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Copyright © 2006 Zanichelli editore INGEGNERIA GENETICA La tecnologia del DNA ricombinante BIOLOGIA LEZIONE N. 3A slide n. 52 IV Liceo SCIENZE APPLICATE.

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1 Copyright © 2006 Zanichelli editore INGEGNERIA GENETICA La tecnologia del DNA ricombinante BIOLOGIA LEZIONE N. 3A slide n. 52 IV Liceo SCIENZE APPLICATE Prof. Fabrizio CARMIGNANI IISS Mattei – Rosignano S. (LI)

2 INGEGNERIA GENETICA BIOTECNOLOGIE AVANZATE

3 Con il termine generico di INGEGNERIA GENETICA (più propriamente tecnologie del DNA ricombinante) si fa riferimento ad un insieme molto eterogeneo di tecniche (BIOTECNOLOGIE AVANZATE) che permettono di: 1. isolare geni 2. clonarli (produrre copie identiche) 3. introdurli ed esprimerli in un ospite eterologo (differente dall'ospite originale) Queste tecniche permettono di conferire caratteristiche nuove alle cellule riceventi; le cellule così prodotte sono chiamate ricombinanti L'INGEGNERIA GENETICA permette anche di alterare la sequenza del gene originale e di produrne uno più adatto a rispondere ad esigenze specifiche, come avviene ad esempio per quanto riguarda gli OGM

4 Per manipolare i geni in laboratorio i biologi usano spesso i PLASMIDI batterici, che possono portare a duplicare allinterno di un batterio qualsiasi gene Per manipolare i geni in laboratorio i biologi usano spesso i PLASMIDI batterici, che possono portare a duplicare allinterno di un batterio qualsiasi gene I PLASMIDI sono gli strumenti chiave della clonazione genica, ossia la produzione di molte copie identiche di tratti di DNA Queste tecniche fanno parte delle BIOTECNOLOGIE MODERNE (AVANZATE) BIOTECNOLOGIE MODERNE (AVANZATE) PLASMIDI: piccoli filamenti circolari di DNA del citoplasma e distinguibili dal cromosoma batterico per le loro dimensioni ridotte. Linformazione genetica contenuta permette all'organismo ospite di svolgere varie funzioni non essenziali (es. resistenza agli antibiotici). I plasmidi sono capaci di spostarsi tra le cellule batteriche (TRASFORMAZIONE) influendo sulla variabilità genetica

5 Quindi mediante lintroduzione dei PLASMIDI si possono modificare i batteri ed indurli a svolgere funzioni che portano alla produzione di prodotti a noi utili (BIOTECNOLOGIE) La maggior parte dei metodi utilizzati per studiare e manipolare il DNA utilizza i batteri ed in particolare il bacillo: Escherichia coli EPISOMA: plasmide in grado d'integrarsi nel DNA dell'organismo ospite. Può rimanere integro per molto tempo, venire duplicato da ogni divisione dell'ospite, e diventare parte integrante del suo corredo genetico I ricercatori possono inserire in un PLASMIDE un pezzo di DNA contenente un gene dando origine a DNA ricombinante Il plasmide viene poi introdotto nella cellula batterica ed il batterio geneticamente modificato è messo in coltura dove si riproduce per formare un clone di cellule (gruppo di cellule identiche alla cellula madre da cui derivano). Ogni cellula possiede una copia del gene

6 La TECNOLOGIA del DNA RICOMBINANTE

7 Per «tagliare e incollare» il DNA si utilizzano particolari enzimi Gli strumenti per ottenere DNA ricombinante sono: enzimi batterici chiamati ENZIMI di RESTRIZIONE che riconoscono brevi sequenze di nucleotidi del DNA e le tagliano in punti precisi enzimi batterici chiamati ENZIMI di RESTRIZIONE che riconoscono brevi sequenze di nucleotidi del DNA e le tagliano in punti precisi enzima DNA-ligasi che incolla le estremità dei filamenti di DNA catalizzando la formazione di legami covalenti enzima DNA-ligasi che incolla le estremità dei filamenti di DNA catalizzando la formazione di legami covalenti Nei batteri sono presenti degli enzimi che tagliano le molecole estranee di DNA in piccoli segmenti che vengono duplicato o trascritti (in tal modo i batteri risultano immuni a particolari virus). Questi enzimi vengono chiamati ENZIMI di RESTRIZIONE

