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10 | 1Allison, FONDAMENTI DI BIOLOGIA MOLECOLARE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2008 La trascrizione nei procarioti.

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1 10 | 1Allison, FONDAMENTI DI BIOLOGIA MOLECOLARE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2008 La trascrizione nei procarioti

2 10 | 2Allison, FONDAMENTI DI BIOLOGIA MOLECOLARE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2008 Trascrizione e traduzione sono accoppiate nei procarioti Non appena inizia la trascrizione dellmRNA, i ribosomi vi si attaccano ed iniziano la sintesi proteica. La traduzione dellmRNA da parte dei ribosomi inizia non appena la sua estremità 5 diviene accessibile. Quando il primo ribosoma si sposta dallestremità 5, un secondo ribosoma può attaccarsi.

3 10 | 3Allison, FONDAMENTI DI BIOLOGIA MOLECOLARE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2008 Trascrizione (nucleo) e traduzione (citoplasma) sono disaccoppiate negli eucarioti

4 10 | 4Allison, FONDAMENTI DI BIOLOGIA MOLECOLARE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2008 RNA POLIMERASI E lenzima che catalizza la sintesi di RNA. Usando il DNA come stampo, questo enzima polimerizza NTP con legami fosfodiestere da 5 a 3. Polimerasi Geni trascritti Batteri RNA polimerasiTutti i geni batterici Nuclei eucariotici -RNA Polimerasi I -RNA Polimerasi II -RNA Polimerasi III -RNA Polimerasi IV (solo vegetali?) -Geni dellRNA ribosomale (rRNA) -mRNA, snoRNA, alcuni snRNA, miRNA -tRNA, 5S rRNA, alcuni snRNA -siRNA coinvolti nella formazione di eterocromatina Organelli eucariotici -RNA polimerasi mitocondriale -RNA polimerasi del cloroplasto multiple -Geni mitocondriali -Geni del cloroplasto

5 10 | 5Allison, FONDAMENTI DI BIOLOGIA MOLECOLARE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2008 LRNA polimerasi si lega ad una regione del DNA chiamata PROMOTORE -Il P. si trova a monte del punto di inizio della trascrizione (elemento cis-agente) -Differisce dalle sequenze del DNA trascritte/tradotte e serve come sequenza di riconoscimento da parte di proteine regolatrici (fattore trans-agente) -Il P. batterico possiede due sequenze esameriche consenso distinte, situate a -10 e -35 bp dal punto di inizio della trascrizione

6 10 | 6Allison, FONDAMENTI DI BIOLOGIA MOLECOLARE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2008 Nucleo Fattore LRNA polimerasi è un OLOENZIMA, costituito da un NUCLEO e da un Fattore LRNA polimerasi è un OLOENZIMA, costituito da un NUCLEO e da un Fattore -il Nucleo catalizza la polimerizzazione, ha PM 400 kDa, è composto da 5 subunità: I, II,, e Simile alle chele di granchio. Il legame del fattore al nucleo produce la chiusura delle pinze e la modificazione del canale interno in cui avviene la trascrizione. Il sito attivo si trova sul retro. -Il Fattore è coinvolto nel riconoscimento dei promotori dei geni; in comune 4 regioni di omologia aminoacidica, ciascuna suddivisa in sottodomini con funzioni specifiche. Fra i più abbondanti il, che si lega alla maggior parte dei promotori di E. Coli -Il Fattore è coinvolto nel riconoscimento dei promotori dei geni; in comune 4 regioni di omologia aminoacidica, ciascuna suddivisa in sottodomini con funzioni specifiche. Fra i più abbondanti il, che si lega alla maggior parte dei promotori di E. Coli Nucleo + Fattore

7 10 | 7Allison, FONDAMENTI DI BIOLOGIA MOLECOLARE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2008 Fattore sigmaInduttoreGeni bersaglio 70 Requisiti normali durante crescita esponenziale Geni housekeeping generali S Segnali di stress, radiazioni UV, shock da calore, iperosmolarità, pH acido, EtOH, transizione da crescita a fase stazionaria Geni generali che regolano lo stress (>70) 32 Shock da calore e altri stressProteine dello shock da calore: chaperones e proteasi Proteine non ripiegate nellinvolucro cellulare Geni che ripristinano lintegrità dellinvolucro F ( 38 ) Condizioni che promuovono la produzione di flagelli multipli Assemblaggio del flagello e chemiotassi FeclPrivazione di ferro e presenza di ferro citrato Macchinario di trasporto per lassunzione di ferro citrato 54 Mancanza di azoto (assenza di ammoniaca) Metabolismo di fonti alternative di azoto Fattori sigma alternativi di E. Coli

