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1 Ciclo dellacido citrico. 2 Il metabolismo ossidativo dei carburanti metabolici I gruppi acetili derivati da carboidrati, amminoacidi e acidi grassi.

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Presentazione sul tema: "1 Ciclo dellacido citrico. 2 Il metabolismo ossidativo dei carburanti metabolici I gruppi acetili derivati da carboidrati, amminoacidi e acidi grassi."— Transcript della presentazione:

1 1 Ciclo dellacido citrico

2 2 Il metabolismo ossidativo dei carburanti metabolici I gruppi acetili derivati da carboidrati, amminoacidi e acidi grassi entrano nel ciclo dellacido citrico dove vengono ossidati a CO 2

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4 4 Il piruvato, derivato dal glucosio ad opera della glicolisi, viene ossidato formando acetil CoA e CO 2 per azione di 3 enzimi organizzati nel complesso della piruvato deidrogenasi, localizzato nei mitocondri delle cellule eucariotiche.

5 5 Reazione complessiva catalizzata dal complesso della piruvato deidrogenasi. In questa reazione sono coinvolti cinque coenzimi e tre enzimi.

6 6 Reazione complessiva catalizzata dal complesso della piruvato deidrogenasi: La decarbossilazione ossidativa processo di ossidazione irreversibile: il gruppo carbossilico viene rimosso dal piruvato sotto forma di una molecola di CO2, e i 2 atomi di carbonio che restano diventano il gruppo acetilico legato al CoA.

7 7 La deidrogenazione e la decarbossilazione del piruvato ad Acetil CoA coinvolgono lazione sequenziale di Ben 4 vitamine sono elementi essenziali di questo sistema: la tiamina per la TPP, la riboflavina per il FAD, la niacina per il NAD il pantotenato per il CoA 3 enzimi diversi: piruvato deidrogenasi (E1), diidrolipoil transacetilasi (E2) diidrolipoil deidrogenasi (E3). e di 5 gruppi prostetici o coenzimi: tiamina pirofosfato (TPP) FADCoANADlipoato.

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9 9 Organizzazione strutturale del complesso multienzimatico della piruvato deidrogenasi E 2 = diidrolipoil transacetilasi (24) E 1 = piruvato deidrogenasi (24) E 3 = diidrolipoil Deidrogenasi (12) Intero complesso (60 subunità)

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12 12 Regolazione del complesso multienzimatico lattivazione avviene ad opera di una fosfoproteina fosfatasi che defosforila il cmplesso attraverso una reazione Mg 2+ e Ca 2+ dipendente proteina chinasiLinattivazione del complesso si realizza per azione di una proteina chinasi Mg 2+- ATP-dipendente strettamente legata al complesso multienzimatico lacetil CoA e il NADH prodotti nella reazione inibiscono la forma defosforilata (attiva) dellenzima, ma stimolano la proteina chinasi, promuovendo linterconversione del complesso nella sua forma inattiva

13 13 il CoA libero inibisce la proteina chinasi e il NAD quando aumenta il rapporto NADH/NAD + mitocondriale o il rapporto acetil-CoA/CoA come avviene durante la - ossidazione degli acidi grassi, il complesso della piruvato deidrogenasi è inattivato per azione della chinasi il piruvato è un potente inibitore della proteina chinasi, quindi alti livelli di piruvato inibiscono la chinasi e attivano il complesso

14 14 Modificazione covalente della piruvato deidrogenasi negli eucarioti.

