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Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 1 corso di CHIMICA ANALITICA DEGLI INQUINANTI Laurea specialistica - Scienze Ambientali Università di Bologna.

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1 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 1 corso di CHIMICA ANALITICA DEGLI INQUINANTI Laurea specialistica - Scienze Ambientali Università di Bologna - Ravenna Docente : Daniele FABBRI Parte VIII 1 - analisi inquinanti organici

2 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 2 SELETTIVITA : esprime la capacità di un metodo analitico di determinare un particolare analita senza interferenza dai componenti della matrice, ovvero di discriminare fra analita e sostanze strutturalmente simili. (Il termine specificità è spesso usato come sinonimo). La presenza di eventuali interferenti può essere riconosciuta attraverso lanalisi di opportuni bianchi (matrice, matrice fortificata con un sospetto interferente, …). Linterferente può: far ritenere che lanalita sia presente quando invece è assente (falso positivo); impedire lidentificazione dellanalita (falso negativo); influenzare il dato quantitativo. La selettività può essere conseguita nella varie fasi della procedura analitica: selettività nel trattamento del campione. I potenziali interferenti sono eliminati nella fase di trattamento del campione. Esempio: scelta opportuna delle condizioni di estrazione in fase solida (SPE), cromatografia di affinità, polimeri ad impronta molecolare, estrazione con un chelante, ecc. selettività nel sistema di separazione cromatografica. I potenziali interferenti eluiscono in tempi diversi dallanalita. Scelta opportuna delle condizioni di analisi GC e HPLC, GC multidimensionale (GC n ). selettività nel metodo di rivelazione. Lanalita è determinato preferenzialmente rispetto agli interferenti che co-eluiscono. In spettrometria di massa possono essere usate tecniche molto selettive. Esempio: HRMS (alta risoluzione), SIM (selected ion monitoring), SRM (selected reaction monitoring, in MS/MS).

3 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 3 Esempio tipico : la MS n comporta una diminuzione dellintensità del segnale allaumentare di n, ma con un deciso aumento del rapporto segnale/disturbo. passaggi dellanalisi intensità 1234 segnale noise S / N RG Cooks, KL Busch, J.Chem.Educ. 59(1982)926. Allaumentare del numero di passaggi gli errori possono aumentare ed il segnale diminuire, ma a vantaggio di un aumento del rapporto segnale/disturbo.

4 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 4 R sistema di iniezione I gas di trasporto fase mobile forno colonna capillare rivelatore stazione dati MS AED ECD NPD FID fgpg ng g intervallo di utilizzazione gascromatografia capillare - CGC (GLC) rivelatoreselettivitàlogIDL-LODID termoconducibilitàTCDuniversale (gas)4 - > ngtr ionizzazione di fiamma FIDuniversale (idrocarburi)6/7 -

5 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 5 fase mobile liquido sistema di iniezione I R rivelatore stazione dati colonna HPLC high performance liquid chromatography rivelatoreselettivitàsensibilità ID indice di rifrazioneuniversalebassatr assorbimento UV-vis- DADcromofori (fenoli, IPA, der.)buonatr / spettro UN fluorimetria Flfluorofori (IPA, derivatizz.)elevatatr / sp emissione atomicaICP-AESelemento specifico (R-As) spettrometria di massa - ESI, APCI, ICP-MS, MS n * tr: tempo di ritenzione; sp: specificità della tecnica

6 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 6 Campi di applicazione volatili, semi-volatili Composti polari-ionici derivatizzabili: X-CH 3, X- SiMe 3, X-CO-CF 3 Fenoli, acidi grassi, steroli, zuccheri, amminoacidi, alcaloidi (metaboliti) Macromolecole degradazione chimica, pirolisi ionici, ionizzabili, polari PESO MOLECOLARE analita POLARITA analita GC-MS APCI ESI proteine peptidi sterodi VOC, IPA, POPs moderatamente polari non polari

7 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 7 Lo spettrometro di massa separa gli ioni secondo il loro rapporto massa su carica m/z. Lo scopo analitico della spettrometria di massa è quello di convertire il campione in prodotti misurabili indicativi delle molecole originali. I prodotti sono ioni le cui masse (o i rapporti massa su carica) e abbondanze relative costituiscono lo spettro di massa. formare ioni gassosi dellanalita Separarli nello spazio (deviandoli su traiettorie ) o nel tempo (traiettorie uguali in tempi ) in base al rapporto m/z (energia,velocità, momento). Misurare la loro abbondanza relativa. Elettromoltiplicatore accelerarli sorgente ionica sorgente ionica analizzatore di massa analizzatore di massa Collettore. Rivelatore di ioni Introduzione del campione conversione in una forma adatta alla ionizzazione GC-HPLC Elaborazione dati vuoto spettrometria di massa

8 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 8 MASSA Viene espressa in unità di massa atomica. unità di massa atomica u (chiamata anche dalton, Da) : 1/12 della massa di un atomo di 12 C. 1 u = 1 Da = g. Massa media (o chimica): calcolata usando le masse atomiche medie (pesate sugli isotopi naturali di ogni elemento). Massa atomica media Am dellelemento A che in natura ha n isotopi, ciascuno con massa Ai e abbondanza naturale Pi: Am = P 1 A 1 + P 2 A 2 + … + PnAn Massa nominale: calcolata usando il numero intero della massa dellisotopo predominante di ciascun elemento. Ioni diversi che hanno la stessa massa nominale sono detti isobari. Massa monoisotopica: calcolata dalle masse degli isotopi predominanti di ciascun elemento. La misura della massa esatta di uno ione con sufficiente accuratezza definisce in modo univoco la composizione elementare dello ione. La massa esatta viene determinata con strumenti ad alta risoluzione (HR). M z+ CARICA unità di carica è la carica dellelettrone e. e = C. Carica totale q = numero delle cariche z carica dellelettrone e: q = z e RAPPORTO MASSA/CARICA Rapporto massa su carica m/z: se massa espressa in u e carica in e, unità thompson (Th). Numero adimensionale se m/z espressa in numero di massa e numero di carica. CARATTERISTICHE DI UNO IONE

9 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 9 Lunità di massa atomica è ununità di misura ibrida. Indica una scala relativa il cui riferimento è latomo 12 C a cui è stato assegnato il valore di 12u esatte. Latomo 12 C ha massa …u. Latomo di 35 Cl ha una massa volte più grande del 12 C quindi la sua massa atomica è 12 x = Da. La massa esatta del 35 Cl è : Da (numero decimale) La massa nominale del 35 Cl è : 35 Da.(numero intero) La massa atomica media è utilizzata nei calcoli stechiometrici. Br Massa media = P 1 81 Br + P 2 79 Br = x x = u Le masse monoisotopiche sono utilizzate in MS per indicare le masse molari. Br 2 La massa di Br 2 è 158u per convenzione, anche se la specie più abbondante ha massa 160u. 79 Br 79 Br158u51%peso molecolare in MS Br 81 Br160u100%ione più abbondante Br 81 Br162u49% CH 3 Br Massa media : x = u Massa nominale: x = 94u Massa monoisotopica ( 12 C 1 H 3 79 Br): x = u esempi Gli ioni CO +, N 2 + e C 2 H 4 + sono isobari: hanno masse nominali uguali (28 Da), ma masse esatte diverse: CO u N u C 2 H u

