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Gianfranco Blasi Arpalazio Rieti Formazione sulle tecniche di estrazione e preparazione del campione su matrici ambientali e alimentari Rieti 26 - 27 Novembre.

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1 Gianfranco Blasi Arpalazio Rieti Formazione sulle tecniche di estrazione e preparazione del campione su matrici ambientali e alimentari Rieti Novembre 2009 Formazione sulle tecniche di estrazione e preparazione del campione su matrici ambientali e alimentari

2 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 2 SPETTROFOTOMETRIA DI ASSORBIMENTO ATOMICO Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti2

3 3 Assorbimento Atomico Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti3 La spettrofotometria di assorbimento atomico (Atomic Absorption Spectrophotometry, AAS) è una delle tecniche maggiormente usate nellanalisi degli elementi in tracce (soprattutto metalli) in matrici di ogni genere, da quelle di interesse ambientale, come acque e terreni, fino agli alimenti e le leghe metalliche. E una tecnica spettroscopica basata sullo scambio di energia tra radiazione (luce) e sostanza (particelle assorbenti).

4 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 4 Assorbimento atomico Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti4 Questa tecnica si presta, in linea di principio, allanalisi sia qualitativa che quantitativa degli elementi, ma, di fatto, viene usata quasi esclusivamente per lanalisi quantitativa.

5 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 5 Assorbimento atomico In pratica, lelemento in esame viene atomizzato e bersagliato con radiazioni di lunghezza donda opportuna, per effetto dellassorbimento atomico, lintensità del raggio diminuisce e lattenuazione può essere correlata alla concentrazione dellelemento nel campione mediante unequazione matematica.

6 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 6 Assorbimento atomico Lassorbimento atomico sia pure in un intervallo di linearità abbastanza ristretto segue una legge analoga alla legge di Beer, che si può rappresentare: A = xbN dove x è il coefficiente spettrale di assorbimento atomico; b lo spessore dello strato assorbente (il cammino ottico); N il n° totale di atomi liberi. Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti6

7 7 Schema GFAAS - fornetto Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti7

8 8 Schema FAA - FIAMMA 1)lampada a catodo cavo -2)chopper - 3) lampada deuterio – 4) sistema di specchi - 5)bruciatore fiamma o fornetto di grafite – 6)monocromatore 7)detector Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti8

9 9 Sorgente La più usata è la lampada a catodo cavo: è costituita da un bulbo in vetro, con finestra di quarzo in cui al suo interno contiene un catodo e un anodo; lambiente interno e riempito di gas (Ar o Ne). Il catodo e costituito da una capsulina, la quale nel fondo contiene lelemento caratterizzante della lampada. 9Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

10 10 Chopper Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti10 La luce dalla sorgente viene modulata (pulsata) mediante un chopper, in modo da distinguere la luce emessa dalla lampada dalla luce emessa dallatomo eccitato.

11 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 11 Monocromatori e sistema ottico Il monocromatore è un sistema che permette di selezionare una sola lunghezza d'onda (o un range ristretto di lunghezze d'onda) di interesse per l'analisi che si vuole effettuare. Si basa sui fenomeni di diffrazione della luce, grazie a una serie di dati che imposta l'operatore il monocromatore, tramite una serie di specchi e lenti mobili, può isolare una sola componente cromatica (ovvero lunghezza d'onda) per poi utilizzarla.lunghezza d'onda Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti11

12 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 12 Rivelatori e sistema di lettura Il rilevatore è "l'organo sensoriale" dello strumento. Questo è quasi sempre un fotomoltiplicatore, ma può essere anche sostituito da fotodiodi o fotocellule nei casi in cui l'intensità della radiazione elettromagnetica sia molto forte (vedi Laser) o quando non si richiede una particolare accuratezza analitica. Il fotomoltiplicatore ha, il compito di trasformare il segnale luminoso dato dalla radiazione elettromagnetica in un segnale elettrico utilizzabile dal sistema di elaborazione.fotomoltiplicatorefotodiodi fotocelluleLaser Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti12

13 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti Il sistema di elaborazione Il sistema di elaborazione è generalmente un PC interfacciato con appositi hardware allo strumento. Un software permette alloperatore di comunicare e quindi gestire le varie fasi, dallimpostazione della metodica analitica allelaborazione dei dati. Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti13

14 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 14 Vari tipi di atomizzatore Esistono vari tipi di sistemi di atomizzazione: Atomizzazione mediante fiamma; Atomizzazione mediante fornetto di grafite; Atomizzazione mediante vapori freddi. Il fornetto di grafite fornisce una maggiore sensibilità rispetto alla fiamma, consente di abbassare notevolmente (1000 volte) i limiti di rivelabilità, inoltre consente di lavorare su aliquote molto piccole di campione ma ha tempi di analisi molto più lunghi. Il metodo vapori freddi è molto utilizzato nell'analisi del mercurio.mercurio Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti14