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17 17 Funzione principale del Ciclo è quella di generare equivalenti riducenti che sono utilizzati per produrre energia, cioè ATP, nel processo di trasporto degli elettroni-fosforilazione ossidativa

18 18 CICLO DELLACIDO CITRICO Il ciclo dellacido citirco ossida lacetil CoA, il prodotto comune della degradazione di: glucosio acidi grassi amminoacidi chetogenici a CO 2 e H 2 O con produzione di NADH e FADH 2 molti amminoacidi glucogenici possono essere ossidati attraverso il ciclo dellacido citrico grazie alla loro demolizione in uno dei suoi intermedi

19 19 Lattività degli enzimi dellacido citrico: citrato sintasi isocitrato deidrogenasi -chetoglutarato è controllata dalla disponibilità di substrato e dallinibizione a feedback da parte degli intermedi del ciclo

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21 21 1 a reazione: formazione di citrato lenzima citrato sintasi è inibito da elevate concentrazioni di NADH(H), ATP di succinil CoA e di acil-CoA che agiscono come effettori negativi il citrato a sua volta agisce come effettore negativo della fosfofruttochinasi-1

22 22 Lintermedio citril-CoA non viene rilasciato dallenzima durante la reazionee si ritiene che rimanga legato al sito catalitico della citrato sintasi la citrato sintasi è presente nella matrice mitocondriale ed ha un peso molecolare di

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24 24 2 a reazione: formazione di isocitrato la reazione aconitasica è fortemente inibita da fluoroacetato ( CH 2 -F- COO - ) un composto presente in certe piante del Sud Africa

25 25 Centro ferro-zolfo dellaconotasi La reazione dell aconitasi non richiede cofattori, essa richiede la partecipazione di ioni ferroso che gli vengono forniti dal centro ferro- zolfo che è un componente essenziale dell attività idratasica dellenzima

26 26 3 a reazione: decarbossilazione ssidativa dellisocitrato per formare a- chetoglutarato. Isocitrato deidrogenasi: NAD+ dip. (matrice mitocondriale, ciclo di Krebs) NADP+ dip.(citosol, reazioni anaboliche) peso molecolare di è costituita da 8 sub unità identiche è stimolata da ADP e in alcuni casi da AMP è inibita da ATPe NADH +

27 27 4a reazione: decarbossilazione ossidativa dell a-chetoglutarato in succinil-CoA e CO decarbossilazione ossidativa dell a-chetoglutarato in succinil-CoA e CO 2 questo complesso è identico a quello della piruvato deidrogenasi ma non è regolato da reazioni di fosforilazione e defosforilazione il complesso è inibito da ATP, GTP da NADH e succinil CoA sembra attivato da ioni calcio

28 28 La formazione di ATP o GTP a spese dellenergia rilasciata dalla decarbossilazione ossidativa dell a- chetoglutarato è un esempio di fosforilazione a livello del substrato Il GTP formato dalla succinil-CoA sintetasi può donare il suo gruppo fosforico terminale allADP per formare ATP, mediante lazione reversibile della nucleoside difosfato chinasi.

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30 30 Conversione del succinil-CoA a succinato5 a reazione: fase intermedia in cui la molecola dellenzima diventa fosforilata a livello di un suo residuo di His presente nel sito attivo fase intermedia in cui la molecola dellenzima diventa fosforilata a livello di un suo residuo di His presente nel sito attivo Il gruppo fosforico viene quindi trasferito allADP o al GTP per formare ATP e GTP E questa lunica reazione metabolica in cui il GTP è preferito all ATP Il gruppo fosforico viene quindi trasferito allADP o al GTP per formare ATP e GTP E questa lunica reazione metabolica in cui il GTP è preferito all ATP le cellule animali hanno 2 isozimi, uno per lADP e un altro per il GDP. le cellule animali hanno 2 isozimi, uno per lADP e un altro per il GDP.

