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In-line Tissue Engineering approach Biella 5 giugno 2009 Fabrizio Raimondi – Stefano Pagnutti.

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Presentazione sul tema: "In-line Tissue Engineering approach Biella 5 giugno 2009 Fabrizio Raimondi – Stefano Pagnutti."— Transcript della presentazione:

1 In-line Tissue Engineering approach Biella 5 giugno 2009 Fabrizio Raimondi – Stefano Pagnutti

2 La perdita o linsufficienza funzionale di un tessuto o di un organo rappresentano uno dei problemi più invalidanti, frequenti e costosi nellambito della sanità. Il problema non è esclusivamente limitato alla mancanza di organi in toto - fegato, rene, cuore, pancreas - ma coinvolge anche deficit tissutali localizzati e limitati a parti di non vitale importanza che comunque determinano una scarsa qualità della vita.

3 Mentre la perdita di un organo viene necessariamente compensata con un trapianto, nel caso di perdite di sostanza il chirurgo deve ingegnarsi su come ricostruire, utilizzando i tessuti residui o con ciò che viene messo a disposizione dalle industrie dei biomateriali, la struttura e la funzione dei tessuti danneggiati.

4 PASSATO Biomateriali improvvisati e tentativi di riparazione sono antichi come il desiderio e la necessità delluomo di sostituire parti del corpo difettose per migliorare la qualità della vita.

5 NASCE LA MEDICINA Papiro di Edwin Smith (1850) 48 casi clinici: 27 traumi cranici; 6 lesioni della gola e del capo; 2 della clavicola; 3 delle braccia; 8 dello sterno; 1 della spalla; 1 della colonna vertebrale a.C. The Edwin Smith Surgical Papyrus Lungo 4.68 metri e largo 33 cm, fu scritto sulla base di testi più antichi di circa 1000 anni 2600 a.C. Sacerdote, ufficiale, costruttore e architetto visse alla corte del faraone Djoser (III Dinastia). Quasi universalmente riconosciuto come il Padre della Medicina Alluce in cuoio e legno Sacerdotessa di Tebe (1.000 a.C.) (Museo del Cairo) Chiodo di 23 cm in ferro inserito nel ginocchio. Mummia di Usermontu ( a. C.) (Museo di San Josè, CA)

6 Canino legato con filo dìoro a due incisivi (Cairo) Incisivo artificiale (tomba etrusca) Protesi dentaria dei Fenici costituita da conchiglie legate con filo doro (V-VI sec. a.C.) LE PRIME PROTESI Mandibola trovata in Honduras nel 1931, presenta tre frammenti di conchiglia in luogo degli incisivi inferiori. Databile intorno al 600 d.C.

7 MIRACOLI El milagro de Calanda Atti notarili e processuali testimoniano lo strano reimpianto di gamba di Miguel Juan Pellicer nel 1640 a Calanda (Bassa Aragona, Spagna) I santi Cosma e Damiano attorno al 300 avrebbero attaccato la gamba di un moro ad un cristiano.

8 Nel 1668 il medico olandese Job Van Meekeren esegue il primo innesto osseo eterologo innestando un frammento di cranio di cane in un difetto craniale di un soldato rimasto ferito. Il soldato venne scomunicato. Per questo chiese di farsi togliere linnesto, ma non fu possibile perché risultò completamente integrato. (De Boer 1988) IL PRIMO INNESTO ETEROLOGO

9 Antoni Van LeeuwenhoeK nel 1674 descrive per la prima volta la struttura ossea relativamente a quelli che saranno poi chiamati canali Haversiani. Si cominciano ad evidenziare concetti come callo osseo, impianto e riassorbimento. Nel 1743 Duhamel pubblica i risultati dei suoi esperimenti su animale dove suggerisce il ruolo importante del periostio nella neo-osteogenesi. (De Boer 1988, Glicenstein 2000) LA STRUTTURA DELLOSSO

10 INNESTO AUTOLOGO E OMOLOGO Leopold Ollier studia il fenomeno della rigenerazione ossea e pubblica nel 1861 il traité de la régénération des os documento in cui compare per la prima volta il termine greffe osseuse: innesto osseo Il primo innesto autologo Germania 1820: Philips Von Walter chiude il foro a seguito della trapanazione del cranio, con la bratta precedentemente asportata. Il chirurgo scozzese William Mac Ewen nel 1880 innesta un segmento di tibia da donatore in un difetto omerale di un ragazzo.