10 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 10 Potere risolutore (risolutivo) : capacità di separare ioni con m/z vicini. Prestazioni analisi qualitativa. Risoluzione R: quando due picchi, il più piccolo dei quali ha altezza h, di massa m e m+m, sono separati da una valle che ha unaltezza pari al 10% di h, allora R = m / m(10% valley definition) 5%h h R = m / m Caratteristiche di un analizzatore di massa Limite di massa : valore più alto di m/z che può essere misurato. Applicabilità. Trasmissione : rapporto tra il numero di ioni che raggiungono il rivelatore e il numero di ioni prodotto nella sorgente. Sensibilità. 10%h m m Altre definizioni: Per i quadrupoli si usa la 50% valley definition di R. La risoluzione per un picco isolato è la larghezza del picco ( m) a un altezza x% dellaltezza del picco. Spesso si usa X%= 50% e la m è chiamata FWHM (full width at half-maximum).

11 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 11 RISOLUZIONE Doppia focalizzazioneSingola focalizzazioneQuadrupolo HRMSsettore magneticoQ fino a 10 5 < (unitaria) Per il quadrupolo la R è variabile lungo lintervallo di massa ( m è costante), per lanalizzatore magnetico è costante ( m variabile: aumenta allaumentare delle masse). Picchi adiacenti sono distinguibili se i loro rapporti dintensità sono minori di 1:10. Per separare CO + da N 2 + è necessaria una risoluzione : R = / ( ) = 2493 Per separare gli ioni molecolari del tridecilbenzene (C19H32 +, ) dal fenilundecilchetone (C18H28O +, ) è necessaria una risoluzione : R = 260 / ( ) = 7100 Allaumentare della massa aumenta lutilità informativa della composizione elementare, e aumentano le richieste di risoluzione e accuratezza. Per aumentare la risoluzione bisogna diminuire la dispersione del fascio ionico (es.riduzione fenditura), il che determina una riduzione della sensibilità (meno ioni raggiungono il collettore). Per un analizzatore magnetico ha R = Per uno ione di massa 100,0000 m = 0.1, per uno ione di massa 1000,0000 m = 1.

12 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 12 Una molecola contiene n atomi di un elemento che ha due isotopi di abbondanza naturale a e b. Labbondanza relativa dei picchi isotopici segue una distribuzione binomiale: (a + b) n = a n + na n-1 b + [n(n-1)/2!]a n-2 b 2 + … Labbondanza relativa della molecola che ha k isotopi del tipo a è : [n!/k!(n-k)!]a k b n-k Per più elementi le relazioni sono del tipo (a+b) n (c+d) m … Esistono programmi per il calcolo o figure per le abbondanze relative di cluster isotopici Picchi isotopici Elementi A+1 C, O, N. Il rapporto di intensità A+1/A dà informazioni sulla composizione elementare dello ione (es. numero massimo di atomi di C; massimo perchè al picco A+1 possono contribuire altri ioni, impurezze, etc.). A+1/A = nb Per il 13 C b = 1.08%, con deviazioni di ~ 2% (20 ) a seconda della fonte. Per comodità si usa il valore 1.1%, tenendo conto del piccolo contributo del 2 H (b = 0.015%).(Infatti, considerando 1.5 H per atomo di C si ha per A+1 : 1.08% + 1.5x(0.015%) = 1.1%). Lo ione monoisotopico non è necessariamente il più abbondante. Esempio molecole organiche: se la molecola ha più di 91 atomi di C, lo ione A+1 (per 13 C) è più iintenso è più intenso dello ione A.

13 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 13 Cl 2 Cl3 Cl4 Cl Br 2 Br3 Br4 Br Cl+BrCl+2BrCl+3Br2Cl+Br pattern isotopici

14 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 14 Esempio: (a + b) n = a n + na n-1 b + [n(n-1)/2!]a n-2 b 2 + … per 35 Cl e 37 Cl a = 1 e b=0.32. Se una molecola ha n = 2 atomi di cloro la probablilità delle combinazioni 35 Cl 35 Cl, 35 Cl 37 Cl( 37 Cl 35 Cl) e 37 Cl 37 Cl è, rispettivamente, 1x1, 2(1x0.32), 0.32x0.32, quindi le abbondanze relative sono: 1 : 0.64 : (a + b) 2 = a 2 + 2ab + b 2 = x1x = 1:0.64:0.10 Esempio: (a+b) n (c+d) m CCl 2 Br 2 : 0.51 x (1: 0.64 : 0.10) =0.51, 0.32, 0.051, -----, -----, 1.0 x (1 : 0.64 : 0.10) =------, 1.00, 0,64, 0,10, -----, 0.49 x (1 : 0.64 : 0.10) =------, -----, 0.49, 0.31, intensità relative per M, M+2, M+4, M+6, M , 1, 0.89, 0.32, Esempio: A + 1 per il nitrobenzene C 6 H 5 NO 2, lintensità relativa di A+1 rispettto A è: 13 C6 x 1.08% =6.48 % 15 N1 x 0.37% =0.37 % 2 H5 x 0.015% =0.07 % 17 O2 x 0.04% =0.08 % totale: 7.0%. Esempio. A+2 Esempi: abbondanza di A+2 rispetto A (100%) per Si e S: Si % Si % Si 3 11% S % S % Si 3 13% Picchi isotopici

15 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 15 Per composti con peso molecolare < 1000 (relativamente basso: LMW) la risoluzione è sufficiente per separare ioni che differiscono solo per la composizione isotopica Esempio ione monoisotopico dallo ione satellite che contiene un 13 C. La richiesta di risoluzione aumenta allaumentare del peso molecolare, e per composti a peso molecolare elevato (HMW) i picchi isotopici potrebbero non essere separati. Esempio: C 35 H 48 N 8 O 11 S ione monoisotopico Da satellite 13 C Da Risoluzione786 C 284 H 432 N 84 O 79 S 7 ione monoisotopico Da aprotinasatellite 13 C Da Risoluzione6485 La risoluzione richiesta per separare ioni molecolari non è influenzata dal numero di cariche sulle ione: [C 284 H 432 N 84 O 79 S 7 ] 7+ ione monoisotopico Da aprotinasatellite 13 C Da Risoluzione6487 Per uno ione con 10 cariche la separazione di massa apparente fra 12 C e 13 C è di 0.1 Da.