8 10 | 8Allison, FONDAMENTI DI BIOLOGIA MOLECOLARE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2008 La Trascrizione si articola in tre fasi: -Inizio -Formazione di un complesso del promotore chiuso -Formazione di un complesso del promotore aperto -Clearance del promotore -Allungamento -Terminazione

9 10 | 9Allison, FONDAMENTI DI BIOLOGIA MOLECOLARE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © ) Con laiuto del fattore, il nucleo dellRNA pol si lega al promotore in un complesso chiuso, in cui i filamenti del DNA sono appaiati. Questa fase è reversibile. 2) Loloenzima separa i filamenti del DNA intorno al sito di inizio della trascrizione, creando il complesso aperto. Si osservi un nucleotide NTP in ingresso. Questa fase è generalmente irreversibile. 3) Durante il passaggio della clearance del promotore, lRNA pol inizia la trascrizione e si sposta dal promotore. Si ha uno spostamento sequenziale di alcuni domini del fattore che altrimenti ostacolerebbero lestensione della nascente catena di RNA. Le porzioni spostate comprendono la regione 3.2 e la regione 4. INIZIO

10 10 | 10Allison, FONDAMENTI DI BIOLOGIA MOLECOLARE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2008 Lallungamento ha inizio dopo che sono stati sintetizzati 9-12 nt. La transizione è segnata da un cambiamento conformazionale nel nucleo dellenzima. Mentre si muove, lRNA pol mantiene separati i filamenti di DNA formando la bolla di trascrizione, man mano che li svolge davanti a sé per poi riavvolgerli. Allinterno della bolla, un filamento di DNA agisce da stampo per la sintesi di RNA. Il sito catalitico dellenzima è costituito da un sottosito di legame del substrato (per il successivo NTP), e da un sottosito di legame del prodotto (per lestremità 3 del nascente filamento di RNA). DallNTP viene rimosso un pirofosfato e si forma un legame fosfodiestere con il gruppo 3-OH dellultimo nucleotide della catena di RNA (il verso, come nella replicazione del DNA, è sempre 5->3). ALLUNGAMENTO

11 10 | 11Allison, FONDAMENTI DI BIOLOGIA MOLECOLARE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2008 TERMINAZIONE Due tipi di terminatori riconosciuti dallRNA pol: Terminazione Rho-indipendente Sono caratterizzati da una sequenza consenso costituita da una ripetizione inversa che può formare una struttura stelo-ansa appena prima dellultima base trascritta, in grado di destabilizzare la bolla provocandone il collasso. La sequenza ripetuta invertita è seguita da 7-8 nt contenenti uracile. Lelica ibrida RNA/DNA composta da coppie UA è meno stabile di altre coppie (GC, CG, AT). Questa combininazione contribuisce a terminare la trascrizione. Terminazione Rho-dipendente E controllata dalla capacità della proteina Rho di accedere allRNA. Rho è una proteina esamerica a forma di anello che si lega allestremità 5 dellRNA in un sito ricco in C (Rho utilization site, rut). Il temporaneo rilascio di una subunità dellesamero permette al segmento 3 del trascritto nascente di entrare nel canale centrale dellanello di Rho. Rho scorre quindi lungo lRNA dando la caccia allRNA pol: quando questa si ferma sulla struttura stelo-ansa, Rho può raggiungerla e svolgere il debole ibrido DNA/RNA. Ciò provoca la terminazione della sintesi dellRNA ed il rilascio di tutti i componenti,

12 10 | 12Allison, FONDAMENTI DI BIOLOGIA MOLECOLARE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2008 CORREZIONE DELLE BOZZE DA PARTE DELLRNA POLIMERASI Durante lallungamento, lRNA pol si muove sul DNA polimerizzando una catena di RNA. Lenzima, che è dotato di attività di proof-reading, può in qualsiasi momento scorrere indietro lungo lo stampo, provocando una pausa temporanea della trascrizione. A questo punto lRNA pol può scorrere di nuovo in avanti e far procedere la trascrizione (sin) oppure rimuovere nucleotidi di RNA male appaiati (dx).