11 PRESENTE E FUTURO… PROSSIMO Riparazione o sostituzione di organi e di tessuti rimossi Riparare Rigenerare Ripristino di strutture Attività biochimica Proprietà biomeccaniche Funzione

12 Lingegneria dei tessuti è un campo multidisciplinare in cui si fondono biologia cellulare, ingegneria, scienza dei materiali e chirurgia, allo scopo di costruire nuovi tessuti funzionali, mediante la combinazione di: TISSUE ENGINEERING Scaffold Cellule autologhe Fattori di crescita Ingegneria Tissutale Applicazione clinica

13 Solo scaffold Scaffold + cellule Scaffold + fattori di crescita Scaffold + cellule + fattori di crescita Biomaterials Research Group 2004 host tissue scaffold …the science of persuading the body to regenerate or repair tissues that fail to regenerate or heal spontaneously C. M. Agrawal SEMPLICEMENTE

14 Invasione di vasi sanguigni Cellule aderiscono, proliferano e differenziano Richiamo e penetrazione cellulare Cellule sintetizzano e depositano matrice extracellulare (ECM) Coagulo ematico Adesione di proteine, GFs,… Cellule al centro MUOIONO Fallimento dello scaffold Pori riempiti di ECM Nutrienti bloccati, cataboliti intrappolati Scaffold impiantato osso ? BASTA IL SOLO SCAFFOLD?

15 SOLO piccoli difetti < 2-3mm Tessuto osseo danneggiato Scaffold Cellule Fattori di crescita TissueEngineering alternativa

16 In-line TISSUE ENGINEERING TissueEngineering Utilizzare i requisiti e i principi dellingegneria tissutale, direttamente in sala operatoria

17 Necessità di un BIOMATERIALE Necessità di un BIOMATERIALE Fornisce unimpalcatura tri-dimensionale per lo sviluppo delle linee cellulari e la deposizione di matrice extracellulareFornisce unimpalcatura tri-dimensionale per lo sviluppo delle linee cellulari e la deposizione di matrice extracellulare Svolge unimportante funzione di interazione biologica: comunicazione e scambio di segnali con il tessuto circostanteSvolge unimportante funzione di interazione biologica: comunicazione e scambio di segnali con il tessuto circostante Controllo della struttura e della funzione del tessuto ingegnerizzato 1. LO SCAFFOLD

18 biocompatibile favorire - adesione - migrazione - proliferazione - differenziamento cellulare - sintesi di matrice extracellulare (ECM) - invasione vascolare biodegradabile BIOMATERIALE IDEALE

19 La capacità di una cellula di riconoscere ed interagire con il substrato rappresenta il primo indispensabile passo, senza il quale processi come proliferazione, migrazione e differenziamento cellulare non sarebbero possibili. Nella progettazione di materiali per lingegneria dei tessuti, la comprensione dei meccanismi che regolano tale interazione sono di fondamentale importanza. INTERAZIONE CELLULA-BIOMATERIALE

20 Uno dei requisiti fondamentali di un biomateriale per lingegneria dei tessuti è la capacità di promuovere efficientemente ladesione delle cellule da cui verrà colonizzato. Tale adesione prevede una fase precoce in cui la cellula riconosce il substrato. Ladesione cellulare ad un biomateriale avviene tramite un meccanismo specifico, mediato da proteine di membrana dette integrine. RICONOSCIMENTO E ADESIONE

21 Le integrine trasmettono il segnale dalla superficie cellulare alla fitta rete di filamenti citoscheletrici che costituiscono limpalcatura della cellula. Dallinterazione delle integrine con la matrice si originano cascate di segnali che determinano la riorganizzazione del citoscheletro di actina ed il cambiamento della morfologia cellulare. La cellula, allinizio tondeggiante (a), assume una forma distesa (b).