15 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 15 Atomizzazione a fiamma Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti15 Nel dispositivo di atomizzazione a fiamma, una soluzione di campione, viene aspirata nel nebulizzatore (dove si trasforma in aerosol), trasportata da un gas comburente (aria o protossido d'azoto) all'interno di una camera di premiscelazione (dove trova un dispositivo di abbattimento gocce), e mescolata con il gas combustibile. Nella testata del bruciatore si avranno infine, la combustione e l'atomizzazione

16 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 16

17 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 17 Tipi di Fiamma Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti17 Fiamma aria-acetilene – generalmente sufficiente per atomizzare la maggior parte degli elementi, utilizza una testata da 10 cm, con singola o tripla fenditura, raggiunge una temperatura pari a circa 2300°C. – Fiamma protossido di azoto – acetilene – utilizzata per gli elementi che formano composti molto stabili alle alte temperature e quindi difficile da atomizzare (Al, Ba, V, Ti, Si, Zr). La testata è di 5 cm e la temperatura raggiunge i 2800°C.

18 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 18 Fornetto di grafite La misura di assorbimento viene fatta sui vapori atomici che si liberano rapidamente nello stadio finale del riscaldamento. Il segnale che si ottiene è un picco la cui area (altezza) è direttamente proporzionale alla massa dellanalita. 18Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

19 19 Fornetto di grafite Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti19 Il riscaldamento del tubo di grafite è programmato con una sequenza di riscaldamento a step successivi: uno primo step per disidratare il campione ( °C), un secondo di pirolisi per incenerire il campione ed allontanare la matrice organica ( °C) ed un terzo step di atomizzazione a temperature elevatissime. Il programma di riscaldamento è specifico per il tipo di analita e latomizzazione è ottenuta in presenza di un flusso di argon per prevenire lossidazione della grafite e la formazione di composti refrattari.

20 Fornetto di grafite Il segnale che si ottiene è un picco la cui area (o altezza) è direttamente proporzionale alla massa dellanalita presente allo stato atomico nel tubo di grafite; lintervallo di linearità, è in genere più ampio di quello della classica spettrofotometria in fiamma. Larea del picco fornisce migliori risultati perché rappresenta lintera popolazione di atomi del campione prelevato per analisi e quindi non dipende dal tempo necessario per la completa atomizzazione di questultimo. Laltezza del picco, invece, dipende dalla concentrazione massima di atomi presenti nel fornetto durante lo stadio di atomizzazione, che risente in modo significativo dalla matrice. Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti20

21 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 21 Atomizzazione a vapori freddi Determinazione del mercurio Facendo reagire il campione con una soluzione di Sodio Boro Idruro (o cloruro stannoso) si riduce allo stato elementare il metallo. I vapori di Hg sono quindi trasportati da un flusso di gas inerte in una cuvetta alloggiata nel banco ottico dello spettrometro. Dalla misura del segnale di assorbanza a 253,7 nm si ricava la concentrazione mediante confronto con una curva di calibrazione ottenuta con soluzioni a concentrazioni note comprese nel campo di indagine analitica. il sistema permette di valutare concentrazioni dell'ordine dei decimi di microgrammi litro. Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti21

22 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 22 MERCURIO Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti22

23 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 23 Assorbimento di fondo Le interferenze derivanti dall'assorbimento di radiazioni da parte di molecole e radicali presenti nella fiamma sono dette anche non specifiche. Questo assorbimento si somma a quello specifico del solo analita ed è detto assorbimento del fondo. L'assorbimento di fondo abbassa lintensità della radiazione emessa dalla lampada a catodo cavo e per eliminarlo si utilizza: – la lampada al deuterio nel caso che la lunghezza d'onda dell'analisi sia nell'UV – leffetto Zeeman nel caso che si lavori con il fornetto di grafite munito dell'apposito dispositivo, o più semplicemente con il metodo delle aggiunte. 23

24 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 24 Sorgente continua lampada D2 Per superare il problema deve essere disponibile uno strumento doppio raggio nel quale affiancare una sorgente continua al deuterio (banda passante 0,2 nm) alla normale sorgente a catodo cavo (banda passante 0,002 nm). 24

25 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 25 La correzione dellassorbimento dovuto a speci non-atomiche (background) viene eseguita con lampada al deuterio attraverso comparazione elettronica dei due segnali: Lampada HCL ABS totale Lampada D 2 ABS Bakground ABS Corretta = ABS totale - ABS Bakground ABS Corretta = ABS lampada HCL - ABS lampada D2 Correzione rumore di fondo 25Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

26 26 Correzione del rumore di fondo Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti26 Sistema Zeeman – Il sistema fa un confronto tra l'analisi effettuata normalmente, e l'analisi effettuata con l'applicazione di un campo magnetico. Applicando un campo magnetico infatti, le righe di assorbimento risentono dell'effetto Zeeman e si suddividono in tre compenti, solo quella centrale però ha lunghezza adatta per indurre l'assorbimento. Questa riga però è polarizzata in direzione perpendicolare alla riga emessa dalla lampada e quindi quest'ultima subisce solo l'assorbimento di fondo (non polarizzato).