31 31 Reazione della succinil CoA sintetasi Un gruppo fosforico sostituisce il CoA legato allenzima formando un fosfato ad alta energia Il succinil fosfato dona il gruppo fosforico a un residuodi His dellenzima formando un fosfoenzima ad alta energia Il gruppo fosforico viene trasferito dal residuo di His al gruppo fosforico terminale del GDP

32 32 6 a reazione: sintesi di fumarato la succinato deidrogenasi è fortementa inibita da malonato e ossalacetato è attivata da ATP, fosfato inorganico e succinato il malonato inibisce lenzima in modo competitivo, dovuto alla notevole somiglianza strutturale col succinato

33 33 è una flavoproteina che è inserita a differenza degli altri enzimi, nelle membrana mitocondriale interna favorendo il trasferimento diretto degli elettroni alla catena respiratoria è costituito da due subunità di e m.w. rispettivamente La succinato deidrogenasi la prima contiene il sito di legame per il substrato, il FAD legato alla lisina e 4 atomi di ferro + 4 atomi di zolfo la seconda contiene solo ferro e zolfo

34 34 7 a reazione: idratazione del fumarato per produrre malato la fumarasi è un tetramero con M.W. Di

35 35 Ultima reazione: ossidazione del malato a ossalacetato in questa reazione con lossidazione del malato ad ossalacetato si rigenera il prodotto di partenza che così può riprendere il ciclo lossalacetato può essere convertito anche in fosfoenol-piruvato o transaminato ad aspartato

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39 39 Le reazioni anaplerotiche riforniscono il ciclo di Krebs di intermedi. In condizioni normali, esiste un bilanciamento quasi perfetto tra le reazioni che rimuovono intermedi dal ciclo e quelle che invece lo riforniscono, e quindi la concentrazione di questi composti resta costante.

40 40 CARENZA DI PIRUVATO DEIDROGENASI Deficienze dei differenti componenti catalitici o subunità regolatrici lattato, piruvato e alanina gravi danni neurologici I bambini con questo deficit presentano alti livelli di lattato, piruvato e alanina che causano acidosi lattica cronica.. Presentano inoltre gravi danni neurologici. In molti casi questa carenza comporta la morte dellindividuo fibroblasti La diagnosi viene fatta saggiando il complesso enzimatico e/o le sue subunità enzimatiche in colture di fibroblasti di pelle prelevata dal paziente regime dieteticoIn alcuni casi i pazienti rispondono a un regime dietetico di tipo chetogenico con bassi livelli di carboidrati

41 41 DEFICIT DI FUMARASI fumarasimitocondriale citosolico Il deficit di enzimi del ciclo degli acidi ticarbossilici è raro, tuttavia sono stati riportati alcuni casi in cui è presente un grave deficit di fumarasi sia a livello mitocondriale che citosolico danno neurologicoencefalopatia distonia È presente un grave danno neurologico con encefalopatia e distonia che si manifestano precocementa dopo la nascita fumarato succinato, -chetoglutarato citratomalato Le urine contengono quantità anomale di fumarato e di una o più delle seguenti sostanze : succinato, -chetoglutarato, citrato e malato livelli di attività enzimatica dimezzati autosomica recessiva Entrambi i genitori presentano livelli di attività enzimatica dimezzati rispetto al normale come si verifica nei disordini su base autosomica recessiva

42 42 Una molecola di glucosio può potenzialmente promuovere la sintesi di circa 38 ATP in condizioni di aerobiosi, cioè quando funziona il ciclo dell' acido citrico.

43 43 Lenergia liberata dalle reazioni dellintero processo viene conservata sotto forma di energia chimica mediante la formazione di un ATP o di un GTP e per riduzione di 3 NAD + e di un FAD +. Lenergia liberata dalle ossidazioni viene efficacemente conservata nel ciclo

44 44 Il ciclo dellacido citrico produce di per sé una sola molecola di ATP per giro (nella conversione del succinil-CoA a succinato). Nelle 4 reazioni di ossidazione presenti nel ciclo viene prodotto un grande flusso di elettroni che entrano nella catena respiratoria, portando alla formazione di un gran numero di molecole di ATP nella fosforilazione ossidativa

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46 46 Nella fosforilazione ossidativa il passaggio di 2 elettroni dal NADH allossigeno porta alla formazione di circa 2.5 molecole di ATP Il passaggio di 2 elettroni dal FADH 2 allossigeno ne forma circa 1.5. Il passaggio di 2 elettroni dal FADH 2 allossigeno ne forma circa 1.5. Questa stechiometria ci permette di calcolare il numero totale di ATP dalla ossidazione completa del glucosio. Questa stechiometria ci permette di calcolare il numero totale di ATP dalla ossidazione completa del glucosio.

