F scartato  mancano gli ioni a m/z Assente nello standard. Analisi quantitativa: Metodo standard esterno. Single point calibration. (Curva di calibrazione fornirebbe migliore accuratezza, ma non effettuata per diminuire tempi di analisi). Analisi soluzione standard di un isomero. Ione selezionato m/z 424 (più abbondante): area 6400 per 100 pg iniettati. Fattore di risposta = 64 counts/pg. Risultato: 1.4 ng B, e 1.5 ng D. Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

42 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
Esempio: analisi “diossina” (2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-diossina) C12H4O2Cl4 Massa media : Da; massa nominale : 320 Da massa monoisotopica 12C121H416O235Cl4: Da ione più abbondante 12C121H416O235Cl337Cl: Da 100 200 300 400 m/z 97 2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-diossina 74 161 194 229 257 285 322 324 320 326 Possibile scelta degli ioni per l’analisi in SIM: m/z 320, 322, 324. Analisi quantitativa effettuata sullo ione 322 Th. Rapporto delle aree dei picchi deve corrispondere alle abbondanze relative degli ioni nello spettro di massa (320:322:324 = 78:100:48). Interferenza da eptacloro bifenili (MW 392) in caso di coeluizione. La scelta dello ione a 322 potrebbe portare ad un falso positivo, e il monitoraggio di un altro ione di conferma (es.320) ad un falso negativo (rapporto 320:322 errati). potenziale interferenza da eptacloro bifenile 100 200 300 400 m/z 127 162 197 254 290 324 359 394 322 L’uso della HRMS con una risoluzione > 12,500 permette di distinguere la diossina dall’eptaclorobifenile ( u). Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

43 ione precursore  ione prodotto + frammento neutro
TANDEM MS - MS/MS - MSn La MS/MS consiste in almeno due stadi di analisi MS combinati con un processo di dissociazione o reazione chimica che determina una variazione di m/z dello ione. Il primo analizzatore isola lo ione precursore (precursor, parent ion, lo ione che poi subisce un processo) che subisce una reazione formando uno ione prodotto (product, daughter ion) analizzato dal secondo strumento. La reazione è in genere una frammentazione, e lo ione prodotto è uno ione frammento dello ione precursore. Mp+  Mf+ + N ione precursore  ione prodotto + frammento neutro Esistono diverse configurazioni con analizzatori a settore magnetico B, elettrostatico E, e a quadrupolo Q. Nella figura la configurazione più comune: QQQ (QqQ) triplo quadrupolo. Il primo Q agisce da filtro di massa, il secondo q è una camera di collisione dove avviene la frammentazione degli ioni per collisione con un gas inerte, il terzo Q come filtro di massa degli ioni prodotti. tandem in space focalizzazione analisi m/z dissociazione analisi m/z ionizzazione rilevazione camera di collisione ion source elettromoltiplicatore Q - 1 Q - 2 Q -3 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

44 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
sorgente ionica tandem MS Q - 1 ione precursore cella di collisione Q - 3 ione prodotto La MS/MS richiede la frammentazione degli ioni precursori selezionati dal primo analizzatore. La frammentazione avviene tramite collisione con atomi/molecole di un gas inerte. Nella collisione l’energia cinetica dello ione (B: > 1 KeV, Q: eV, IT < 6eV) è trasformata in energia interna dello ione Il valore massimo di energia interna Ei che può essere assorbita da uno ione di energia cinetica Ec e di massa Mi che urta una particella di gas (target) di massa Mt è dato da: Ei = (Mt/Mi + Mt)Ec Esempio Ei = 2.9 eV per uno ione di 100u con Ec = 10eV che collide un atomo di Ar (40Da). CAD (CID) : COLLISION ACTIVATED (o -INDUCED) DECOMPOSITION Nella configurazione QqQ, il secondo quadrupolo non agisce come filtro di massa. Tutti gli ioni trasmessi dal primo Q e i suoi frammenti formati per collisione con il gas inerte arrivano al secondo Q. Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