8 BATTERIO Cromosomabatterico PLASMIDE 2 Cellula contenente il gene prescelto DNA Gene prescelto DNA RICOMBINANTE (plasmide) Batterioricombinante Copie di proteine Copie di geni Clone della cellula Il gene per la resistenza alle malattie è inserito nelle piante Il gene modifica i batteri e li rende in grado di eliminare i rifiuti tossici La proteina viene usata per sciogliere i coaguli nella terapia contro gli infarti La proteina consente alla neve di formarsi anche a temperature maggiori Si isola un plasmide 1 Si isola il DNA 2 Si inserisce un gene nel plasmide 3 Si introduce il plasmide nella cellula prescelta 4 Si clona la cellula che possiede il gene prescelto 5 La TECNOLOGIA del DNA RICOMBINANTE

9 Produzione di DNA ricombinante tramite luso di enzimi di restrizione e dellenzima DNA-ligasi Esistono molti ENZIMI di RESTRIZIONE che tagliano il DNA in punti precisi, secondo sequenze di basi PALINDROME (uguali in tutti e 2 i sensi) LENZIMA di RESTRIZIONE riconosce la sequenza (PALINDROMA) G A A T T C C T T A A G DNA 3 C T T A A A AT TC G G A AT T C C T TA A G G A AT T C C T TA A G Enzima DNA-LIGASI incolla i frammenti Enzima di restrizione taglia il DNA in frammenti DNA ricombinante G G Estremitàcoesiva G C T T A A Aggiunta di un frammento di DNA di provenienza estranea Due frammenti si attaccano tra loro appaiando le basi azotate 5

10 I geni dei plasmidi ricombinanti si possono clonare I plasmidi entrano nei batteri per TRASFORMAZIONE I batteri, con i plasmidi ricombinanti, sono messi in condizione di riprodursi, dando origine a un clone di cellule con molte copie dei plasmidi e dei geni che trasportano

11 E.coli PLASMIDE DNA Gene V Estremità coesive coesive Gene V Batterioricombinante Cellula umana Plasmide con DNA ricombinante Clone batterico in possesso di molte copie del GENE UMANO CLONAZIONE di un GENE in un PLASMIDE BATTERICO Si isola il DNA da due fonti diverse 1 Si tagliano entrambi i DNA con un enzima di restrizione 2 Si mescolano le molecole di DNA che si uniscono mediante appaiamento di basi azotate 3 Si aggiunge DNA-ligasi per attaccare il DNA con legami covalenti 4 Si clona il batterio 6 Si inserisce il plasmide in un batterio tramite trasformazione 5

12 I geni clonati possono essere conservati in «librerie» genomiche Lintera collezione di tratti di DNA clonati tramite shotgun, derivanti dalla frammentazione di tutto il genoma di una cellula, è chiamata LIBRERIA GENOMICA Plasmidericombinante Genoma tagliato con lenzima di restrizione con lenzima di restrizione DNA fagico ricombinante oppure Clonebatterico Clonefagico Libreria fagica Libreria plasmidica

13 Cellule e organismi ricombinanti sono utilizzati per ottenere prodotti genici su larga scala Le applicazioni della clonazione genica includono la produzione di prodotti genici su larga scala per usi medici e altri usi Le applicazioni della clonazione genica includono la produzione di prodotti genici su larga scala per usi medici e altri usi I BATTERI si sono spesso dimostrati gli organismi migliori per sintetizzare un prodotto proteico I BATTERI si sono spesso dimostrati gli organismi migliori per sintetizzare un prodotto proteico Alcune volte è preferibile o necessario utilizzare le cellule eucariotiche di LIEVITI e MAMMIFERI Alcune volte è preferibile o necessario utilizzare le cellule eucariotiche di LIEVITI e MAMMIFERI TECNICHE di INGEGNERIA GENETICA PARTICOLARI

14 PCR Polymerase Chain Reaction Reazione a catena della POLIMERASI

15 Quando il campione di DNA è scarso o impuro, la reazione a catena della polimerasi: Polymerase Chain Reaction (PCR) è un metodo più appropriato per ottenere un grande quantitativo di un particolare gene Per ottenere molte copie di una specifica sequenza di DNA si utilizza comunemente la tecnica della PCR (reazione a catena della polimerasi) 1 Numero di molecole di DNA Molecola iniziale di DNA 2 4 8

16 TRASCRITTASI INVERSA

17 Si può produrre DNA da clonare anche mediante lenzima TRASCRITTASI INVERSA, tipico di particolari VIRUS (RETROVIRUS) come quello dellAIDS: virus HIV

