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LA BIOLOGIA MOLECOLARE NELLA DIAGNOSTICA DEI MICOBATTERI Enrico Tortoli.

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Presentazione sul tema: "LA BIOLOGIA MOLECOLARE NELLA DIAGNOSTICA DEI MICOBATTERI Enrico Tortoli."— Transcript della presentazione:

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2 LA BIOLOGIA MOLECOLARE NELLA DIAGNOSTICA DEI MICOBATTERI Enrico Tortoli

3 La diagnostica tradizionale Esame microscopico test rapido ma scarsamente sensibile Esame colturale sensibile ma richiede da una a otto settimane problema delle contaminazioni Identificazione test biochimico-colturali: scarsa specificità, tempi lunghi analisi degli acidi micolici: buona specificità, eseguibili solo da coltura, messa a punto dei test complessa Antibiogramma diretto: relativamente rapido ma con alta incidenza di contaminazioni da ceppo isolato: tempi lunghi

4 Amplificazione genica, alternativa allesame microscopico? Vantaggi sensibilità superiore (ma non di molto) specificità di specie (ed eventualmente anche di genere) Svantaggi esecuzione complessa costo elevato

5 Vantaggi molto più rapida se positiva rende superflua lidentificazione eseguibile anche su campioni pesantemente contaminati Svantaggi non altrettanto sensibile non rileva i micobatteri appartenenti ad altre specie false negatività dovute agli inibitori false positività dovute a contaminazioni costo elevato esecuzione complessa impossibilità di eseguire lantibiogramma Amplificazione genica, alternativa allesame colturale?

6 I target per lamplificazione del M. tuberculosis complex Geni presenti in copia singola gene codificante per lantigene da 65-kD (heath shock protein) Brisson-Noel et al. Lancet 1989 gene codificante per lantigene da 126-kD (fusion protein) Hermans et al. J.C.M gene codificante per lo rRNA 16S Boddinghaus et al. J.C.M gene codificante per lantigene di 38-kD (proteina b) Miyazaki et al. J.C.M gene codificante per la subunità β della RNA polimerasi Kim et al. J.C.M Sequenze ripetute IS6110 Eisenach et al. J.I.D. 1990

7 Amplificazione dei micobatteri, due approcci possibili in-house kit commerciali

8 Tecniche in-house PCR classica 2-tube nested PCR 1-tube nested PCR Reverse transcriptase PCR

9 Le tecniche utilizzate dai kit commerciali Polymerase chain reaction rDNA 16S rpoB Transcriptase mediated amplification rRNA 16S Strand displacement amplification IS6110 Real-time PCR rDNA 16S

10 I kit commerciali Amplicor (Roche) Amplified M. tuberculosis direct test (Gen-Probe) BDProbeTec ET (Becton Dickinson) RealArt M. tuberculosis (Abbott)

11 Amplicor PCR del DNA (frammento contenente sequenze genere- e specie-specifiche del gene codificante per il rRNA 16S) Estrazione, manuale (in prospettiva automatica, col kit AmpliPrep) Amplificazione e rilevamento dellamplificato automatizzata (Cobas) Rilevamento dellamplificato con metodica colorimetrica (avidina- perossidasi) Prevenzione delle contaminazioni col metodo della Uracile-N-glicosilasi (AmpErase) Co-amplificazione, non competitiva, di un plasmide avente regioni di annealing identiche a quelle del bersaglio. La mancata amplificazione del plasmide indica la presenza di inibitori Riconoscimento degli amplificati mediante sonde M. tuberculosis complex- e plasmide-specifiche

12 Amplified M. tuberculosis direct test TMA di un frammento del rRNA 16S contenente sequenze genere- e specie-specifiche Amplificazione isotermica dovuta allazione combinata di: transcriptasi inversa (sintesi di DNA dal RNA) RN-asi (separazione degli ibridi RNA-DNA) RNA-polimerasi (sintesi di RNA dal DNA) Riconoscimento dellamplificato mediante sonde specie- specifiche Rilevamento dellamplificato in chemio-luminescenza (HPA) Esecuzione interamente manuale ma semplice e rapida (non occorre il termociclatore ma occorre il luminometro)