13 10 | 13Allison, FONDAMENTI DI BIOLOGIA MOLECOLARE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2008 REGOLAZIONE DELLESPRESSIONE GENICA Il modello delloperone di Jacob e Monod per il controllo della sintesi degli enzimi che metabolizzano gli zuccheri prevede lesistenza di un repressore, prodotto da un gene regolatore (R) che si lega ad un sito operatore (O), bloccando lespressione di geni strutturali (A, B) che si trovano a valle del sito operatore. Il repressore può legarsi anche ad un induttore (metabolita), che diminuisce laffinità del repressore stesso per loperatore e permette lespressione dei geni strutturali. Il modello ipotizzava lesistenza di un intermedio di RNA (mRNA) nella sintesi proteica.

14 10 | 14Allison, FONDAMENTI DI BIOLOGIA MOLECOLARE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2008 Regolazione delloperone lac da parte di glucosio e lattosio Struttura delloperone lac: I: gene repressore, che codifica per il repressore Lac Pi: promotore del gene I O: operatore lac, a cui si lega il repressore Lac +1: sito di inizio della trascrizione CAP: sito di legame per la proteina attivatrice CAP P lac : promotore lac (controlla lespressione dei geni strutturali) lacZ: codifica per la -galattosidasi (enzima che cliva il lattosio in galattosio e glucosio) lacY: codifica per la lattosio permeasi (proteina che fa parte del sistema di trasporto dei -galattosidi nella cellula) lacA: codifica per una transacetilasi che libera la cellula dai tiogalattosidi tossici. Mutazioni a carico di lacZ e lacY impediscono alle cellule di metabolizzare il lattosio, mentre mutanti lacA possono ancora usare questo zucchero. Trascrizione delloperone lac La trascrizione delloperone lac viene repressa in assenza di lattosio, indipendentemente dalla mancanza (B) o dalla presenza di glucosio (C). In entrambe le condizioni, il repressore proteico Lac si lega alloperatore impedendo laccesso allRNA pol. In presenza di glucosio e lattosio (D), lRNA pol si lega debolmente al promotore lac, producendo un livello basale di trascrizione dei geni strutturali. Quando è presente solo il lattosio (E), loperone lac viene indotto: il legame di un induttore (allolattosio) cambia la conformazione del repressore Lac e ne altera il dominio di legame con loperatore. A questo punto, la proteina CAP, insieme al cAMP, recluta lRNA pol e si lega sul sito CAP stimolando di volte la trascrizione. I geni strutturali vengono infine trascritti come mRNA policistronico.

15 10 | 15Allison, FONDAMENTI DI BIOLOGIA MOLECOLARE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2008 STRUTTURE DEL LATTOSIO, ALLOLATTOSIO ED IPTG La -galattosidasi catalizza la scissione del lattosio in galattosio e glucosio. Una reazione collaterale converte il lattosio nellinduttore allolattosio (cambiamento del legame galattosidico da - 1,4 a - 1,6). La -gal non può metabolizzare un analogo del lattosio (IPTG) contenente zolfo, usato in biologia molecolare per indurre lespressione dei geni che sono sotto il controllo delloperone lac.

16 10 | 16Allison, FONDAMENTI DI BIOLOGIA MOLECOLARE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2008 Attenuazione trascrizionale delloperone del triptofano La regolazione delloperone del triptofano nei batteri è un classico esempio di attenuazione trascrizionale. Durante la trascrizione della regione leader delloperone del triptofano (trp), un dominio del trascritto di RNA appena sintetizzato si può ripiegare per formare due diverse strutture a forcina in competizione fra loro, terminatore ed antiterminatore. LRNA leader che precede lantiterminatore contiene una regione codificante di 14 nt, trpL, che include due codoni del triptofano. 1)Terminazione: si verifica quando le cellule hanno adeguati livelli di tRNA Trp per la sintesi proteica; in questo caso viene sintetizzato il peptide leader (trpL), nel trascritto leader si forma la struttura a forcina del terminatore, e la trascrizione viene bloccata. 2)Antiterminazione: si verifica quando i livelli cellulari di tRNA Trp sono scarsi; in questo caso, il ribosoma che traduce il trpL si blocca a livello di uno dei due codoni del triptofano. Questo stallo consente alla sequenza a valle di ripiegarsi, formando la struttura dellantiterminatore, che impedisce la formazione del terminatore (con cui compete). La trascrizione dei geni strutturali da parte dellRNA pol può dunque proseguire.

17 10 | 17Allison, FONDAMENTI DI BIOLOGIA MOLECOLARE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2008 Repressione delloperone del triptofano mediata da proteina Linizio della trascrizione delloperone del trp è controllato anche da sistemi più convenzionali. Un repressore dimerico attivato da triptofano si lega a siti operatori posti nella regione del promotore trp, bloccando laccesso dellRNA pol al promotore trp.


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