18 Lenzima TRASCRITTASI INVERSA può essere usato per ottenere librerie di DNA complementare (c-DNA) contenenti solo i geni espressi da un particolare tipo di cellula La trascrittasi inversa è un tipo di DNA polimerasi molto particolare, presente soltanto nei retrovirus (es.HIV) Ha la capacitàù di sintetizzare il DNA partendo dal filamento di RNA. La scoperta di questo enzima, in grado di copiare l'informazione genetica dall'RNA al DNA sconvolse quello che fino ad allora era visto come il dogma centrale della biologia molecolare, derivato da Francis Crick, uno degli scopritori della struttura del DNA, il quale prevedeva che l'informazione genetica fluisse dal DNA all'RNA alle proteine e non viceversa. La trascrittasi inversa ha un errore di incorporazione (cioè, accoppia la base sbagliata rispetto a quella presente nel filamento stampo) piuttosto alto, in media di circa 1 ogni 2000 basi ed è la causa dell'elevato tasso di mutazione dei retrovirus che impedisce la creazione di un vaccino o di un farmaco in grado di eliminare tali virus. Poiché questo enzima è quasi esclusivamente presente in virus patogeni anche per l'uomo quali l'HIV, esso viene utilizzato come bersaglio per la terapia medica. Uno dei farmaci inibitori della trascrittasi più famosi è l'AZT (azidotimidina).

19 RICERCA BIOMEDICA e INDUSTRIA FARMACEUTICA

20 La tecnologia del DNA sta cambiando lindustria farmaceutica e la ricerca biomedica La tecnologia del DNA ha avuto un enorme impatto sullindustria farmaceutica e sulla medicina umana Le sue tecniche sono ampiamente utilizzate per produrre farmaci e per la diagnosi delle malattie RICERCA BIOMEDICA e INDUSTRIA FARMACEUTICA

21 Linsulina e lormone della crescita umani sono stati i primi prodotti farmaceutici ottenuti con luso della tecnologia del DNA ricombinante Prima del 1982, le principali fonti di insulina erano i tessuti di suini e bovini prelevati nelle macellerie TERAPIE ORMONALI L'insulina è un ormone proteico dalle proprietà anaboliche, prodotto dalle cellule beta delle isole di Langerhans all'interno del pancreas; è formata da due catene unite da due ponti solfuro: catena A di 21 aminoacidi e catena B di 30 aminoacidi. La sua funzione più nota è quella di regolatore dei livelli di glucosio ematico riducendo la glicemia mediante l'attivazione di diversi processi metabolici e cellulari.

22 In campo medico la tecnologia del DNA sarà, probabilmente, sempre più usata per diagnosticare le malattie Oltre alla sua evidente importanza nellidentificazione degli alleli associati alle malattie genetiche, si rivela infatti utile nel localizzare le infezioni DIAGNOSI e CURA MALATTIE

23 Grazie alla tecnologia del DNA i ricercatori sono in grado si sintetizzare anche nuovi VACCINI Un vaccino è una variante o un derivato innocuo di un agente patogeno (di solito un batterio o un virus) ed è utilizzato per prevenire una malattia infettiva VACCINI

24 Analisi dei frammenti di restrizione Le impronte genetiche

25 Le sonde molecolari identificano i cloni che portano determinati geni La tecnologia del DNA può essere usata per identificare specifici frammenti di DNA I metodi utilizzati per individuare direttamente un gene si basano tutti sullaccoppiamento tra le basi azotate del gene in questione e quelle di una sequenza complementare appartenente a unaltra molecola di acido nucleico (DNA o RNA) SONDE MOLECOLARI

26 Per trovare una specifica sequenza nucleotidica allinterno di un certo quantitativo di DNA si usa una molecola chiamata sonda. Le sonde di acidi nucleici sono brevi filamenti singoli di DNA o RNA marcati radioattivamente o fluorescente che possono legarsi a un determinato gene in una libreria Sonda radioattiva (DNA) DNA a filamento singolo La sonda viene mescolata col DNA a filamento singolo prelevato da vari cloni batterici o fagici Mediante lappaiamento delle basi azotate si individua il gene prescelto A T C C G A A T G C G C T T A T C G A G C C T T A T G C A T A T C C G A A G G T A G G C T A A

27 I microarray a DNA forniscono contemporaneamente informazioni sullespressione di molti geni Per effettuare analisi su larga scala, per determinare quali geni sono attivi in una particolare cellula in un dato momento, si può usare la tecnica che impiega i microarray a DNA. Il microarray a DNA è un vetrino rettangolare, non più grande dellimpronta di un pollice, contenente uno strato di molecole a filamento singolo di DNA, che portano migliaia di geni noti e diversi. Microarray a DNA