16 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 16 Numero di anelli e insaturazioni: Numero totale di anelli e doppi legami per uno ione (C, Si, …) x (H, F, Cl,..) y (N, P,…) z (O, S,…) n n = x - ½ y + ½ z +1 Per ioni a numero pari di elettroni, n può essere seguito da.5. Esempio: ione benzoile C 6 H 5 -CO + : N = = 5.5. (N = 5 4 doppi legami + 1 ciclo). Regola dellazoto: se il peso molecolare di un composto è un numero dispari, la molecola contiene un numero dispari di atomi di azoto. Per molecole contenenti C, H, O, N, S, P, Si, As, alogeni, metalli alcalini. Infatti, fra questi elementi solo N ha massa pari e valenza dispari, gli altri hanno sia massa che valenza entrambe pari o dispari. Parità di massa/parità di carica: uno ione che contiene 0, 2, 4,… atomi di azoto è a numero dispari di elettroni (radicalcatione OE + o radicalanione) se ha massa pari, e a numero pari di elettroni (es.EE + ) se ha massa dispari. La scarsità di picchi importanti a massa pari, soprattutto nella parte a masse basse dello spettro, indica che lo ione molecolare ha massa pari. Lopposto non è sempre vero (labbondanza di ioni pari non indica necessariamente uno ione molecolare di massa dispari). Picchi intensi di OE sono meno probabili di EE sopratutto alle masse inferiori. Le serie omologhe (es. M/z 57, 71, 85 degli alcani), sono tipiche di ioni EE. OE ioni a elettroni dispari (contengono un elettrone spaiato) EE ioni a elettroni pari (tutti gli elettroni sono appaiati). Gli EE sono più stabili degli OE.

17 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 17 IONI (PSEUDO) MOLECOLARI. Forniscono uninformazione importante: il peso molecolare dellanalita. Lo ione molecolare si genera dalla molecola di analita per perdita o acquista di uno o più elettroni. Per definizione è il monoisotopico. In ionizzazione elettronica (EI) è un OE (ione radicalico M, oppure M - ). Potrebbe essere molto instabile e frammentarsi prima di arrivare al rivelatore. Lo ione pseudomolecolare è formato dalla molecola analita per perdita di un protone o uno ione idruro, o per associazione con uno ione stabile.(formazione di un addotto) Nelle tecniche di ionizzazione soft è uno ione EE relativamente stabile; frammentandosi poco può aumentare la sensibilità della tecnica. Un esempio tipico è la molecola protonata MH + (nota: non è lo ione molecolare protonato). Esempio: ionizzazione chimica con CH 4 :MH + MC 2 H 5 + MC 3 H 5 + ionizzazione elettrospray ESI :ioni positivi MH + MNa + MNH 4 + MK + ; ioni negativi (M-H) -. Nella tecnica ESI si possono avere ioni multicarica: MH 5 5+ MH 6 6+ …. FRAMMENTAZIONE. Gli ioni che si ottengono dalla frammentazione di ioni precursori (es. ione molecolare) forniscono informazioni sulla struttura dellanalita, utili per lanalisi qualitativa (riconoscimento). La loro produzione può essere importante nellanalisi quantitativa (specificità, riduzione S/N; es. tandem MS). OE produce un EE per rottura di un legame, un OE per rottura di due legami (riarrangiamento, frammentazione anello). Generalmente gi EE producono solo EE. OE EE + OE OE OE + EE o EE EE + EE° EE OE + OE poco probabile (formazione di due siti radicalici). Lo ione si frammenta per lelevata energia interna acquistata nelle condizioni di ionizzazione hard (es. EI).Lo ione viene indotto a frammentarsi per collisioni con altre molecole (es. tecniche tandem MS). TIPI DI IONI

18 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 18 Formazione degli ioni. anodo di scarica Selettore ionico filamento Elettrodi di accelerazione (5000 V) focalizzazione fenditura Allanalizzatore V V V V 0V P = torr T = 200°C EI ionizzazione elettronica E una tecnica di ionizzazione hard. Gli elettroni sono emessi da un filamento riscaldato, vengono accelerati da un potenziale che è di 70V nella camera di ionizzazione. Lelettrone e¯ interagisce con la molecola M ionizzandola: M + e¯ M + 2 e¯ (elettroni secondari) M è lo ione molecolare. La frazione di molecole ionizzate è ca. 1:10 5. La ionizzazione è un processo veloce: s. Lenergia di ionizzazione adiabatica (minima, ai livelli vibrazionali zero di M e M ) è tipicamente intorno ai 10 eV per molecole organiche (per atomi : 25 eV per He, 3.9 eV per Cs). Gli e¯ hanno una distribuzione gaussiana di energie cinetiche attorno ad un massimo di 70 eV. Energie di ionizzazione di alcune molecole (IE in eV): CH 3 -CH NH Et 2 O9.5 CH 2 =CH PH Et 2 S8.4 EtOH10.5Et 2 Se8.3 EtNH Metodi di ionizzazione in GC

19 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 19 CIionizzazione chimica Vantaggi. La CI (chemical ionisation) è una tecnica di ionizzazione soft, utile per conoscere il peso molecolare, e per introdurre sensibilità e specificità. Composti con una elevata affinità protonica PA (ammine) possono essere rivelati dallanalisi di ioni positivi prodotti per protonazione (PCI, positive chemical ionisation). Composti con unelevata affinità elettronica EA (nitro, ciano, alogeni) possono essere determinati per cattura elettronica (NCI, negative chemical ionisation). Difficoltà. Lo spettro di massa in CI dipende molto dalle condizioni di ionizzazione in cui si lavora. Fattori importanti sono: T e P, tuning dei vari parametri strumentali, purezza del gas reagente (es. Impurità contenenti ossigeno disturabano notevolmente la NCI in EC), ecc. Data la bassa riproducibilità nelle abbondanze relative dei vari ioni, non esistono librerie di spettri CIMS per lidentificazione dei composti. Laffinità protonica (PA) misura la tendenza della specie M ad addizionare un protone (basicità di M in fase gassosa). E il negativo del termine entalpico della reazione: M + H + = (M+H) + PA (M) = - [ H f (M) + H f (H + ) - H f (M + H) + ] Quanto più PA è grande tanto più la reazione di protonazione è favorita. Valori tipici per composti organici: PA = kJ/mol. Laffinità elettronica (AE) misura la tendenza di una specie M ad acquistare un elettrone trasformandosi in un anione: M + e – X –

20 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 20 Gli ioni reagenti reagiscono con le molecole di campione M: Reazionecontrollata da 1) trasferimento protonico:M + RH + MH + + R PA (favorita se PA(M)>PA(RH + ) 2) estrazione di idruro:M + (R -H) + (M-H) + + R 3) formazione addottiM + RH + MRH + 4) trasferimento di carica:M + R + ° M + ° + R energia di ionizzazione IE PCI La ionizzazione è causata da reazioni ione-molecola Un gas reagente R viene introdotto nella sorgente ionica a pressioni relativamente alte ( torr). Poiché R è in forte eccesso rispetto al campione (10 4 :1), si ha ionizzazione della specie R per ionizzazione elettronica (EI): R + e – R + ° + 2e – Si utilizzano elettroni ad elevata energia (500 eV) per aumentare le penetrazione e rendere più efficace la ionizzazione R + ° reagisce con altre molecole R per formare specie ioniche reattive (ioni reagenti): R + R + ° RH + + (R -H)° R + R + ° RH° + (R -H) + Spettri di massa EI e CI della prolina PM = MH EI CI m/z % %