47 47 Quando le 2 molecole di piruvato sono ossidate completamente a 6 molecole di CO 2 dalle reazioni del complesso della piruvato deidrogenasi e del ciclo dellacido citrico e gli elettroni vengono trasferiti allO 2 dalla catena respiratoria, si ottengono tramite la fosforilazione ossidativa ben 32 molecole di ATP per molecola di glucosio si ottengono tramite la fosforilazione ossidativa ben 32 molecole di ATP per molecola di glucosio

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49 49 Questo processo ciclico a 8 tappe necessario per ossidare a CO 2 il semplice gruppo acetilico a 2 atomi di carbonio può sembrare una complicazione inutile e soprattutto non in linea con il principio della massima economia della logica molecolare delle cellule. La funzione del ciclo di Krebs non è però esclusivamente quella di ossidare lacetato; questa via infatti è il cuore del metabolismo intermedio.

50 50 I prodotti finali a 4 o 5 atomi di carbonio di molti processi catabolici entrano nel ciclo e possono servire come sostanze nutrienti. Per esempio, lossalacetato e la-chetoglutarato si formano rispettivamente dallaspartato e dal glutammato quando vengono degradate le proteine introdotte nellorganismo con la dieta. Per esempio, lossalacetato e la-chetoglutarato si formano rispettivamente dallaspartato e dal glutammato quando vengono degradate le proteine introdotte nellorganismo con la dieta. In alcune situazioni, dal ciclo possono essere prelevati intermedi per usarli come precursori in una varietà di vie biosintetiche. In alcune situazioni, dal ciclo possono essere prelevati intermedi per usarli come precursori in una varietà di vie biosintetiche.

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52 52 Negli organismi aerobici, il ciclo dellacido citrico è una via anfibolica (serve sia ai processi anabolici sia a quelli catabolici). Non soltanto agisce nel catabolismo dei carboidrati, degli acidi grassi e degli aminoacidi, ma produce anche precursori per molte vie biosintetiche a-chetoglutarato = aspartato (prodotto per transamminazione) ossalacetato = glutammato (prodotto per transamminazione).

53 53 Attraverso laspartato e il glutammato, gli atomi di carbonio dellossalacetato e della-chetoglutarato vengono usati per costruire altri aminoacidi, come pure i nucleotidi purinici e pirimidinici. Lossalacetato viene convertito in glucosio nel processo della gluconeogenesi. Il succinil-CoA è un intermedio fondamentale nella biosintesi delleme.

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55 55 Le reazioni anaplerotiche riforniscono il ciclo di Krebs di intermedi. In condizioni normali, esiste un bilanciamento quasi perfetto tra le reazioni che rimuovono intermedi dal ciclo e quelle che invece lo riforniscono, e quindi la concentrazione di questi composti resta costante.

56 56 La più importante reazione anaplerotica che avviene nel rene e nel fegato è la carbossilazione reversibile del piruvato per formare ossalacetato, catalizzata dalla piruvato carbossilasi. Quando il ciclo dellacido citrico è povero di ossalacetato o di qualsiasi altro intermedio, il piruvato viene carbossilato a ossalacetato. il piruvato viene carbossilato a ossalacetato. Laggiunta enzimatica di un gruppo carbossilico alla molecola del piruvato richiede energia, che viene fornita dallATP; lenergia libera necessaria a legare un gruppo carbossilico è quasi uguale a quella ricavabile da una molecola di ATP.

57 57 La piruvato carbossilasi è un enzima regolatorio ed è praticamente inattivo in assenza di Ac-CoA (modulatore positivo). Ogni qualvolta l Ac-CoA è presente in eccesso stimola la reazione della piruvato carbossilasi a produrre più ossalacetato, consentendo quindi al ciclo di utilizzare più Ac-CoA nella reazione della citrato sintasi. Ogni qualvolta l Ac-CoA è presente in eccesso stimola la reazione della piruvato carbossilasi a produrre più ossalacetato, consentendo quindi al ciclo di utilizzare più Ac-CoA nella reazione della citrato sintasi.