27 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti27

28 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti28

29 Effetto ZEEMAN Questo sistema presenta numerosi vantaggi: si possono correggere assorbanze specifiche maggiori di due unità; la correzione dellassorbimento di fondo viene effettuata alla stessa lunghezza donda della riga di risonanza, eliminando qualsiasi errore di misura; la correzione non risente di assorbimenti di fondo a struttura fine; si possono correggere anche le interferenze spettrali, se cadono a una distanza maggiore di 0,02 nm. Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti29

30 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti Esempio fasi atomizzazione Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti30

31 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti Risposta strumentale standard Cd 2µg/L Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti31

32 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti Curva taratura strumentale Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti32

33 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti Suolo La Comunicazione della CE - COM(2002)179 - afferma che lintroduzione di contaminanti nel suolo può danneggiare o distruggere alcune o diverse funzioni del suolo e provocare una contaminazione indiretta dellacqua. La presenza di contaminanti nel suolo oltre certi livelli comporta una serie di conseguenze negative per la catena alimentare e quindi per la salute umana e per tutti i tipi di ecosistemi e di risorse naturali. Per valutare limpatto potenziale dei contaminanti del suolo, è necessario non solo valutarne la concentrazione, ma anche il relativo comportamento ambientale e il meccanismo di esposizione per la salute umana e degli ecosistemi.

34 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti Suolo Le metodologie di analisi dei metalli pesanti nel suolo, normate dal DM 13/09/99 n. 185 GU N. 248 del 21/10/1999-Metodi ufficiali di analisi chimica dei suoli, sono di fondamentale importanza per controllare linquinamento ambientale provocato dallaccumulo di questi elementi chimici e per definire gli interventi da attuare per ridurre gli effetti tossici negli ecosistemi naturali ed agrari. Per i campioni di suolo la determinazione di tutti gli analiti deve essere effettuata sulla frazione granulometrica passante al vaglio di 2 mm, ed i risultati ottenuti vanno riferiti al peso secco del suolo passato a tale vaglio.

35 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 35 TERRE E ROCCE DA SCAVO Lart 186 del D.Lgs 152/06 disciplina le terre e rocce da scavo e all'effettivo utilizzo per reinterri, riempimenti, rilevati e macinati che possono costituire rifiuti se provenienti da sito potenzialmente inquinato (unarea sottoposta a bonifica e/o a caratterizzazione) e quindi soggette ai controlli Arpa. 35Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

36 36 I LICHENI 36Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti I licheni, sono strutture vegetali che originano dalla simbiosi di un fungo ed un alga, da ciò derivano caratteristiche uniche che determinano una particolarmente sensibilità allinquinamento.

37 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 37 I LICHENI 37Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti dipendono quasi esclusivamente dallatmosfera per il proprio nutrimento (si possono infatti veder crescere anche su rocce), e, a differenza delle piante, non hanno meccanismi di difesa come cuticola o stomi per proteggersi da eventuali sostanze tossiche presenti.

38 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 38 I LICHENI 38Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti Agiscono come spugne, assorbendo dallatmosfera, insieme allumidità, anche tutte le sostanze presenti. Alga e fungo vivono in un equilibrio che la presenza delle sostanze inquinanti perturba, condizionando sopravvivenza e crescita del lichene.

39 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 39 I LICHENI 39Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti Per questa ragione i licheni sono sempre più studiati ed utilizzati come preziosi bioindicatori, cioè come indicatori viventi dei livelli di inquinamento atmosferico

40 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 40 I LICHENI 40Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti I licheni agiscono anche come bioaccumulatori, infatti, non potendole utilizzare, accumulano notevoli quantità di sostanze tossiche, lanalisi chimica di quello che si trova nei licheni fornisce molte indicazioni su ciò che cè o che cera nellaria, e quando le concentrazioni sono troppo elevate il lichene muore.

41 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 41 I LICHENI 41Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti Da quanto detto appare chiaro che i licheni assumono ciò che di buono o cattivo capita a loro portata, sono sensibili a tutti i contaminanti più comuni e più tristemente famosi quando si parla di inquinamento: anidride solforosa, ossidi di azoto, e poi i metalli pesanti come piombo, rame, nichel, cadmio, zinco.