21 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 21 Formazione ioni primari: CH 4 + e – CH 4 + ° + 2 e – CH 4 + ° CH H° Formazione ioni reagenti: CH 4 + ° + CH 4 CH CH 3 ° CH CH 4 C 2 H H 2 se P elevata si forma anche C 3 H 5 + Reazione con lanalita M + CH 5 + (M-H) + + CH 4 + H 2 M + CH 5 + MH + + CH 4 M + C 2 H 5 + MH + + C 2 H 4 M + C 2 H 5 + (M-H) + + C 2 H 6 M + C 2 H 5 + MC 2 H 5 + M + C 3 H 5 + MC 3 H 5 + Esempio: gas reagente metano. gas reagenteione reagentePA CH 4 CH H 2 O H 3 O MeOH MeOH iso-C 4 H 10 (CH 3 ) 3 C NH 3 NH Lenergia interna delle specie M ionizzate dipende dal reagente scelto. Se PA (M) > PA(R) la formazione di MH + è favorita, ma se PA(M)>>PA(R) MH + può avere elevata energia interna e frammentarsi. Lenergia interna delle specie M ionizzate (e quindi la possibilità di frammentazione) dipende dal reagente scelto e dalla T e P della camera di ionizzazione. Gas reagenti. Come sceglierli

22 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 22 NCI Per molti strumenti MS, basta cambiare le polarità per passare dalla rivelazione degli ioni positivi a quella degli ioni negativi. Esistono due processi principali per formare ioni negativi Formazione di uno ione negativo per cattura di un elettrone a bassa energia (~ 0 eV) da parte del LUMO di un elettroforo MX. Un gas moderatore (es.metano, azoto a 1 torr) è bombardato con elettroni ad elevata energia ( es. 100 eV) prodotti da un filamento allo scopo di produrre elettroni secondari e raffreddarli attraverso collisioni anelastiche. Il gas tampone stabilizza gli ioni negativi limitando la dissociazione. La cattura elettronica può essere: non-dissociativa: MX + e – MX – dissociativa:MX + e – M + X – La struttura molecolare e la T determinano il meccanismo predominante. Il processo non-dissociativo fornisce informazioni sul peso molecolare, e spesso è quello che si vuol favorire. La NCI è molto più sensibile della EI o PCI per certi analiti, anche perchè la velocità di cattura elettronica è molto maggiore di quella della reazione ione-molecola (gli elettroni hanno elevata mobilità). Però il processo è efficace per molecole con elevata affinità elettronica, EA, come composti organoalogenati. Un elettroforo contiene elementi elettronegatvi (F, Cl elevata EA) o sistemi coniugati (carotenoidi, orbitale vuoto a bassa energia). Selettività : pochi composti sono forti elettrofori (es. PCB, toxafeni). Sensibilità : elevata efficienza di cattura, formazione di un anione dominante. Derivatizzazione: per composti che non sono elettrofori: bromuro pentafluorobenzile. La diminuzione della selettività può richiedere HRMS, MS/MS. cattura elettronica MX + e – MX – estrazione di protone.B¯ + M BH + [M - H]¯ agisce come acido di Bronsted cedendo un protone ad uno ione reagente Cattura elettronica (electron capture mass spectrometry, ECMS):

23 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 23 Metodi di ionizzazione in HPLC. Problema interfacciamento HPLC che opera con fasi liquide a pressione P atmosferica e flussi tipici di 1 mL/min con MS che opera in fase gassosa a P basse. Tecniche di ionizzazione a pressione atmosferica (API) Con i moderni HPLC-MS la Ionizzazione avviene a P atmosferica direttamente dalla soluzione allinterno dellinterfaccia. Lo spettrometro di massa è utilizzato per separare gli ioni e rilevarli. In generale, la ionizzazione dellanalita prevede i seguenti processi: formazione di goccioline dalleluato HPLC. formazione di cariche sulle goccioline. eliminazione del solvente (desolvatazione). formazione di ioni dallanalita. Principali metodi di interfacciamento/ionizzazione in HPLC: elettrospray ESIionizzazione chimica a pressione atmosferica APCI fotoinonizzazione a pressione atmosferica APPI

24 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 24 ESI Componenti: Capillare, ago metallico ad elevato voltaggio da cui esce la soluzione che viene spruzzata in un intenso campo elettrico Campi di 2-6 kV per ioni positivi; minori e a polarità inversa per ioni negativi. Le gocce elettricamente cariche sono dirette verso un contro-elettrodo che le attrae. Flusso di gas inerte caldo per favorire levaporazione del solvente (desolvatazione). Ottica ionica: campi elettrici che focalizzano il raggio ionico verso lanalizzatore. Linterfaccia electrospray (ESI) eluato HPLC Spray elettrostatico Elettrodo cilindrico Capillare ad elevato voltaggio Drying gas (N 2 riscaldato) Skimmer contro elettrodo P atmosferica vuoto crescente alto vuoto analizzatore Nozzle I principali vantaggi dellESI: E una tecnica di ionizzazione soft che permette lanalisi di composti termolabili e molto polari. Genera ioni multicarica. Si formano addotti con più protoni o ioni sodio (M + nH) n+ (M + nNa) n+ Composti ad elevato peso molecolare (HMW) formano macroioni molecolari multicarica che possono essere così rilevati con analizzatori MS che hanno limiti di massa minori della massa molecolare dellanalita.

25 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri Nebulizzazione e ionizzazione alluscita dellago. Formazione di goccioline (ca. 1 um) che vengono caricate elettricamente per azione del forte campo elettrico (5-10 kV cm -1 ). Desolvatazione ad opera del drying gas. Il solvente nelle goccioline evapora. Coulombic explosion. Dopo circa 100 us le dimensioni delle gocce sono ridotte al punto che le forze elettrostatiche di repulsione vincono le forze coesive della tensione superficiale. Le gocce esplodono producendo goccioline più piccole ( circa 10% del diametro iniziale). Ionizzazione dellanalita. I processi di desolvatazione e collasso delle goccioline continuano fino a che si formano ioni dellanalita in fase gassosa che vengono convogliati nellanalizzatore MS. Ci sono diverse ipotesi sul meccanismo di ionizzazione dellanalita: ion evaporation : se la goccia è sufficientemente piccola lanalita evapora in forma ionizzata

26 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 26 Composti analizzabili in ESI: Analiti che sono già in forma ionica in soluzione (es. acidi, basi). Composti neutri/polari che possono essere ionizzati per protonazione (M+H) + e deprotonazione (M-H) -. composti non-polari che possono essere ossidati (ioni positivi) o ridotti (ioni negativi) nella punta del capillare. Spettro ESI del citocromo c M = Da fra due picchi consecutivi la carica cambia di un unità m/z Spettro di massa ESI di un composto HMW. Formazione di ioni multicarica. Determinazione del peso molecolare. dati sperimentali : (m/z) 1 dello ione 1, (m/z) 2 dello ione 2, …; incognita: peso molecolare M dellanalita; si assume che la carica dello ione 1 sia dovuta alladdizione di n 1 protoni, dello ione 2 con n 2 protoni, ecc. Per ioni consecutivi n 2 = 1 + n 1, ecc. M può essere calcolato per ogni coppia di ioni 1, 2, … del cluster di ioni molecolari di carica z 1 = n 1, z 2 = n 2, ecc. utilizzando le equazioni (esemplificate per la copppia di ioni 1 e 2): (m/z) 1 = (M + n 1 (massa protone)) / n 1 = (M + n 1 ) / n 1 (m/z) 2 = (M + n 2 ) / n 2 ESI Possono formarsi ioni per aggiunta di protoni: esempio (M+5H) 5+ di ioni sodio esempio (M+5Na) 5+