13 RealArt PCR del DNA (frammento specie-specifico, di 163pb, del gene codificante per il rRNA 16S) Estrazione, manuale (usando kit del commercio) Amplificazione e rilevamento dellamplificato automatizzata (ABI Prism sequence detection system) Rilevamento fluorimetrico dellamplificato in tempo reale. Il segnale aumenta di intensità man mano che sonde specifiche, marcate con fluorocromo, ibridizzano con lamplificato Co-amplificazione di un controllo interno da aggiungere al campione. La mancata amplificazione indica la presenza di inibitori Costruzione di una curva di taratura con 4 standard per la determinazione del numero di copie di DNA presenti nel campione

14 Strand displacement amplification (SDA) 1 Nella fase di produzione del target un primer ed un bamper, complementari di sequenze bersaglio molto vicine, si legano ad un filamento di DNA denaturato, il primer contiene un sito di restrizione in presenza di DNA-polimerasi primer e bamper si allungano e questultimo spiazza il primer i filamenti spiazzati si uniscono ad altri primer e bamper dando luogo ad ulteriore allungamento-spiazzamento bamper sito di restrizione 5 3 target primer

15 Strand displacement amplification (SDA) 2 Nella fase di amplificazione esponenziale nei dimeri, il filamento contenente il sito di restrizione viene tagliato in due frammenti da uno specifico enzima e la porzione a monte si allunga spiazzando quella a valle il frammento spiazzato funge da stampo per il primer a valle e contemporaneamente si allunga ricreando il sito di restrizione Un controllo interno, avente sequenza di annealing identica a quella del target, viene co-amplificato solo se non sono presenti inibitori La tecnica è isotermica

16 il rilevamento dellamplificato nella SDA

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26 Amplificazione in house, pro e contro Costi minimi Sensibilità elevata Metodiche non standardizzate Contaminazioni non infrequenti Necessità di personale specializzato Brevetto Roche IDEALE PER LA RICERCA

27 Kit commerciali, pro e contro Kit tutto-incluso, con istruzioni Possibile fornitura delle apparecchiature in service Metodiche robuste Contaminazioni rare Omologazione solo per i materiali respiratori Costi medio-alti Sensibilità non eccelsa Rigidità delle metodiche IDEALE PER LA ROUTINE

28 Il test di amplificazione non sostituisce esame microscopico e colturale Da eseguirsi solo su campioni selezionati Lattendibilità del test sui materiali non respiratori non è dimostrata sufficientemente Non utilizzabile per il monitoraggio della terapia Le raccomandazioni dei CDC 1

29 Le raccomandazioni dei CDC 2 microscopia negativa (3 campioni) amplificazione negativa (2 campioni) amplificazione negativa (2 campioni) amplificazione positiva (2 campioni) amplificazione positiva (2 campioni) amplificazioni discordanti (2 campioni) amplificazioni discordanti (2 campioni) TBC ulteriori indagini non TBC

30 le raccomandazioni dei CDC 3 microscopia positiva (1, o più campioni) amplificazione positiva (1 campione) amplificazione positiva (1 campione) amplificazione negativa (2 campioni) amplificazione negativa (2 campioni) monitoraggio degli inibitori monitoraggio degli inibitori TBC presenti assenti micobatteriosi ripetizione del test

31 Specificità delle reazioni di amplificazione Molto buona, attorno al 99% Cause di false positività contaminazione nella fase pre-analitica o analitica cross-ibridizzazione con micobatteri non- tubercolari ??? Principali fattori che influenzano positivamente la specificità automazione inattivazione degli ampliconi prodotti in precedenti amplificazioni (UNG)

32 Dati della letteratura estremamente variabili % nei campioni microscopico-positivi 40-80% nei campioni microscopico-negativi valori più bassi nei campioni extrapolmonari Principali cause di sovrastima della variabilità scelta di un gold standard improprio selezione dei campioni Sensibilità delle reazioni di amplificazione

33 Cause di false-negatività Presenza di inibitori Estrazione subottimale dellac. nucleico Distribuzione non omogenea dei bacilli allinterno del campione Campione non idoneo

34 La coltura rimane ancora il test di riferimento per la diagnosi microbiologica della tubercolosi, i test genetici sono utili complementi ma sono lontani i tempi in cui potranno sostituirla I risultati dei test genetici devono essere sempre interpretati alla luce dei dati clinici e dei risultati della microbiologia tradizionale Amplificazione genica, alternativa allesame colturale?