42 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 42 MITILI La caratteristica più importante, che la specie scelta come bioindicatore deve presentare, è la mancanza di meccanismi biochimici o fisiologici in grado di regolare le concentrazioni tissutali dei contaminanti. In questo modo, infatti, lorganismo concentra queste sostanze nei propri tessuti in maniera proporzionale al loro livello ambientale 42Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

43 43 MITILI I principali vantaggi offerti da un programma di monitoraggio condotto mediante lutilizzo di bioindicatori si possono riassumere nei seguenti punti: - valutazione del grado di contaminazione dellarea costiera secondo una misura integrata nel tempo e non riferibile, quindi, al solo momento in cui è stato effettuato il prelievo; - possibilità di evidenziare facilmente gradienti di inquinamento sia in senso spaziale che temporale, nonché di effettuare confronti tra aree geograficamente distanti 43Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

44 44 MITILI - stima della biodisponibilità delle sostanze tossiche presenti nellambiente marino e valutazione del rischio legato al trasferimento di questi elementi attraverso le catene alimentari. 44Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

45 45 MITILI La specie sicuramente più utilizzata a livello mondiale per questo tipo di studi è il mitilo comune (Mytilus galloprovincialis), per il quale la letteratura internazionale offre numerosi dati di riferimento ed indicazioni sulle principali variabili biologiche da considerare nella interpretazione dei dati. 45Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

46 46 MITILI dopo il prelievo, i campioni destinati allo studio del bioaccumulo possono essere mantenuti refrigerati a circa 4°C, in ambiente umido ma non immersi in acqua, fino a un massimo di 24 ore dal momento del prelievo; oppure possono essere congelati a -20°C per tempi di analisi più lunghi. 46Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

47 47 Analisi del contenuto di metalli pesanti in Mytilus galloprovincialis Il metodo prevede la digestione dei campioni con opportune soluzioni acide mediante sistema chiuso, a microonde. Il contenuto dei metalli è determinato per spettrofotometria ad assorbimento atomico con atomizzazione a fiamma o termoelettrica. Per il mercurio si utilizza la tecnica dello strippaggio a vapori freddi previa riduzione del mercurio con cloruro stannoso o sodio boridruro. 47Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

48 48 Esempio di preparazione della soluzione per la mineralizzazione con forno a microonde Indipendentemente dalle metodologie ed apparecchiature utilizzate per la mineralizzazione dei campioni e la determinazione degli elementi, nel rapporto di analisi devono essere specificati il limite di rilevabilità della metodica utilizzata e le percentuali di recupero dei singoli elementi (accuratezza) rispetto a matrici organiche certificate. 48Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

49 49 Esempio di preparazione della soluzione per la mineralizzazione con forno a microonde Trasferire circa 0,3 g di campione (sostanza secca) nellapposito contenitore. Addizionare 7 ml di HNO3 e 1 ml di H 2 O 2. Lasciare riposare dopo laggiunta dei reattivi per 15/20 minuti. Impostare il ciclo operativo appositamente predisposto. Dopo raffreddamento travasare in un matraccio tarato e portare a volume (100ml) con acqua ultrapura. La prova in bianco viene effettuata con le stesse modalità operative e con le stesse quantità di reagenti 49Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

50 50 RIFIUTI La normativa di riferimento a livello nazionale in materia di rifiuti è rappresentata dal Decreto legislativo n. 152 del 3 aprile 2006, emanato in attuazione della Legge 308/2004 delega ambientale e recante norme in materia ambientale. Tale Decreto dedica la parte IV alleNorme in materia di gestione dei rifiuti e di bonifica dei siti inquinati (articoli 177 – 266) ed ha abrogato una serie di provvedimenti precedenti tra cui il Decreto legislativo n. 22 del 5 febbraio 1997, cosiddetto Decreto Ronchi.Decreto Ronchi 50Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

51 51 RIFIUTI La classificazione dei rifiuti presente nel D.lgs. 152/06 distingue i rifiuti secondo lorigine in: Rifiuti urbani e Rifiuti speciali,classificazione dei rifiuti secondo le caratteristiche di pericolosità in: Rifiuti pericolosi e non pericolosi. Lart. 184, comma 5), stabilisce che sono rifiuti pericolosi quelli contrassegnati da apposito asterisco nellelenco CER Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

52 52 RIFIUTI In tale elenco alcune tipologie di rifiuti sono classificate come pericolose o non pericolose fin dallorigine, mentre per altre la pericolosità dipende dalla concentrazione di sostanze pericolose e/o metalli pesanti presenti nel rifiuto. I "metalli pesanti" sono antimonio, arsenico, cadmio, cromo (VI), rame, piombo, mercurio, nichel, selenio, tellurio, tallio e stagno: possono essere presenti sia puri che, combinati con altri alementi, in composti chimici. 52Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

53 53 RIFIUTI Già con il Dlgs 22/97 in Italia incominciò il "nuovo corso dei rifiuti" emanato con l'intento e con la necessità di avvicinarsi alle Direttive europee in materia. Ma è con l'introduzione del D.Lgs. 36/03 e del Decreto Ministeriale del 13 marzo 2003 che lo scenario dello smaltimento e della classificazione dei rifiuti in Italia è cambiato.