58 58 La reazione della piruvato carbossilasi richiede la biotina ; questa vitamina è un trasportatore specializzato di gruppi a un atomo di carbonio nella loro forma più ossidata: la CO 2 I gruppi carbossilici sono attivati in una reazione che idrolizza ATP e lega CO 2 allenzima a cui è legata la biotina. Questa CO 2 attivata viene quindi donata a un accettore in una reazione di carbossilazione

59 59 La piruvato carbossilasi è composta da 4 subunità identiche, contenenti ognuna una molecola di biotina legata covalentemente mediante un legame amidico con il gruppo aminico e di uno specifico residuo di lisina. La reazione procede in 2 fasi; prima il gruppo carbossilico derivato dallHCO 3 - viene legato alla biotina, prima il gruppo carbossilico derivato dallHCO 3 - viene legato alla biotina, poi il gruppo è trasferito al piruvato per formare ossalacetato poi il gruppo è trasferito al piruvato per formare ossalacetato

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61 61 REGOLAZIONE DEL CICLO DELLACIDO CITRICO

62 62 Il ciclo dellacido citrico è regolato a livello delle sue tre tappe esoergoniche Il flusso dei metaboliti attraverso il ciclo dellacido citrico è sotto stretto controllo. Tre fattori governano la velocità del flusso attraverso il ciclo: 1.la disponibilità di substrato, 2.linibizione da accumulo di prodotti 3.linibizione allosterica retroattiva (a feedback) dei primi enzimi del ciclo da parte degli ultimi intermedi. Vi sono 3 tappe fortemente esoergoniche nel ciclo: Vi sono 3 tappe fortemente esoergoniche nel ciclo: 1. reaz. catalizzata dalla citrato sintasi 1. reaz. catalizzata dalla citrato sintasi 2. reaz. catalizzata dalla isocitrato deidrogenasi 3. reaz. catalizzata dalla a-chetoglutarato deidrogenasi

63 63 In condizioni normali la velocità della glicolisi e del acido citrico sono coordinate in modo che la quantità di glucosio metabolizzato a piruvato sia soltanto quella che poi entra nel ciclo dellacido citrico sotto forma di Acetil-CoA. Piruvato, lattato e Acetil-CoA sono mantenuti a concentrazioni stazionarie. La velocità della glicolisi viene quindi adeguata a quella del ciclo dellacido citrico non soltanto dai livelli di ATP e di NADH, che sono componenti della fase sia glicolitica sia respiratoria dellossidazione del glucosio, ma anche dal citrato. Questultimo, cioè il prodotto della prima tappa del ciclo, è anche un inibitore allosterico della fosforilazione del fruttosio 6-fosfato da parte della fosfofrutto chinasi-1 della via glicolitica.

64 64 Il ciclo del citrato come piattaforma girevole del metabolismo.

65 65 funziona in condizioni vicine all' equilibrio, per cui la velocità di consumo del citrato dipende dall'attività: L aconitasi funziona in condizioni vicine all' equilibrio, per cui la velocità di consumo del citrato dipende dall'attività: 1.dell'isocitrato deidrogenasi NAD+-dipendente, che in vitro viene fortemente inibita dal suo prodotto NADH. 2. La citrato sintasi viene anche inibita dal NADH, ma è meno sensibile dell'isocitrato deidrogenasi alle variazioni della [NADH]. La citrato sintasi è anche inibita e dal citrato che compete con l'ossalacetato) La citrato sintasi è anche inibita e dal citrato che compete con l'ossalacetato) 3. l'inibizione della-chetoglurarato deidrogenasi da parte del NADH e del succinil-CoA. Il succinil-CoA compete anche con l'acetil-CoA nella reazione della citrato sintasi (inibizione retroattiva competitiva). Questo sistema di inibizioni combinate aiuta a mantenere regolato il ciclo dell' acido citrico in modo coordinato.