45 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
MSn tandem in time In una trappola ionica tutti gli ioni sono resi instabili tranne quelli di interesse con un certo valore di m/z che vengono intrappolati nella sorgente; gli ioni selezionati sono eccitati per decomporli; gli ioni prodotto sono resi instabili e rilevati (product ion scan). Anche gli ioni prodotto possono essere intrappolati, decomposti ed i frammenti analizzati. Gli stadi di selezione, decomposizione ed analisi avvengono nella stessa zona dello strumento, ma separati nel tempo. Possono essere numerosi (n) e si parla di MS/MS/MS… o MSn. analisi ESI-IT-MSn di zolpidem 308 [M + H]+ ione molecolare MW 307 W.:F.Smith et al., Anal.Chim.Acta 506 (2004) 203 Hubschmann, Handbook of GC/MS, 2001 263 235 MS2 - HN(CH3)2 - CO 248 235 MS3 - CH3 220 MS4 di m/z 248 - CO Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

46 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
tandem MS MODI DI SCANSIONE MS fisso MS in scansione MS - 1 camera di collisione ion source detector MS - 2 PRODUCT ION SCAN. Si seleziona lo ione precursore nel MS-1 e si fa l’analisi dei frammenti operando MS-2 in scansione. Si usano spesso metodi di ionizzazione soft per avere ioni (quasi)molecolari. PRECURSOR ION SCAN. MS-1 opera in scansione, mentre MS-2 opera in SIM su uno ione specifico. Vengono così identificati tutti gli ioni che producono lo stesso frammento. Non può essere effettuata nella tandem in time. NEUTRAL LOSS SCAN MS-1 e MS-2 operano in scansione simultanea, ma con una differenza di massa costante corrispondente alla massa di un frammento neutro (es. mentre MS-1 fa la scansione da 30 a 500, MS-2 la fa da 15 a 485, e la differenza di massa corrisponde alla perdita di un CH3•. SELECTED REACTION MONITORING (SRM). Si seleziona una reazione di frammentazione; MS-1 e MS-2 sono focalizzati su masse selezionate. E’ l’analogo MS/MS del SIM. Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

47 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri
Quando usare la MS/MS: disturbo causato dalla matrice co-eluizione con un interferente identificare la struttura di un composto incognito aumentare la sensibilità nell’analisi quantitativa conferma di un’analisi in SIM tandem MS MS-1 SIM MS-2 SCAN Utilizzato per confermare la presenza dell’ analita in una miscela complessa; per determinare la struttura di un composto incognito; per identificare l’analita quando la ionizzazione che si utilizza non produce frammentazioni (ESI, CI). MS-1 SCAN MS-2 SIM Utilizzata per l’analisi specifica dei membri di una classe di composti con caratteristiche comuni. Analisi alchilfenoli nei carboni: MS-2 è impostata per il monitoraggio dello ione a m/z 107, relativo al frammento HO-C6H4-CH2+. MS-1 SCAN NL MS-2 SCAN Utile per l’analisi di classi di composti, es.composti con lo stesso gruppo funzionale. Analisi PCDD: perdita consecutiva di Cl• e CO, con una perdita netta di 63 Da. Lo strumento determina in modo specifico tutte le PCDD lavorando con una differenza di massa costante a 63 Da. MS-1 SIM MS-2 SIM SRM. Caratterizzato da elevata sensibilità e selettività. Adatta per l’analisi di quantitativa di composti in tracce in matrici complesse. Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

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Esempio: ormoni steroidei in acque di scarico municipali-1 Analisi GC-MS/MS acqua di scarico 1 2 minuti tracciato GC m/z 681 m/z 664 testosterone 17-b estradiolo MW 682.5 1 MW 664.4 2 Procedura Campioni di acque di scarico 4 L. Filtrazione. Aggiunta I.S. (100 ng/L mesterolone). SPE C18; lavaggio H2O/MeOH 6:4; eluizione H2O/MeOH 25:75. Derivatizzazione con anidride eptafluorobutirrica. Evaporazione. Ripresa con 0.1 mL iso-ottano. Analisi GC-MS/MS. EI 70 eV. 451 450 452 m/z 466 665 spettro MS/MS EP Kolodziej et al. Environ.Toxicol.Chem.22(2003)2622 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