54 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 54 NORMATIVA CONTAMINANTI NEGLI ALIMENTI 54Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti Quadro legislativo Regolamento (CEE) n. 315/93 del Consiglio, dell8 febbraio 1993, che stabilisce procedure comunitarie relative ai contaminanti nei prodotti alimentari (G.U. Serie L n. 37 del 13 febbraio 1993) Tenori massimi Regolamento (CE) n. 1881/2006 della Commissione del 19 dicembre 2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari (G.U.U.E. Serie L n. 364 del 20 dicembre 2006) Regolamento (CE) n. 1126/2007 della Commissione del 28 settembre 2007 che modifica il regolamento (CE) n. 1881/2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari per quanto riguarda le Fusarium-tossine nel granoturco e nei prodotti a base di granoturco (G.U.U.E. Serie L n. 255 del 29 settembre 2007)

55 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 55 NORMATIVA CONTAMINANTI NEGLI ALIMENTI 55Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti Regolamento (CE) n. 565/2008 della Commissione del 18 giugno 2008 recante modifica del regolamento (CE) n. 1881/2006, che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari per quanto riguarda la definizione del tenore massimo di diossine e PCB nel fegato di pesce. Regolamento (CE) n. 629/2008 della Commissione del 2 luglio 2008 che modifica il regolamento (CE) n. 1881/2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari. Campionamento ed analisi Regolamento (CE) n. 1882/2006 della Commissione del 19 dicembre 2006 che stabilisce metodi di campionamento ed analisi per il controllo ufficiale del tenore di nitrati in alcuni prodotti alimentari (G.U.U.E. Serie L n. 364 del 20 dicembre 2006)

56 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti NORMATIVA CONTAMINANTI NEGLI ALIMENTI Campionamento e analisi Regolamento (CE) n. 401/2006 della Commissione del 23 febbraio 2006 relativo ai metodi di campionamento e di analisi per il controllo ufficiale dei tenori di micotossine nei prodotti alimentari (G.U.U.E. Serie L n. 70 del 9 marzo 2006) Regolamento (CE) n. 333/2007 della Commissione del 28 marzo 2007 relativo ai metodi di campionamento e di analisi per il controllo ufficiale dei tenori di piombo, cadmio, mercurio, stagno inorganico, 3- MCPD e benzo(a)pirene nei prodotti alimentari (G.U.U.E. Serie L n. 88 del 29 marzo 2007) Regolamento (CE) n. 1883/2006 della Commissione del 19 dicembre 2006 che stabilisce metodi di campionamento danalisi per il controllo ufficiale dei livelli di diossine e di PCB diossina-simili in alcuni prodotti alimentari (G.U.U.E. Serie L n. 364 del 20 dicembre 2006)

57 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti Campionamento e analisi Alimenti Quelli che ha noi interessano maggiormente, visto che trattano degli unici metalli (Pb, Cd, Hg e Sn) per i quali è previsto un limite massimo negli alimenti, sono: Regolamento (CE) n. 1881/2006 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari in particolare Pb, Cd, Hg e Sn Regolamento (CE) n. 333/2007 relativo ai metodi di campionamento e di analisi per il controllo ufficiale dei tenori di piombo, cadmio, mercurio, stagno inorganico,

58 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti Campionamento e analisi Alimenti In fase di campionamento occorre adottare precauzioni per evitare qualsiasi alterazione che possa incidere sul tenore dei contaminanti, compromettere la determinazione analitica o la rappresentatività dei campioni globali. I campioni devono essere prelevati per quanto possibile in vari punti distribuiti nell'insieme della partita o della sottopartita. Qualsiasi deroga a tale procedura va segnalata nellapposito verbale

59 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti Campionamento e analisi Alimenti L'analista deve garantire che i campioni non subiscano alcuna contaminazione durante la loro preparazione. Se possibile, le apparecchiature e le attrezzature che vengono a contatto con il campione non devono contenere i metalli da determinare e devono essere realizzate con materiali inerti, ad esempio materie plastiche come il polipropilene, il politetrafluoroetilene (PTFE), ecc. La pulizia dovrebbe essere effettuata con acidi per ridurre al minimo il rischio di contaminazione. Per le lame è consentito l'impiego di acciaio inossidabile di elevata qualità.

60 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti Campionamento e analisi Alimenti Lanalisi va effettuata su un campione più possibilmente omogeneo e rappresentativo, una cui porzione (±0.5g) viene mineralizzata con acidi altamente ossidanti, in genere HNO 3 ed in presenza di H 2 O 2 per garantire la completa distruzione della sostanza organica. Ottenuta la dissoluzione si porta il liquido ad un volume noto (100 ml) e si procede alla lettura in assorbimento atomico. Vista la complessità delle matrici in esame è opportuno utilizzare i modificatori di matrice.