35 Enorme risparmio di tempo Specificità pressoché assoluta Disponibili per un numero limitato di specie Costo Complessità di esecuzione DNA-probe, alternativa allidentificazione?

36 I DNA-probe commerciali AccuProbe (GenProbe) INNO LiPA Mycobacterium (Innogenetic) GenoType Mycobacteria (Hain)

37 AccuProbe Bersaglio: rRNA 16S Reazione: ibridizzazione in fase liquida, direttamente sulle colonie Rivelazione: in chemioluminescenza (HPA) Specificità: M. tuberculosis complex MAC o, in alternativa, M. avium e M. intracellulare separatamente M. kansasii M. gordonae Limiti: test a cascata non disponibili per specie comuni in Europa ma rare negli USA

38 Solid-phase reverse hybridization

39 INNO LiPA Mycobacterium Bersaglio: regione spaziatrice fra i geni codificanti per lo RNA 16S e 23S Reazione: ibridizzazione inversa, con 21 sonde immobilizzate su una striscia di cellulosa, del bersaglio amplificato mediante PCR (primer biotinilati) Rivelazione: colorimetrica (avidina-perossidasi) Specificità: Mycobacterium genere M. tuberculosis complex M. kansasii (differenziazione dei tipi I, II, III-IV-V-M. gastri) M. xenopi M. gordonae M. avium M. intracellulare (2 tipi) MAC M. scrofulaceum M. fortuitum M. marinum-M. ulcerans M. genavense M. haemophilum M. chelonae (differenziazione dei tipi I, III, II-IV) M. smegmatis M. malmoense M. celatum M. simiae Limiti: esecuzione complessa (ma con possibilità di automazione) alcune reattività crociate con specie rare

40 GenoType Mycobacteria Bersaglio: gene codificante per lo rRNA 23S Reazione: ibridizzazione inversa, con varie sonde immobilizzate su due strisce di cellulosa, del bersaglio amplificato mediante PCR (primer biotinilati) Rivelazione: colorimetrica (avidina-perossidasi) Specificità Gram + ad alto contenuto di GC Mycobacterium genere M. tuberculosis complex M. kansasii M. xenopi M. gordonae M. avium M. intracellulare M. scrofulaceum-M. paraffinicum M. malmoense-M. haemophilum-M. palustre-M. nebraskense M. peregrinum-M. septicum-M. alvei M. chelonae-M. immunogenum M. fortuitum 1 M. fortuitum 2-M. mageritense M. abscessus-M. immunogenum M. interjectum M. marinum-M. ulcerans Gram + ad alto contenuto di GC Mycobacterium genere M. simiae M. mucogenicum M. celatum I, III M. phlei M. szulgai-M. intermedium M. goodii M. haemophilum-M. nebraskense M. ulcerans M. gastri M. lentiflavum M. heckeshornense M. shimoidei M. genavense M. smegmatis M. kansasii M. asiaticum Limiti: esecuzione complessa (ma con possibilità di automazione) numerose identificazioni non univoche incorretta identificazione dei MAC non-M. avium, non-M. intracellulare alcune reattività crociate con specie rare

41 GenoType Mycobacteria MTBC Bersagli: gene codificante per lo rRNA 23S gene girB regione RD1 Reazione: ibridizzazione inversa, con 9 sonde immobilizzate su una striscia di cellulosa, del bersaglio amplificato mediante PCR (primer biotinilati) Rivelazione: colorimetrica (avidina-perossidasi) Specificità: M. tuberculosis complex M. tuberculosis M. africanum tipo I M. microti M. bovis M. bovis BCG M. caprae Limiti: esecuzione complessa (ma con possibilità di automazione) mancato riconoscimento di M. africanum tipo II, di M. canettii e di M. pinnipedii

42 Le tecnologie basate sullimpiego di sonde sono attualmente in grado di sostituire i test fenotipici per lidentificazione dei micobatteri più comuni Per le specie più rare il test di riferimento è rappresentato dal sequenziamento DNA-probe, alternativa allidentificazione?