28 1 LmRNA viene isolato Mediante la trascrittasi inversa si ottengono tratti di DNA fluorescenti 2 DallmRNA viene ottenuto cDNA 4Il cDNA non legato viene allontanato 3 Il cDNA viene applicato ai pozzetti Microarray a DNA Ogni pozzetto contiene il DNA di un gene particolare Dimensioni effettive (6400 geni) Punto non fluorescente Punto fluorescente cDNA DNA di un gene espresso DNA di un gene non espresso Un MICROARRAY a DNA

29 Lelettroforesi su gel separa i frammenti di DNA in base alle loro dimensioni ++ Generatoreelettrico Gel Miscela di molecole di DNA di dimensioni diverse Molecole più lunghe Disposizione finale - + ELETTROFORESI Molecole più corte

30 Il polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione permette di individuare le differenze tra sequenze di DNA I marcatori genetici comprendono geni, siti di restrizione e tratti di DNA non codificante Lanalisi dei frammenti di restrizione è un metodo per individuare le differenze nelle sequenze nucleotidiche tra campioni omologhi di DNA Il numero dei frammenti di restrizione e la loro lunghezza riflettono la sequenza specifica di nucleotidi nel DNA di partenza Sequenze di DNA

31 In che modo i frammenti di restrizione riflettono la sequenza del DNA Le differenze tra i frammenti di restrizione che vengono prodotte sono dette poliformismi della lunghezza dei frammenti di restrizione (Restriction Fragment Length Polymorphisms o RFLP) e riflettono le differenze nelle sequenze del DNA di partenza Allele I (scenacrimine) Allele II (indiziato) x y z Taglio Taglio DNA prelevato dai cromosomi C C G G G G C C A C G G T G C C C C G G G G C C C C G G G G C C Y W Taglio

32 – + Frammenti più lunghi x w y z y 1 Dopo il taglio con gli enzimi di restrizione, i frammenti vengono separati su un gel: Frammenti più corti 2

33 Per individuare gli alleli difettosi si possono usare le sonde a DNA Unimportante applicazione dellanalisi dei frammenti di restrizione consiste nellindividuare ALLELI con alterazioni correlabili a patologie genetiche non manifeste Le sonde radioattive possono rivelare bande di DNA dinteresse su un gel SONDE di DNA

34 1 Preparazione dei frammenti di restrizione 2 Elettroforesi su gel 3 Assorbimento 4 Sonda radioattiva 5 Rilevamento della radioattività (autoradiografia) IIIIII IIIIII Frammenti di restrizione Carta da filtro Sonda Filamento singolo di DNA radioattivo (sonda) Pellicola I II III I II III Utilizzo dellanalisi dei frammenti di restrizione per individuare un allele dannoso:

35 Impieghi della tecnologia del DNA in campo legale La tecnologia del DNA viene ampiamente utilizzata in medicina legale per analizzare le prove rinvenute sulla scena di un crimine. Il test del DNA può consentire di individuare il responsabile con una certa sicurezza poiché la sequenza di basi azotate del DNA di ogni persona è unica (tranne nel caso dei gemelli identici) MEDICINA LEGALE

36 Sangue rinvenuto sui vestiti dellimputato Sanguevittima Unimpronta genetica, DNA fingerprint, può aiutare a risolvere in crimine: Sangueimputato

37 La GENOMICA

38 Il Progetto Genoma Umano Lo scopo primario del Progetto Genoma Umano (PGU) è mappare lintero genoma delluomo e determinare la sequenza nucleotidica completa del DNA umano. Iniziato nel 1990, è oggi largamente completato: nel 2001 sono stati pubblicati i risultati del sequenziamento di oltre il 90% del genoma umano. La GENOMICA

39 I dati ottenuti stanno fornendo informazioni su sviluppo, evoluzione e molte malattie I benefici che possono derivare dalla conoscenza del genoma umano riguardano essenzialmente la ricerca di base Lenorme numero di dati raccolti è depositati in un archivio accessibile in rete ai ricercatori di tutto il mondo

40 Un giorno la terapia genica potrebbe fornire la cura per molte malattie La terapia genica può correggere le malattie imputabili ad un singolo gene difettoso, sostituendolo o integrandolo con un allele normale Gene clonato (allele normale) 1 Inserimento del gene normale nel virus 2 Le cellule del midollo osseo vengono infettate con il virus 3 Il DNA virale si inserisce nei cromosomi 4 Le cellule vengono iniettate nel paziente Midollo osseo Cellule di midollo osseo del paziente Acido nucleico virale Retrovirus TERAPIA GENICA