61 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti Campionamento e analisi Alimenti Il ricorso ad un idoneo modificatore consente di rendere la matrice più volatile o di formare composti più stabili con lelemento in esame; mediante un opportuno ciclo elettrotermico è possibile allontanare la matrice senza perdere lanalita di interesse. Permettono di ottimizzare le condizioni analitiche consentendo agli strumenti di raggiungere migliori limiti di rilevabilità e di dare una migliore risposta durante lanalisi.

62 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 62 Estrazione e preparazione La determinazione dei metalli nelle matrici ambientali, solide in particolare, è una combinazione di procedure di digestione con lo scopo di dissolvere il campione per la successiva analisi. 62Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

63 63 Estrazione e preparazione Nel campo nazionale ed internazionale vengono usate diverse tipologie di tecniche di digestione anche in funzione delle diverse matrici. Le tipologie di digestioni variano dalla determinazione totale ottenuta usando la dissoluzione completa della matrice fino alla digestione parziale (con presenza di una frazione residua). 63Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

64 64 Estrazione e preparazione La digestione è quindi una combinazione di un processo di ossidazione della materia organica e dissoluzione/estrazione della parte minerale dove vengono portati in soluzione gli elementi di interesse per la successiva determinazione strumentale. 64Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

65 65 Estrazione e preparazione Le tecniche di digestione nell' analisi di matrici ambientali sono essenzialmente rivolte al trattamento mediante acidi forti o miscele di essi. Vi sono metodi che prevedono l'uso di acidi diluiti e tecniche cosiddette di "fusione" usando acidi e basi concentrate a temperature maggiori di 300°C. 65Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

66 66 Estrazione e preparazione L'acido nitrico concentrato (68%, 16M), è il più comunemente usato per la digestione acida. E un forte ossidante usato per la dissoluzione di leghe e campioni biologici, sebbene spesso risulta necessaria l'aggiunta di HCl o HF per completare la dissoluzione di molti metalli e minerali, che formano specie complesse. 66Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

67 67 Estrazione e preparazione In generale l'acido nitrico forma un azeotropo con l'acqua al 68%; HNO 3, ha punto d'ebollizione a 122°C. Il punto d'ebollizione relativamente basso fa si che spesso si rende necessaria l'aggiunta di altri forti ossidanti come H o HCl0 4. Le proprietà ossidanti dell' HNO 3 vengono a mancare sotto la concentrazione 2 M. 67Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

68 68 Estrazione e preparazione L'acido cloridrico concentrato (36%, 12 M) è un ottimo solvente per molti ossidi di metalli, ma viene raramente usato da solo per la digestione acida. Viene comunemente usato con HNO 3 in rapporto 3:1(acqua regia). 68Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

69 69 Estrazione e preparazione Lacido fluoridrico risulta essere l'unico acido capace di dissolvere completamente i materiali a base di silice, come sedimenti, terreni ecc. Solitamente a livello commerciale è disponibile alla concentrazione del 48% corrispondente a 29M 69Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

70 70 Estrazione e preparazione L'acido fluoridrico corrode il vetro, pertanto le mineralizzazioni devono essere condotte in contenitori di plastica, preferibilmente di teflon; è un acido tossico e corrosivo, risulta essere uno dei più pericolosi che si possono usare in laboratorio. 70Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

71 71 Estrazione e preparazione Le ragioni che conducono all'uso delle miscele di acidi possono essere: -Sfruttare le proprietà di ogni singolo acido che compone la miscela (ad esempio il potere ossidante insieme al potere complessante). -Due o più acidi hanno un potere reattivo elevato. -Moderare la proprietà di un singolo acido con la presenza di un altro acido. 71Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

72 72 TIPI DI MINERALIZZAZIONE Tra le più comuni procedure di digestione acida (mineralizzazione) vi è la cosiddetta mineralizzazione a ricadere. Questa procedura che ha anche problemi di riproducibilità dovuta alla presenza di metalli volatili che vengono persi durante la mineralizzazione è stata completamente soppiantata dal sistema chiuso in forno a microonde. 72Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

73 73 MICROONDE-MINERALIZZAZIONE Il più grosso vantaggio della digestione a microonde è la possibilità di scaldare rapidamente il campione e poter controllare nel migliore dei modi la temperatura e la pressione di reazione; inoltre il sistema chiuso minimizza la perdita di metalli volatili come ad esempio As e Se. 73Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

74 74 MICROONDE-MINERALIZZAZIONE Altri vantaggi consistono nell'impiego di un minor volume di acidi e nella notevole riduzione dei tempi. Generalmente si fanno reagire da 0.5g-2g di campione in 6-8ml di acido o miscela acida per 10÷15 minuti. 74Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

75 75 MICROONDE-MINERALIZZAZIONE Il sistema è costituito da più contenitori (max 12), generalmente in teflon (Vessel),nei quali si inserisce il campione e gli acidi necessari alla digestione, la chiusura è ermetica mediante tappo munito di valvola di sicurezza. Il tutto, assemblato nellapposto rotore viene introdotto all'interno del un forno a microonde e dopo aver collegato i sensori di temperatura e pressione si procede alla mineralizzazione attivando il programma appositamente predisposto. 75Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