27 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 27 APCI atmospheric pressure chemical ionisation la fase liquida che esce dalla colonna HPLC è dispersa in piccole gocioline per azione del calore e di un gas nebulizzante. Lo spray è desolvatato e fatto passare in una regione calda dove viene vaporizzato. Le specie neutre passano in una regione dove si ha una scarica a corona (corona discharge) che ionizza il gas. Per interazione degli elettroni con le specie principali si ha formazione di ioni reagenti. Nella modalità di ioni positivi sono in genere le molecole di solvente protonato (in quella negativa, ioni O 2 - ). Gli ioni reagenti ionizzano le molecole di analita in modo simile alla ionizzazione chimica convenzionale attraverso reazioni ione-molecola. Tipi di ioni: è una tecnica di ionizzazione soft. Si formano ioni molecolari con bassa energia, che hanno una scarsa tendenza a frammentarsi. Es. modalità ioni positivimodalità ioni negativi (M + H) +, (M + NH 4 ) + (M - H) - (M + CH 3 COO) - I componenti dellinterfaccia sono simili a quelli dellESI; in alcuni HPLC-MS le due tecniche sono interscambiabili. Il meccansimo di ionizzazione è diverso da quello dellESI, per cui le due tecniche sono complementari. LAPCI è un processo di ionizzazione in fase gassosa, applicabile a molecole volatili e poco polari. Metodi di ionizzazione in HPLC.

28 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 28 ESI forma macroioni multi-carica; adatta per analisi composti HMW (proteine, polimeri). Misure indipendenti di peso molecolare da un singolo spettro adatta per analisi composti polari e già ionizzati in soluzione (la ionizzazione si ha direttamente dalla soluzione). tecnica molto soft; adatta per analisi composti termolabili. Lo ione si forma direttamente nella fase mobile; il risultato dipende molto dalle condizioni sperimentali. Con opportuni sistemi per diminuire il flusso dellHPLC convenzionale; possibilità di operareda nL/min a ml/L. APCI non forma ioni multicarica; non adatta per compostii HMW (limite di massa tipico 2000 Da). adatta per analisi composti volatili (LMW) e poco polari. Meno adatta per composti già ionizzati in soluzione. E una tecnica soft, ma richiede condizioni più drastiche dellESI. Composti termolabili non sempre analizzabili. ionizzazione simile alla CI convenzionale in fase gassosa; meno sensibile alle condizioni sperimentali e composizione fase mbile (tampone, Abbinamento diretto ai flussi tipici HPLC (1-2 mL/min). Tecniche soft. Produzione di ioni molecolari; spesso non informativi da punto di vista strutturale (analisi qualitativa); analisi dei frammenti ionici (indotta per collisione con molecole di gas oppure dissociazione nel sistema di ionizzazione

29 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 29 formazione ioni focalizzazione fascio ionico gli ioni con un determinato m/z attraversano il quadrupolo gli ioni sono rilevati campo costante U campo oscillante Vcos t y z x Alle aste viene applicato un potenziale totale dato dalla somma di un potenziale diretto U (non oscillante, DC) e un potenziale oscillante alla frequenza (frequenza angolare=2) di ampiezza V. = U + V cost. Tipicamente U= volt; V = ; campo radiofrequenze (RF) QUADRUPOLO Q quadrupolo lineare Gli ioni sono separati in base al rapporto m/z sfruttando la stabilità delle loro traiettorie in campi elettrici oscillanti. analizzatori di massa Le traiettorie degli ioni (soluzioni dellequazione di Mathieu) sono stabili (e gli ioni arrivano al rivelatore) se i valori di x e y rimangono < r o ; altrimenti gli ioni si scaricano contro le aste. 2r°

30 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 30 Diagramma di stabilità per ioni con masse m 1 < m 2 < m 3 (z =1). triangolo di stabilità di m 3 V U m1m1 m2m2 m3m3 Per un dato quadrupolo r o e sono costanti. Le variabili sono U e V. Per determinate coppie di valori U, V gli ioni con dato m/z hanno traiettorie stabili e sono rivelati. Aumentando U e V, e mantenendo il rapporto U/V costante, i vari ioni vengono rivelati in successione al crescere di m/z; si effettua così una scansione (scan). U è variato linearmente in funzione di V, gli ioni m 1 < m 2 < m 3 sono rivelati in successione. Per U=O (quadrupolo con solo RF) la risoluzione è zero. Il valore di V determina il valore minimo di m che deve avere lo ione per essere rivelato. V1V1 Es. Per V > V 1 gli ioni con m

31 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 31 Caratteristiche tipiche di un analizzatore a quadrupolo: Limite di massa < 4000 Th Risoluzione bassa (unitaria, picchi separati se differiscono di almeno ununità di massa) La risoluzione è ~ 3000 (oltre 3000 u i cluster isotopici non sono risolti; R aumenta aumentando L). Il potere risolutore è variabile lungo lintervallo di massa (m costante); (scansione a velocità uniforme). Elevata sensibilità. Non richiede focalizzazione del raggio ionico allingresso. Elevata velocità di scansione; può superare i 1000Th/s; adatto per accoppiamento con GC. Analizza anche ioni negativi (indipendente dalla polarità). Altre caratteristiche: Lanalisi non dipende dallenergia cinetica degli ioni che entrano nellanalizzatore (il tempo per attraversare il Q deve essere però breve rispetto alla scansione da una massa allaltra e abbastanza lungo da permettere alcune oscillazioni, per cui lenergia cinetica deve essere dellordine di eV). Gli ioni possono essere focalizzati al centro delle barre. Q Hoffmann & Stroobant, Mass Spectrometry, 2002

32 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 32 TRAPPOLA IONICA - IT La IT può essere immaginata come un quadrupolo piegato su se stesso a formare un anello chiuso: lasta interna svanisce in un punto, lasta esterna diventa un elettrodo circolare, lasta inferiore e superiore due elettrodi a calotta. Gli ioni sono tutti intrappolati da questo potenziale allinterno della sorgente in traiettorie stabili chiuse (orbite); nella trappola è presente He (10 -3 Torr) per far diminuire lenergia cinetica degli ioni tramite collisioni e concentrare gli ioni al centro della trappola, processo controbilanciato dalla repulsione elettrostatica. Il potenziale o è dato da un potenziale diretto DC U, e da un potenziale alternato RF, V: o = U + V cos t. IT z0z0 r0r0 filamento calotta superiore calotta inferiore elettrodo ad anello uscita ioni elettromoltiplicatore sezione trasversale della IT Le traiettorie stabili sono quelle che non superano i confini della trappola: r < r o, z < z o. La geometria della IT (r o,z o )èdefinita; fissata la frequenza =, si opera a U=0, e si imposta V in modo da intrappolare tutti gli ioni che interessano. Aumentando V, gli ioni a valori di m/z crescenti raggiungono il limite di stabilità superato il quale vengono espulsi in sequenza lungo la direzione z; il 50% esce dalla calotta inferiore e colpiscono il rivelatore.