41 La terapia genica potrebbe un giorno essere usata per curare sia le malattie genetiche, sia le malattie non genetiche. Anche se è uno strumento molto promettente, esistono ancora poche prove scientifiche evidenti della sua efficacia. La ricerca continua seguendo linee guida nuove e più sicure. La terapia genica sulluomo solleva problemi sia tecnici sia etici

42 La maggior parte del genoma umano non è costituito da geni Il genoma umano comprende circa geni che codificano per varie proteine ma anche per i t-RNA e gli r-RNA.Il genoma umano comprende circa geni che codificano per varie proteine ma anche per i t-RNA e gli r-RNA. Oltre a questi geni, come quello della maggior parte degli eucarioti complessi, il genoma umano include unenorme quantità di DNA non codificante (circa il 97% del totale)Oltre a questi geni, come quello della maggior parte degli eucarioti complessi, il genoma umano include unenorme quantità di DNA non codificante (circa il 97% del totale) Nella porzione di DNA non codificante sono comprese le sequenze regolatrici, come i promotori e gli enhancer Il restante DNA, che comprende gli introni, e il DNA non codificante localizzato tra i geni, è stato chiamato junk DNA, ossia «DNA spazzatura»

43 Grazie alla scienza della genomica sono stati sequenziati interni genomi Oltre a mappare il DNA umano, ricercatori di tutto il mondo stanno lavorando anche sui genomi di altre specieOltre a mappare il DNA umano, ricercatori di tutto il mondo stanno lavorando anche sui genomi di altre specie Alcuni genomi sono stati completamente sequenziatiAlcuni genomi sono stati completamente sequenziati La maggior parte dei genomi in corso di studio riguarda i procarioti, il gruppo include però anche una ventina di specie eucariotiche (tra cui vertebrati, invertebrati e piante)La maggior parte dei genomi in corso di studio riguarda i procarioti, il gruppo include però anche una ventina di specie eucariotiche (tra cui vertebrati, invertebrati e piante)

44 Ogni singolo genoma è interessante di per sé, ma è utile in particolare ai fini dellanalisi comparativa con il genoma umano, che gli scienziati stanno tentando di interpretare.

45 La PROTEOMICA è lo studio sistematico degli insiemi completi di proteine (proteomi) codificati dai genomi. Il numero delle proteine presenti negli organismi umani supera di gran lunga quello dei geni La PROTEOMICA

46 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI

47 Gli organismi geneticamente modificati stanno trasformando lagricoltura Gli scienziati che si occupano del fabbisogno alimentare mondiale hanno cominciato a usare la tecnologia del DNA ricombinante per produrre organismi geneticamente modificati (OGM), piante e animali, da utilizzare in agricoltura. Un organismo geneticamente modificato è un organismo ottenuto grazie alla modificazione o allaggiunta di uno o più geni Un OGM si può ottenere anche con i normali metodi di incrocio OGM – Organismi Geneticamente Modificati

48 Agrobacterium tumefaciens DNA contenente il gene prescelto il gene prescelto PlasmideTi 1 Inserimento del gene di un plasmide mediante lenzima di restrizione e la DNA-ligasi Plasmide Ti ricombinante 2Inserimento in cellule vegetali in coltura 3Crescita della pianta Pianta con caratteristiche nuove Il T DNA inserito porta il nuovo gene Cellula vegetale T DNA Sito di restrizione Utilizzo del plasmide Ti (un plasmide che proviene dal batterio del suolo Agrobacterium tumefaciens) come vettore per modificare geneticamente le piante:

49 I genetisti molecolari sono in grado di produrre animali transgenici che hanno, inseriti nel proprio genoma, geni provenienti da altri organismi Anche molte colture e piante sono geneticamente modificate

50 Gli organismi GM possono danneggiare lambiente o la salute umana? Lo sviluppo di organismi GM richiede severe misure di sicurezza

51 Gli organismi GM possono rappresentare un rischio per lambiente o la salute. Il maggior pericolo per lambiente potrebbe essere rappresentato dal trasferimento di geni modificati dalle colture GM alle colture vicine

52 FINE della LEZIONE N. 3A INGEGNERIA GENETICA - Il DNA ricombinante Grazie per lattenzione E ricordatevi……..!!!!! … Considerate la vostra semenza fatti non foste a viver come bruti ma per seguir virtute e canoscenza… DANTE ALIGHIERI La Divina Commedia, INFERNO, cantoXXVI, La Divina Commedia, INFERNO, canto XXVI, Prof. Fabrizio CARMIGNANI IISS Mattei – Rosignano S. (LI)


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