22 Innesto omologo Innesto eterologo Innesto di sintesi Sicurezza Aspetti medico-legali Biocompatibilità Immunogenicità Qualità Porosità Degradabilità QUALE SCAFFOLD SCEGLIERE

23 Gli innesti eterologhi prodotti da Bioteck con un sistema esclusivo di deantigenazione enzimatica a 37° C sono sicuri, totalmente biocompatibili e con la componente collagenica preservata PURA MATRICE BIOLOGICA

24 Un sistema di demineralizzazione parziale, consente inoltre di avere innesti dalle caratteristiche di flessibilità e plasticità uniche. La demineralizzazione espone maggiormente la matrice collagene esaltandone così le caratteristiche biologiche. INNESTI FLEX

25 Fattori di crescita (growth factors, GFs): sono polipeptidi che agiscono legandosi generalmente a recettori ad attività tirosina-chinasica, inducendo una gamma complessa di risposte che influenzano il destino della cellula bersaglio. Possono avere un ruolo mitogenico (ad es. bFGF sui condrociti) oppure trofico-differenziativo (ad es. BMP-1 sulle cellule mesenchimali e pre-osteoblasti). 2. I FATTORI DI CRESCITA

26 Autologhi Piastrinici PDGF; TGF-ß1, ß 2; IGF I-II; EGF; FGF ; VEGF Omologhi innesti a base di DBM/BMP Eterologhi E.M.D – Emdogain® Gel BIORA Colloss ® ; Targobone ® Biomet Biologics. Ricombinanti rhPDGF Regranex ® J&J rhBMP7 Osigraft ® Stryker Biotech rhBMP2 InductOs ® Medtronic COSA OFFRE IL MERCATO

27 v Staminali (nellembrione e tessuti adulti) v Differenziate (nei tessuti adulti) 3. LA COMPONENTE CELLULARE

28 Le cellule staminali (stem cells, SC) sono cellule non specializzate a uno stadio precoce di sviluppo. Hanno la caratteristica di riprodursi a lungo senza differenziarsi (auto-rinnovamento) e di dare origine a cellule progenitrici dalle quali derivano linee cellulari differenziate (muscolari, ematiche, nervose, ecc...). Possono dividersi e differenziarsi in un largo numero di tipi cellulari che producono i tessuti e gli organi del corpo. CELLULE STAMINALI Le prospettive terapeutiche aperte dalle SC risultano straordinarie: un primo campo dapplicazione riguarderà la cura di molte patologie gravi (tumori, malattie ereditarie, malattie neuro-degenerative), un secondo campo dapplicazione riguarderà limpianto di SC per rigenerare cellule e tessuti evitando così i trapianti di organi e i problemi connessi di scarsità dei donatori e di rischio di rigetto per incompatibilità donatore/ricevente

29 Le cellule staminali sono cellule non specializzate in grado di dividersi dando origine contemporaneamente ad una cellula staminale (uguale alla cellula madre) ad una cellula precursore di una progenie cellulare che alla fine darà a sua volta origine a cellule terminalmente differenziate (mature). Tipi di CSDove si trovanoPotenzialità Cellule costituenti la morula Possono originare tutti i tessuti (formazione di un intero organismo):hanno la capacità di differenziarsi in tutte le linee cellulari necessarie a formare lembrione Nella massa cellulare contenuta allinterno della blastocisti Hanno la potenzialità differenziarsi in qualsivoglia cellula di un animale adulto, ma non di dare origine ad un embrione Allinterno di tessuti fetali e adulti differenziati (es. cordone ombelicale, midollo osseo, sangue, fegato, sistema nervoso) Si differenziano in specifici tipi cellulari (ad es. cellule mesenchimali). Hanno la proprietà di moltiplicarsi e mantenersi in coltura, ma sono prive della capacità di rinnovarsi in modo illimitato Allinterno di tessuti adulti differenziati – cellule tessuto- specifiche (es. nellintestino) Possono dar luogo soltanto ad un tipo cellulare Staminali embrionali embrionali Totipotenti Staminali fetali / adulte Unipotenti Pluripotenti Multipotenti Staminaliadulte