76 MICROONDE-MINERALIZZAZIONE Finito il ciclo si lascia raffreddare e si procede al recupero del campione portando ad un volume noto (100ml) con acqua ultrapura avendo cura di lavare accuratamente il contenitore. Eventuale presenza di residui insolubili viene rimossa per centrifugazione. La soluzione limpida ottenuta viene portata alla lettura strumentale per determinare la concentrazione dei metalli, confrontando le varie assorbanze ottenute con una retta di calibrazione creata per ogni singolo elemento avendo cura della linearità della stessa nel range in esame. Per concentrazioni che non rientrano nel range di calibrazione si procede alla diluizione dei campioni o allutilizzo di una lunghezza donda meno sensibile

77 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti Esempio di mineralizzazione per i sedimenti Trasferire circa 0,5 g del campione di sedimento tal quale nellapposito contenitore, tolti manualmente eventuali corpi grossolani superiori a 0,5 centimetri. Addizionare 3 ml di HCl e 9 ml di HNO 3 e lasciare riposare minuti. Eseguire il ciclo operativo appositamente programmato, lasciare raffreddare,addizionare 2 ml di HF, lasciar riposare minuti e ripetere il ciclo di mineralizzazione. Dopo raffreddamento aggiungere 30 ml di soluzione satura di H 3 BO 3, trasferire la soluzione in contenitore tarato e portare a volume (100 ml) con acqua ultrapura. La procedura dovrà essere eseguita in doppio per ogni campione. La prova in bianco viene effettuata con le stesse modalità operative sulla soluzione composta da 3 ml di HCl e 9 ml di HNO3 e 2 ml di HF.

78 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti Esempio di mineralizzazione per i sedimenti Tutte le procedure di digestione ed analisi dovranno essere ripetute su campioni certificati. I risultati finali vanno espressi in mg/kg peso secco. I risultati cosi ottenuti sono riferiti ad 1 kg di sostanza secca a 105°C, previa determinazione gravimetrica del contenuto di umidità residua, come indicato dal D.M. 185 del 13/09/99Approvazione dei metodi ufficiali per lanalisi chimica del suolo (Metodo II.2). Le pesate per ottenere il valore di umidità (almeno in doppio) vanno eseguite contemporaneamente a quella per la determinazione dei metalli.

79 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 79 Forno a microonde

80 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 80 Forno a microonde Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti80

81 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti Forno a microonde

82 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti Forno a microonde 1)Contenitore in teflon (vessel); 2) Tappo con valvola di sicurezza; 3) Camicia; 4) sensore pressione; 5) sensore temperatura Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti82

83 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti Forno a microonde

84 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 84 MICROONDE-MINERALIZZAZIONE Il riscaldamento è ottenuto con un sistema generatore di microonde ad elevata frequenza 2450 MHZ. Le microonde sono onde elettromagnetiche con una frequenza (al disopra del IR e al disotto delle onde radio) particolare che determina un forte movimento convettivo delle molecole di acqua che si traduce in un riscaldamento rapido e molto efficiente (sono sufficienti pochi minuti di irradiazione con microonde per portare alla temperatura di ebollizione una soluzione) Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti84

85 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 85 MICROONDE-MINERALIZZAZIONE Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti85 Generalmente la temperatura massima utilizzata in questa apparecchiatura per evitare la deformazione e la rottura dei contenitori di Teflon è di 240°C ed una pressione limite di 8,3 MPa.

86 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 86 MICROONDE-MINERALIZZAZIONE La determinazione quantitativa degli elementi nelle soluzioni ottenute con i diversi metodi di mineralizzazione può essere soggetta a diversi errori che sono indipendenti dalla metodologia utilizzata per lanalisi dei metalli pesanti. Gli errori più frequenti sono la presenza di impurezze o contaminazioni provenienti da reagenti o da acidi casualmente contaminati o di bassa purezza, utilizzazione di vetreria non perfettamente pulita, solubilizzazione di elementi dai contenitori di vetro o speciali durante lattacco acido. Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti86

87 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 87 MICROONDE-MINERALIZZAZIONE Altre fonti di errore possono essere causate dalla metodologia utilizzata per la digestione del campione: incompleta dissoluzione, perdite di alcuni elementi per volatilizzazione, formazione di complessi refrattari (monossidi) come Al, Ti, Mo e V. Questi errori comportano, generalmente, una sovrastima della concentrazione di alcuni elementi comparati con i contenuti dei CRM (Certified Reference Materials)

88 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 88 MICROONDE-MINERALIZZAZIONE Per l'analisi di Campioni reali, sono disponibili Matrici di Riferimento Certificate (CRM- Certified Reference Materials) per la quantificazione ed il monitoraggio di microcontaminanti organici, elementi in tracce (metalli pesanti) e altri composti organici (VOC, COV, TPH, Clorurati, TOC), in Suoli, Sedimenti, Ceneri, Acque di Scarico, Ambiente Marino e Lacustre, Piante, Alimenti etc.