66 66 Altri meccanismi regolatori Studi in vitro riguardanti gli enzimi del ciclo dell'acido citrico hanno permesso di identificare alcuni inibitori e attivatori allosterici. LADP è un attivatore allosterico dell'isocitrato deidrogenasi, mentre l'ATP inibisce questo enzima. Il Ca2+ oltre alle sue altre numerose funzioni cellulari, regola il ciclo dell' acido citrico in diversi punti: attiva la piruvato deidrogenasi fosfatasi, che a sua volta attiva il complesso della piruvato deidrogenasi per la produzione di acetil- CoA. Il Ca2+, attiva anche l'isocitrato deidrogenasi e la chetoglutarato deidrogenasi Il Ca2+, attiva anche l'isocitrato deidrogenasi e la chetoglutarato deidrogenasi

67 67 Regolazione del ciclo dellacido citrico. (ottagoni rossi) frecce rosse tratteggiate). Regolazione del ciclo dellacido citrico. Questo schema del ciclo dellacido citrico, che comprende anche la reazione della piruvato deidrogenasi, indica i punti di inibizione (ottagoni rossi) e gli intermedi della via che agiscono da inibitori ( frecce rosse tratteggiate). ADP e Ca ++ ADP e Ca ++ (sfere verdi) sono invece attivatori.

68 68 Così il Ca2+, il segnale che stimola la contrazione muscolare, stimola anche la produzione dell'ATP che andrà a supportarla Nel muscolo cardiaco, dove il ciclo dell' acido citrico è attivo, il flusso dei metaboliti lungo il ciclo è proporzionale alla velocità del consumo cellulare di ossigeno Poiché il consumo di ossigeno, la riossidazione del NADH e la produzione di ATP sono saldamente accoppiati, il ciclo dell'acido citrico deve essere regolato da meccanismi retroattivi che coordinino la produzione di NADH con il consumo di energia.

69 69 I più importanti regolatori del ciclo dell'acido citrico sono i suoi substrati, l'acetil-CoA e l'ossalacetato, e il suo prodotto, NADH.

70 70 Sia l'acetil-CoA sia l'ossalacetato sono presenti nei mitocondri a una concentrazione che non è in grado di saturare la citrato sintasi. l flusso metabolico lungo questo enzima varia quindi in funzione della concentrazione di substrato e viene controllato dalla disponibilità di quest'ultimo. Si è già visto che la produzione di acetil-CoA a partire da piruvato viene regolata dall' attività della piruvato deidrogenasi.

71 71. La concentrazione di ossalacetato, che è in equilibrio con il malato, fluttua a seconda del rapporto [NADH]/[NAD+] seguendo l'espressione all'equilibrio K = [ossalacetato][NADH] K = [ossalacetato][NADH] [malato] [NAD+] [malato] [NAD+] Se, per esempio, aumenta il carico di lavoro del muscolo e la respirazione, nei mitocondri la [NADH] diminuisce. Il conseguente aumento della [ossalacetato] stimola l'attività della citrato sintasi, che controlla la velocità di formazione del citrato. Il conseguente aumento della [ossalacetato] stimola l'attività della citrato sintasi, che controlla la velocità di formazione del citrato.

72 72 Diversamente da quanto accade agli enzimi che limitano la velocità della glicolisi e del metabolismo del glicogeno, i quali regolano il flusso mediante elaborati sistemi di controllo allosterico cicli del substrato modificazioni covalenti gli enzimi regolatori del ciclo dell' acido citrico sembrano controllare il flusso principalmente mediante tre semplici meccanismi:

73 73 (1) disponibilità di substrato (2) inibizione da prodotto (3) inibizione retroattiva competitiva da parte di intermedi prodotti più avanti lungo il ciclo

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75 75 fine


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