43 Il sequenziamento genico E la tecnica di riferimento per lidentificazione Possibili bersagli 16S rRNA o rDNA 23S rDNA spacer fra i geni codificanti per rRNA 16S e 23S gene codificante per le heat shock proteins gene codificante per la superossido dismutasi

44 Tecnologia microarray-microchip Microarray: sistema multi-sonda miniaturizzato (controllato, o meno, elettronicamente) Identificazione in vari passaggi di numerosi ceppi (amplicon down) Identificazione di un solo ceppo con un solo passaggio (capture down)

45 Amplicon down I prodotti di PCR di vari micobatteri da identificare sono legati a differenti elettrodi di un micro-array Una o più sonde (marcate diversamente) sono aggiunte in sequenza A ciascun passaggio, il monitoraggio degli elettrodi che presentano ibridizzazione permette, in base alla specificità della sonda usata, lidentificazione del corrispondente amplicone

46 Capture down Varie sonde con diversa specificità sono legate ai singoli elettrodi di un micro-array Identificazione in base alla specificità della sonda legata allelettrodo su cui si è avuta libridizzazione Aggiunta del prodotto di PCR di un ceppo da identificare Rivelazione dellamplificazione con laggiunta di un reporter (sonda marcata) che riconosca un tratto non specie-specifico della regione amplificata

47 Epidemiologia molecolare Ricerca di marcatori, allinterno del genoma del microorganismo, dotati di specificità di ceppo Permette di ricostruire i flussi epidemici Permette di raggruppare i ceppi in grandi famiglie che riflettono il cammino dellevoluzione Permette il riconoscimento delle infezioni miste Permette di differenziare le recidive dalle reinfezioni Individua le contaminazioni di laboratorio

48 IS6110

49 Lunghezza 1361 pb; numero di copie 5-20; posizione variabile

50 Fingerprinting in base al IS6110

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58 Alcuni pattern RFLP

59 RFLP: Toscana, anni 2002 Ceppi raccolti: 245 Pattern RFLP: 215 Cluster di 2 ceppi: 19 di 3 ceppi: 3 di 4 ceppi: 1 Nessun focolaio epidemico Tre contaminazioni di laboratorio

60 Il locus DR (direct repeat)

61 Da 9 a 50 sequenze ripetute di 36 bp (DR) inframmezzate da sequenze non ripetute di bp (spaziatori) DR H37Rv DR BCG spaziatore DR Il locus DR

62 Spoligotyping BCG H37Rv X

63 I ceppi Beijing I vari spolygotipi possono essere raggruppati (in base alle somiglianze) in famiglie I ceppi della famiglia Beijing hanno soltanto gli spaziatori Presenti originariamente in Cina, vengono oggi isolati, con frequenza crescente, in quasi tutti i paesi del mondo Fra le caratteristiche principali: spiccata virulenza frequente sviluppo di resistenze multiple H37Rv Beijing

64 I ceppi Beijing isolati nel

65 I ceppi Beijing toscani 2002: 7 ceppi, pari al 3% 2003: 16 ceppi, pari al 6%

66 Altre famiglie I ceppi isolati in Toscana includono rappresentanti di molte delle famiglie a larga diffusione mondiale Non mancano ceppi (specialmente fra gli extra-comunitari) appartenenti a famiglie a diffusione più limitata E stata denominata Tuscany una famiglia mai segnalata in precedenza, rappresentata da 8 ceppi isolati da pazienti italiani

67 RFLP e spoligotyping RFLP: interessa lintero cromosoma alto potere discriminante impossibile limpiego dellamplificazione Spoligotyping: interessa una porzione limitata de genoma ceppi diversi possono avere identico spoligotipo possibilità di ricorso allamplificazione Possibile compromesso: esecuzione dello spoligotyping su tutti i ceppi e approfondimento mediante RFLP su quelli risultati identici o interessanti


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