89 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti MICROONDE-MINERALIZZAZIONE Lutilizzo di materiali di riferimento certificati nelle prove di laboratorio assicura che i risultati siano riferibili, ovvero che il risultato finale possa essere messo in relazione con un riferimento riconosciuto (unità di misura primaria); consente inoltre di verificare se la procedura utilizzata è più o meno adeguata allo scopo prefisso.E quindi importante per la validazione di un metodo.

90 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti MICROONDE-MINERALIZZAZIONE L'uso appropriato dei materiali di riferimento certificati ci da la possibilità di valutare la qualità del metodo e del dato analitico, quali la linearità di risposta, l'esattezza, la precisione, laccuratezza, i limiti di rivelazione e di quantificazione, la selettività e la specificità.

91 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 91 MICROONDE-MINERALIZZAZIONE 91Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti

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95 95 TEST DI CESSIONE PER IL TEST DI CONFORMITÀ EN :2004 one stage batch test at a liquid to solid ratio of 21/Kg with particle size below 4 mm (without or with size reduction). EN :2004 one stage batch test at a liquid to solid ratio of lO 1/Kg with particle size below 4 mm (without or with size reduction). EN :2004 one stage batch test at a liquid to solid ratio of 2 l/Kg anf S1/Kg with particle size below 4 mm (without or with size reduction). EN :2004 one stage batch test at a liquid to solid ratio of lO 1/Kg with particle size below lO mm (without or with size reduction).

96 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 96 TEST DI CESSIONE PER IL TEST DI CONFORMITÀ l quattro test di cessione prevedono l'uso dell'acqua deionizzata e sono molto simili tra di loro. Le differenze riguardano il rapporto liscivante / solido (L / S) che è pari a 2 nel primo test e a 1O nel secondo e nel quarto, ed è costituito da due stadi sequenziali nel terzo. In questa sede tratteremo solo il 2 che è quello più utilizzato.

97 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 97 TEST DI CESSIONE PER IL TEST DI CONFORMITÀ La NORMA UNI EN Pezzatura del rifiuto Il materiale viene esaminato nello stato in cui è utilizzato o smaltito e comunque a pezzatura inferiore a 4 mm. La parte di campione con granulometria maggiore di 4 mm se è superiore a14 % viene macinata in un mulino a mascella o a martelli, dopo eventuale essicamento all'aria a temperatura non superiore a 40°C; in nessun caso il materiale deve essere finemente macinato

98 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 98 TEST DI CESSIONE PER IL TEST DI CONFORMITÀ Condizioni di prova e fase di liscivazione Durante l'esecuzione della prova, la temperatura deve essere intorno ai cc. 100±5 g di campione (rispetto alla massa secca) vengono posti in un recipiente di dimensioni tale da avere il minimo spazio morto possibile (es. bottiglie da 1l di polietilene) e si aggiunge acqua in modo tale da ottenere un rapporto liquido I solido pari a 1O ± 2% I/Kg. Si agita per 24 ±0.5 ore utilizzando dispositivi che prevedono la rotazione della bottiglia sull'asse verticale

99 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 99 TEST DI CESSIONE PER IL TEST DI CONFORMITÀ Fase di separazione liquido /solido Si lascia decantare la sospensione per 15 ± 5 min e si filtra l'eluato su una membrana filtrante da 0.45 µm di 47 mm di diametro sotto vuoto o a pressione, senza risciacquare il filtro. Se la filtrazione non risulta possibile in meno di un' ora con una velocità di flusso di almeno 30 ml/ cm 2 ora, si deve adottare una procedura di separazione liquido-solido alternativa che andrà poi descritta nel rapporto di prova. Se per le caratterizzazioni analitiche serve una quantità di eluato inferiore al totale filtrabile, è possibile evitare di separare tutto l'eluato.

100 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 100 TEST DI CESSIONE PER IL TEST DI CONFORMITÀ

101 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 101 DETERMINAZIONE DEGLI ANALITI NEGLI ELUATI Gli eluati vengono determinati per il loro contenuto totale utilizzando, per i metalli, la tecnica della spettrofometria per assorbimento atomico. Dalla misura del segnale di assorbanza, alla specifica lunghezza donda, si ricava la concentrazione mediante confronto con una curva di calibrazione ottenuta con soluzioni a concentrazioni note comprese nel campo di indagine analitica.

102 Gianfranco Blasi - Arpalazio Rieti 102 DETERMINAZIONE DEGLI ANALITI NEGLI ELUATI Tabella metodi di prova unificati


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