33 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 33 Alluscita della regione di accelerazione uno ione di massa m e carica z ha un energia cinetica : zeV = ½ mv 2 ioni Forza magnetica F. centripeta = F.centrifuga zevB = mv 2 / r r = mv 2 / zeB solo gli ioni con un determinato m/z hanno una curvatura r corrispondente a quella del settore magnetico. Variando lintensità del campo elettrico V o magnetico B si misurano ioni con diverso m/z. m/z = B 2 r 2 e / 2V ANALIZZATORE A SETTORE MAGNETICO B sorgente ionica (EI) regione di accelerazione. Gradiente di potenziale V. Limiti alla risoluzione. Cause : divergenza angolare del fascio ionico aberrazione energetica : v = (2zeV/m) 1/2 ± v Formazione di ioni con velocità v i differenti in modulo e direzione ( distribuzione di Boltzmann delle energie termiche dei precursori degli ioni, disomogeneità di campo ). v + v i le traiettorie tendono a essere perpendicolari alle linee di campo equipotenziali (FOCALIZZAZIONE) ma cè una certa divergenza de fascio ionico ( ). rivelatore settore magnetico Il campo magnetico agisce alla direzione del moto; lo ione è deflesso in una traiettoria circolare

34 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 34 Spettrometri a doppia focalizzazione HRMS (high resolution mass spectrometry) divergenza angolare fascio ionico focalizzazione della direzione operata dallanalizzatore magnetico dispersione energetica degli ioni focalizzazione delle velocità operata analizzatore eletrostatico Guadagno di risoluzione incorporando due analizzatori: a campo elettrostatico e campo magnetico. La HRMS permette la determinazione delle masse esatte (composizione elementare) e la separazione di ioni isobari, ma è una strumentazione molto costosa. Analizzatore elettrostatico (ESA) Campo radiale V LESA uniforma le energie traslazionali compensando differenze nelle velocità iniziali. Ioni con troppa (poca) energia colpisono il polo positivo (negativo) – + piano focale della direzione piano focale della energia punto di doppia focalizzazione (fenditura duscita, rivelatore) Analizzatore magnetico F.elettrica F.centripeta =F.centrifuga zeV = mv 2 /r r = mv 2 / zeV = 2V /V sorgente ionica regione di accelerazione zeV = 1/2 mv 2 /r zeV = mv 2 / r

35 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 35 Tecniche combinate. GC-MS HPLC-MSMETODI DI ACQUISIZIONE Registrazione di tutti gli ioni di un determinato intervallo di massa (es. da m 1 = 50 a m 2 = 500 per monopositivi). Fornisce lo spettro di massa utile per lidentificazione (analisi qualitativa) La sensibilità può non essere sufficiente per lanalisi in tracce. La sensibilità diminuisce al diminuire del dwell time, Dt degli ioni. Nel Q gli ioni con un determinato m/z sono registrati per un tempo breve (ca. 1 ms) durante la scansione. Es. Dt = scan time/mass range = = 500 ms/(550-50)u = 1 ms/u m1m1 m2m2 m(u) t(ms) scan time FULL SCAN m1m1 m3m3 m(u) t(ms) scan time m2m2 Nel Q il tempo della scansione viene utilizzato per misurare solo alcuni ioni con determinati m/z.Non si ottiene lo spettro di massa totale, ma aumenta la sensibilità, perché aumenta il Dt.Es. 3 ioni analizzati, total scan time 500 ms Dt ~ 550/3 = 166 ms per ione Il guadagno in sensibilità è proporzionale al tempo speso dallo strumento sullo ione nellanalisi in SIM rispetto a quella in TIC. Es.: nellanalisi in TIC un intervallo di 500u viene registrato in 2 sec, tempo speso sullo ione 2/500 = 4 ms; guadagno in sensibilità nellanalisi in SIM (sempre 2 s utilizzati per la rivelazione) di (2000 ms/4 ms=) 500 volte. SELECTED ION MONITORING SIM

36 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 36 TOTAL ION CHROMATOGRAM - TIC Somma delle correnti ioniche di tutti gli ioni dello spettro di massa per ogni scansione spettrale. E un diagramma corrente ionica totale vs. numero di scansione (tempo). Lintensità dipende dallampiezza dellintervallo di scansione. MASS CHROMATOGRAM - MC È un estratto dei dati ottenuti dallanalisi in TIC, in cui vengono riportate solo le intensità di ioni selezionati in funzione del numero di scansioni (tempo danalisi). Aumenta la selettività rispetto al TIC (elimina ioni interferenti) e aumenta S/N. E quindi adatta allanalisi quantitativa ed è sempre possibile lidentificazione dei composti dallo spettro di massa totale m/z MCounts kCounts TIC MC a m/z 152 acenaftilene minuti Esempio: analisi GC-MS estratti di sedimento.

37 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 37 Scelta degli ioni specifici dellanalita. tra i più abbondanti dello spettro di massa in genere quelli di massa più elevata (> 200Th) che danno S/N migliori (la probabilità che i composti presenti in una miscela producano ioni caratteristici con lo stesso m/z diminuisce allaumentare di m/z) verificare lassenza di ioni interferenti nel campione in genere si scelgono tre-quattro ioni per confermare lidentità, e uno ione per lanalisi quantitativa. Criteri per lidentificazione in SIM (descriptors). Esempio: corrispondenza esatta di tre ioni caratteristici ai tempi di ritenzione dello standard con le corrette abbondanze relative (entro un certo intervallo di incertezza; es. 10% EI, 20% CI. S/N del picco almeno > 3.

38 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri methamphetamine triazolam : gli ioni a m/z 342 e 313 sono ioni a masse relativamente alte e abbondanti. Lo ione a m/z 313 è preferito rispetto al 344 perché la perdita di - 29 u ( ) è più significativa dello ione M+2, prodotto da ogni ione che contiene cloro. Gli ioni a m/z 344 o 315 possono essere scelti per la conferma; se dovesse esserci un fondo elevato in queste zone di m/z, rimane sempre la possibilità di scelta dello ione a m/z triazolam chlorambucil scelta degli ioni in SIM B.Ardrey LC-MS. An introduction, 2003 methamphetamine : scelta problematica. Lo ione a m/z 58 va bene per lanalisi quantitativa, ma è uno ione a masse basse poco specifico (tipico delle ammine), per cui la scelta di uno ione per la conferma è cruciale. Il secondo ione più abbondante a m/z 91 è poco specifico (comune a composti contenenti il gruppo benzilico). Lo ione ai valori più alti di m/z (134) è poco intenso, e comunque cade sempre in una zona di m/z bassi dove linterferenza dovuta al fondo può essere significativa. Considerare tecniche di ionizzazione soft per fornire maggiore specificità attraverso la formazione dello ione molecolare a valori m/z più alti. chlorambucil : lo ione a m/z 254 è sicuramente scelto per lanalisi quantitativa. Più problematica la scela degli ioni per la conferma. Lo ione 303 è a valori di m/z relativamente alti, ma è poco intenso, per cui la sua scelta può essere problematica a basse concentrazioni di analita. In alternativa si può scegliere lo ione M+2 come specificità della presenza di cloro.