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Esempio: ormoni steroidei in acque di scarico municipali - 2 Condizioni GC-MS/MS composto RT precursore prodotto LOD LOQ min m/z m/z ng / L ng / L testosterone , 466, 17b-estradiolo androstenedione ecc. ecc. mesterolone (SIM) Quantificazione e controllo qualità. Identificazione. Tempo di ritenzione ( 0.1 min); abbondanza ioni prodotto (daughter) in MS/MS ( 20%). Calibrazione. Lineare, 7 punti spaziati su scala log da 1.0 a 100 ug / L. LOQ. Punto di più bassa concentrazione della calibrazione considerando la pre-concentrazione; S/N > 6. LOD. 1/3 del LOQ. Quantificazione. Somma delle aree dei picchi dello spettro MS/MS (base peak + confirmatory qualifiers); normalizzate sullo standard interno (mesterolone). QA/QC. Analisi dei bianchi (acqua distillata) (test contaminazione  assente); campioni in duplicato (test precisione  < 10%); recuperi (matrice fortificata con analiti  74%  27% n=18). EP Kolodziej et al. Environ.Toxicol.Chem.22(2003)2622 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

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Esempio: analisi PCB La scelta della tecnica dipende da: concentrazione di PCB prevista (LOD richiesto). Tipo di interferenze sospettate. Risoluzione richiesta (determinazione congeneri o PCB totali). Potere di discriminazione qualitativa; accettabilità di falsi positivi e negativi (*). Accuratezza e precisione richiesta. Disponibilità della strumentazione. Tempi e costi di analisi. HPLC risoluzione sufficiente per PCB totali. Rivelazione UV. HRGC (GC ad alta risoluzione: con colonna capillare) per l’analisi di congeneri. GC-FID per livelli di concentrazione alti (%) e bassa interferenza. GC-ECD se concentrazioni basse, ma ci sono poche interferenze da elettrofori. GC-MS per basse concentrazioni e presenza di interferenti.. MDGC (multidimensional GC, GCn), GC-MS/MS, GC-HRMS per elevata selettività. (*) Esempio: falso positivo :accettabile in un monitoraggio sulla contaminazione da PCB (danno: sostiuzione inutile del fluido dielettrico); non-accettabile: nel latte umano di una poplazione che vive nei pressi di un inceneritore di PCB. MD Erickson Analytical Chemistry of PCBs Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri

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Esempio: analisi PCB Ionizzazione elettronica (EI). L’acquisizione full scan è utile per l’analisi qualitativa; in SIM si migliora la sensibilità e la selettività dell’analisi. In genere si usa lo ione più intenso per la quantitativa, e il rapporto M/M+2 per il riconoscimento, eventualmente un terzo ione nei casi dubbi. Esempio: C12H9Cl 188 (100) 190 (33) C12H8Cl2 222 (100) 224 (33) 226 (11) C12H7Cl3 256 (100) 258 (99) 260 (33) C12HCl9 430 (100) 432 (66) 428 (87) Ionizzazione chimica positiva (PCI). Per la minore frammentazione lo ione molecolare è in genere il picco principale nello spettro di massa. Usando metano come gas reagente si formano gli ioni [M+H]+, [M+C2H5]+. Il vantaggio è limitato, perché ioni molecolari intensi si hanno anche in EI. Inoltre, la risposta PCI è influenzata dalle condizioni di ionizzazione con effetti negativi sulla precisione. Ionizzazione chimica negativa (NCI, ECMS). Ha caratteristiche di sensibilità e selettività (e reattività) simili all’ECD, con il vantaggio dell’abilità di riconoscimento del MS. Ha i problemi di riproducibilità delle tecniche CI. Gli ioni possono essere M- e 35Cl-, 37Cl-. Alta risoluzione (HREIMS). Maggiore certezza nell’identificazione, anche in presenza di diversi interferenti e senza separazione GC (analisi diretta). Tandem MS (MS/MS). Può essere adatta per l’analisi quali-quantitativa in miscele molto complesse, ad esempio con un elevato fondo dovuto a idrocarburi o lipidi. In genere lo ione precursore è lo ione a massa più bassa del cluster di ioni molecolari (C12Hn35Cl10-n). Gli ioni prodotto sono in genere (M-Cl)+, (M-HCl)+, M-Cl2)+. Esempio: PCB N° 52 ione precursore m/z 292, ioni prodotto m/z 257, 222, 220. MD Erickson Analytical Chemistry of PCBs Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri


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