30 Presenti nei tessuti adulti Cellule multipotenti che possono essere influenzate dai fattori di crescita (GFs) per differenziare in varie tipologie cellulari mature Ad es. cellule staminali mesenchimali (MSCs) presenti nello stroma del midollo osseo CELLULE STAMINALI ADULTE

31 cellule progenitrici staminali Il midollo osseo è attualmente considerato la fonte più abbondante e facilmente disponibile di cellule progenitrici staminali aventi la capacità di auto-rinnovarsi, proliferare, migrare e differenziare in varie tipologie cellulari mature. In aggiunta alle cellule staminali ematopoietiche, il midollo osseo contiene cellule staminali non-emopoietiche mesenchimali e endoteliali, che costituiscono tre compartimenti staminali altamente integrati tra loro. CELLULE STAMINALI NEL MIDOLLO OSSEO

32 MSCs: CONCENTRAZIONE MIDOLLARE FISIOLOGICA In condizioni fisiologiche, il midollo osseo di un uomo adulto contiene mediamente 1 MSC / cellule midollari. Questo numero è strettamente correlato alletà: Caplan AI. Review: mesenchymal stem cells: cell-based reconstructive therapy in orthopedics. Tissue Eng Jul-Aug;11(7-8): Review

33 MSCs: CONCENTRAZIONE EFFICACE MINIMA Muschler GF, Matsukura Y, Nitto H, Boehm CA, Valdevit AD, Kambic HE, Davrs WJ, Easley KA, Powell KA. Selective retention of bone marrow-derived cells to enhance spinal fusion. Clin Orthop Relat Res Mar;(432): Ph. Hernigou, MD, A. Poignard, MD, F. Beaujean, MD and H. Rouard, MD. Percutaneous Autologous Bone-Marrow Grafting for Nonunions. Influence of the Number and Concentration of Progenitor Cells. The Journal of Bone and Joint Surgery (American). 2005;87: E stato dimostrato da vari autori che il midollo osseo in toto contiene una quantità di cellule osteoprogenitrici non sufficiente per garantire una rigenerazione ossea efficace. Per avere un adeguato stimolo osteogenico occorre concentrare il midollo 3-4X. OK 3-4X

34 AUMENTARE LA CONCENTRAZIONE DI MSCs Il sistema più efficace per concentrare e quindi aumentare il rapporto volume/quantità di MSCs dellaspirato midollare: CENTRIFUGAZIONE

35 SISTEMA DI CONCENTRAZIONE Porta ad una elevata concentrazione di cellule midollari in sospensione, quindi iniettabili

36 IL SISTEMA MARROW STIM Prima Dopo Studi hanno dimostrato che la maggior concentrazione di cellule si ottiene aspirando 2 ml di midollo per sito di prelievo. Aspiration to obtain osteoblast progenitor cells from human bone marrow: the influence of aspiration volume. (Muschler GF, Boem C, Easley K J. Bone Joint Surg. Am. 79: )

37 VALORI DI CONCENTRAZIONE 80% - Recupero della frazione totale di Cellule Nucleate (TNC) 6,7x - Concentrazione di TNC rispetto a quella fisiologica 66% - Recupero della frazione totale di Cellule Mononucleate (MNC) 6,1x - Concentrazione di MNC

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39 GRAZIE


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