39 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 39 Esempio: analisi eptaclorodibenzo-p-diossine in scarichi municipali. Identità molecolare formula bruta C 12 HO 2 Cl 7 peso molecolare (massa monoisotopica : 422 Da isomeri Analisi soluzione standard: GC tempi di ritenzione; MS scelta degli ioni:ioni selezionati m/z 422, 424 e 426 misurazione abbondanze relative :44 / 100 / 97. Analisi campione SIM a m/z 422, 424, 426. Spettro di massa banche-MS, siti web (NIST), letteratura, … m/z es. isotope distribution calculator (www.sisweb.com) calcola abbondanze relative cluster ioni molecolari inserendo la formula bruta

40 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 40 RISULTATI Analisi campione SIM a m/z 422, 424, 426. B D F Analisi eptaclorodibenzo-p-diossina time m/z 424 m/z 426 m/z cromatogramma su tre caratteristici ioni delleptaclorodibenzofiossina nellanalisi GC-MS SIM degli estratti. Tratta da FW Karasek, RE Clement, Basic GC-MS, 1988

41 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 41 Analisi qualitativa: Picchi B,D confermati: presenti gli ioni caratteristici a m/z 422, 424, 426. con rapporti delle aree che rispettano abbondanze relative (entro errore tipico 10-20%): / / = 36 / 100 / 99; / / = 38 /100 / 98 Confermati i tempi di ritenzione determinati dallanalisi dello standard. picco F scartato mancano gli ioni a m/z Assente nello standard. Analisi quantitativa: Metodo standard esterno. Single point calibration. (Curva di calibrazione fornirebbe migliore accuratezza, ma non effettuata per diminuire tempi di analisi). Analisi soluzione standard di un isomero. Ione selezionato m/z 424 (più abbondante): area 6400 per 100 pg iniettati. Fattore di risposta = 64 counts/pg. Risultato: 1.4 ng B, e 1.5 ng D. Analisi eptaclorodibenzo-p-diossina

42 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri m/z 97 2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-diossina Possibile scelta degli ioni per lanalisi in SIM: m/z 320, 322, 324. Analisi quantitativa effettuata sullo ione 322 Th. Rapporto delle aree dei picchi deve corrispondere alle abbondanze relative degli ioni nello spettro di massa (320:322:324 = 78:100:48). C 12 H 4 O 2 Cl 4 Massa media : Da; massa nominale : 320 Da massa monoisotopica 12 C 12 1 H 4 16 O 2 35 Cl 4 : Da ione più abbondante 12 C 12 1 H 4 16 O 2 35 Cl 3 37 Cl: Da Esempio: analisi diossina ( 2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-diossina) Interferenza da eptacloro bifenili (MW 392) in caso di coeluizione. La scelta dello ione a 322 potrebbe portare ad un falso positivo, e il monitoraggio di un altro ione di conferma (es.320) ad un falso negativo (rapporto 320:322 errati). potenziale interferenza da eptacloro bifenile m/z Luso della HRMS con una risoluzione > 12,500 permette di distinguere la diossina dalleptaclorobifenile ( u).

43 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 43 TANDEM MS - MS/MS - MS n La MS/MS consiste in almeno due stadi di analisi MS combinati con un processo di dissociazione o reazione chimica che determina una variazione di m/z dello ione. Il primo analizzatore isola lo ione precursore (precursor, parent ion, lo ione che poi subisce un processo) che subisce una reazione formando uno ione prodotto (product, daughter ion) analizzato dal secondo strumento. La reazione è in genere una frammentazione, e lo ione prodotto è uno ione frammento dello ione precursore. Mp + Mf + + N ione precursore ione prodotto + frammento neutro Esistono diverse configurazioni con analizzatori a settore magnetico B, elettrostatico E, e a quadrupolo Q. Nella figura la configurazione più comune: QQQ (QqQ) triplo quadrupolo. Il primo Q agisce da filtro di massa, il secondo q è una camera di collisione dove avviene la frammentazione degli ioni per collisione con un gas inerte, il terzo Q come filtro di massa degli ioni prodotti. Q - 1 ion source elettromoltiplicatore Q - 2Q -3 camera di collisione ionizzazione focalizzazione analisi m/z rilevazione dissociazioneanalisi m/z tandem in space

44 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 44 tandem MS La MS/MS richiede la frammentazione degli ioni precursori selezionati dal primo analizzatore. La frammentazione avviene tramite collisione con atomi/molecole di un gas inerte. Nella collisione lenergia cinetica dello ione (B: > 1 KeV, Q: eV, IT < 6eV) è trasformata in energia interna dello ione Il valore massimo di energia interna Ei che può essere assorbita da uno ione di energia cinetica Ec e di massa Mi che urta una particella di gas (target) di massa Mt è dato da: Ei = (Mt/Mi + Mt)Ec Esempio Ei = 2.9 eV per uno ione di 100u con Ec = 10eV che collide un atomo di Ar (40Da). CAD (CID) :COLLISION ACTIVATED (o -INDUCED) DECOMPOSITION Nella configurazione QqQ, il secondo quadrupolo non agisce come filtro di massa. Tutti gli ioni trasmessi dal primo Q e i suoi frammenti formati per collisione con il gas inerte arrivano al secondo Q. Q - 1 ione precursore Q - 3 ione prodotto cella di collisione sorgente ionica

45 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 45 Hubschmann, Handbook of GC/MS, 2001 In una trappola ionica tutti gli ioni sono resi instabili tranne quelli di interesse con un certo valore di m/z che vengono intrappolati nella sorgente; gli ioni selezionati sono eccitati per decomporli; gli ioni prodotto sono resi instabili e rilevati (product ion scan). Anche gli ioni prodotto possono essere intrappolati, decomposti ed i frammenti analizzati. Gli stadi di selezione, decomposizione ed analisi avvengono nella stessa zona dello strumento, ma separati nel tempo. Possono essere numerosi (n) e si parla di MS/MS/MS… o MS n. MS n MS 2 - HN(CH 3 ) CO MS CH MS 4 di m/z CO analisi ESI-IT-MS n di zolpidem 308 [M + H]+ ione molecolare MW 307 W.:F.Smith et al., Anal.Chim.Acta 506 (2004) 203 tandem in time

46 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 46 PRODUCT ION SCAN. Si seleziona lo ione precursore nel MS-1 e si fa lanalisi dei frammenti operando MS-2 in scansione. Si usano spesso metodi di ionizzazione soft per avere ioni (quasi)molecolari. MODI DI SCANSIONE MS fisso MS in scansione MS - 1 camera di collisione ion source detector MS - 2 PRECURSOR ION SCAN. MS-1 opera in scansione, mentre MS-2 opera in SIM su uno ione specifico. Vengono così identificati tutti gli ioni che producono lo stesso frammento. Non può essere effettuata nella tandem in time. NEUTRAL LOSS SCAN MS-1 e MS-2 operano in scansione simultanea, ma con una differenza di massa costante corrispondente alla massa di un frammento neutro (es. mentre MS-1 fa la scansione da 30 a 500, MS-2 la fa da 15 a 485, e la differenza di massa corrisponde alla perdita di un CH 3. SELECTED REACTION MONITORING (SRM). Si seleziona una reazione di frammentazione; MS-1 e MS-2 sono focalizzati su masse selezionate. E lanalogo MS/MS del SIM. tandem MS

47 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 47 Quando usare la MS/MS: disturbo causato dalla matrice co-eluizione con un interferente identificare la struttura di un composto incognito aumentare la sensibilità nellanalisi quantitativa conferma di unanalisi in SIM MS-1 SIM - MS-2 SCAN Utilizzato per confermare la presenza dell analita in una miscela complessa; per determinare la struttura di un composto incognito; per identificare lanalita quando la ionizzazione che si utilizza non produce frammentazioni (ESI, CI). MS-1 SCAN - MS-2 SIM Utilizzata per lanalisi specifica dei membri di una classe di composti con caratteristiche comuni. Analisi alchilfenoli nei carboni: MS-2 è impostata per il monitoraggio dello ione a m/z 107, relativo al frammento HO-C 6 H 4 -CH 2 +. MS-1 SIM - MS-2 SIM SRM. Caratterizzato da elevata sensibilità e selettività. Adatta per lanalisi di quantitativa di composti in tracce in matrici complesse. MS-1 SCAN NL MS-2 SCAN Utile per lanalisi di classi di composti, es.composti con lo stesso gruppo funzionale. Analisi PCDD: perdita consecutiva di Cl e CO, con una perdita netta di 63 Da. Lo strumento determina in modo specifico tutte le PCDD lavorando con una differenza di massa costante a 63 Da. tandem MS

48 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 48 Esempio: ormoni steroidei in acque di scarico municipali estradiolo testosterone m/z m/z spettro MS/MS Procedura Campioni di acque di scarico 4 L. Filtrazione. Aggiunta I.S. (100 ng/L mesterolone). SPE C18; lavaggio H 2 O/MeOH 6:4; eluizione H 2 O/MeOH 25:75. Derivatizzazione con anidride eptafluorobutirrica. Evaporazione. Ripresa con 0.1 mL iso-ottano. Analisi GC-MS/MS. EI 70 eV. EP Kolodziej et al. Environ.Toxicol.Chem.22(2003)2622 MW MW Analisi GC-MS/MS acqua di scarico 1 2 minuti tracciato GC m/z 681 m/z 664

49 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 49 Condizioni GC-MS/MS compostoRTprecursoreprodottoLODLOQ minm/zm/zng / Lng / L testosterone , 466, estradiolo androstenedione15.88 ecc. ecc. mesterolone (SIM) Esempio: ormoni steroidei in acque di scarico municipali - 2 EP Kolodziej et al. Environ.Toxicol.Chem.22(2003)2622 Quantificazione e controllo qualità. Identificazione. Tempo di ritenzione ( 0.1 min); abbondanza ioni prodotto (daughter) in MS/MS ( 20%). Calibrazione. Lineare, 7 punti spaziati su scala log da 1.0 a 100 ug / L. LOQ. Punto di più bassa concentrazione della calibrazione considerando la pre-concentrazione; S/N > 6. LOD. 1/3 del LOQ. Quantificazione. Somma delle aree dei picchi dello spettro MS/MS (base peak + confirmatory qualifiers); normalizzate sullo standard interno (mesterolone). QA/QC. Analisi dei bianchi (acqua distillata) (test contaminazione assente); campioni in duplicato (test precisione < 10%); recuperi (matrice fortificata con analiti 74% 27% n=18). …

50 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 50 La scelta della tecnica dipende da: concentrazione di PCB prevista (LOD richiesto). Tipo di interferenze sospettate. Risoluzione richiesta (determinazione congeneri o PCB totali). Potere di discriminazione qualitativa; accettabilità di falsi positivi e negativi (*). Accuratezza e precisione richiesta. Disponibilità della strumentazione. Tempi e costi di analisi. Esempio: analisi PCB MD Erickson Analytical Chemistry of PCBs HPLC risoluzione sufficiente per PCB totali. Rivelazione UV. HRGC (GC ad alta risoluzione: con colonna capillare) per lanalisi di congeneri. GC-FID per livelli di concentrazione alti (%) e bassa interferenza. GC-ECD se concentrazioni basse, ma ci sono poche interferenze da elettrofori. GC-MS per basse concentrazioni e presenza di interferenti.. MDGC (multidimensional GC, GC n ), GC-MS/MS, GC-HRMS per elevata selettività. (*) Esempio: falso positivo :accettabile in un monitoraggio sulla contaminazione da PCB (danno: sostiuzione inutile del fluido dielettrico); non-accettabile: nel latte umano di una poplazione che vive nei pressi di un inceneritore di PCB.

51 Chimica Analitica degli Inquinanti 8 - D.Fabbri 51 MD Erickson Analytical Chemistry of PCBs Ionizzazione chimica positiva (PCI). Per la minore frammentazione lo ione molecolare è in genere il picco principale nello spettro di massa. Usando metano come gas reagente si formano gli ioni [M+H] +, [M+C 2 H 5 ] +. Il vantaggio è limitato, perché ioni molecolari intensi si hanno anche in EI. Inoltre, la risposta PCI è influenzata dalle condizioni di ionizzazione con effetti negativi sulla precisione. Ionizzazione chimica negativa (NCI, ECMS). Ha caratteristiche di sensibilità e selettività (e reattività) simili allECD, con il vantaggio dellabilità di riconoscimento del MS. Ha i problemi di riproducibilità delle tecniche CI. Gli ioni possono essere M - e 35 Cl -, 37 Cl -. Ionizzazione elettronica (EI). Lacquisizione full scan è utile per lanalisi qualitativa; in SIM si migliora la sensibilità e la selettività dellanalisi. In genere si usa lo ione più intenso per la quantitativa, e il rapporto M/M+2 per il riconoscimento, eventualmente un terzo ione nei casi dubbi. Esempio: C 12 H 9 Cl188 (100)190 (33)C 12 H 8 Cl (100)224 (33)226 (11) C 12 H 7 Cl (100)258 (99)260 (33) C 12 HCl (100)432 (66)428 (87) Alta risoluzione (HREIMS). Maggiore certezza nellidentificazione, anche in presenza di diversi interferenti e senza separazione GC (analisi diretta). Tandem MS (MS/MS). Può essere adatta per lanalisi quali-quantitativa in miscele molto complesse, ad esempio con un elevato fondo dovuto a idrocarburi o lipidi. In genere lo ione precursore è lo ione a massa più bassa del cluster di ioni molecolari (C 12 H n 35 Cl 10-n ). Gli ioni prodotto sono in genere (M-Cl) +, (M-HCl) +, M- Cl 2 ) +. Esempio: PCB N° 52 ione precursore m/z 292, ioni prodotto m/z 257, 222, 220. Esempio: analisi PCB


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