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Misurazione e uso di anticorpi Misurazione delle funzioni dei linfociti T.

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Presentazione sul tema: "Misurazione e uso di anticorpi Misurazione delle funzioni dei linfociti T."— Transcript della presentazione:

1 Misurazione e uso di anticorpi Misurazione delle funzioni dei linfociti T

2 Misurazione e uso di Abs Saggio ELISA ELISPOT Cromatografia daffinità Western Blotting Microscopia ad immunofluorescenza Citometria a flusso

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4 Cellule in sospensione passano in singola fila attraverso un volume illuminato dove esse riflettono/rifrattono la luce ed emettono fluorescenza che viene raccolta, filtrata e convertita ad un valore digitale che viene inviato al computer Fluidica Ottica Elettronica Basi della Citometria a Flusso

5 Etidio Bromuro PE (ficoeritrina) Acido cis- Parinarico Texas Red Coniugato PE-TR Ioduro di Propidio FITC (fluoresceina) 600 nm300 nm500 nm700 nm400 nm Linee Laser Comuni Fluorocromi utilizzati più comunemente

6 Cella di Flusso Iniettore Segnale di Fluorescenza Fluorescenza Raggio laser focalizzato focalizzato Fluido di rivestimento Linfocito Monocito Granulocito Schema generale della camera di flusso di un citofluorimetro

7 Rilevamento dei parametri fisici Filtro Dicroico/Specchio a 45 gradi Luce Riflessa Luce trasmessaSorgente luminosa

8 (Forward Angle Light Scatter, FALS) Sensore per il FALS Laser Linfocito Monocito Granulocito Scatter frontale

9 Quando viene utilizzata una sorgente laser, la quantità di luce scatterata nella direzione frontale (ovvero lungo lo stesso asse attraverso cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel canale del forward scatter L intensità del forward scatter è proporzionale alla dimensione, forma ed omogeneità ottica delle cellule (o delle altre particelle analizzate)

10 (90 Degree Light Scatter) Sensore FALS Sensore per il 90°LS Laser Linfocito Monocito Granulocito Scatter laterale

11 Quando si utilizza una sorgente laser, la quantità di luce scatterata lateralmente (perpendicolare allasse attraverso cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel canale del side oppure 90°scatter Anche l intensità del side scatter è proporzionale alla dimensione, forma ed omogeneità ottica delle cellule (o delle altre particelle analizzate)

12 Il Forward Scatter tende ad essere più sensibile alle proprietà della superficie cellulare delle particelle del Side Scatter –può essere usato per distinguere cellule vive da cellule morte Il Side Scatter tende ad essere più sensibie alle inclusioni presenti allinterno della cellula del forward scatter –può essere usato per distinguere cellule granulate da cellule non-granulate

13 Esempio di analisi dei leucociti e gating elettronico LINFOCITI MONOCITI GRANULOCITI

14 Nuclei di linfociti normali o apoptotici

15 Complex or Boolean Gating With two overlapping regions, several options are available: R1R2

16 Region 1 and Region 2: Boolean Gating

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19 FL1-H : CD11b FL2-H : CD11c DC CD11c+ CD11b+ pDC CD11c+ CD11b- Macrophages CD11c- CD11b+ T cells CD11c- CD11b- B cells FL1-H Analisi citofluorimetrica FL2-H

20 Analisi del ciclo cellulare

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22 apoptosi

23 analisi al citofluorimetro

24 . singole

25 Il sorting cellulare

26 488 nm laser + - FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting Piastre cariche elettricamente Cellule singole separate dentro diverse provette FALS Sensor Fluorescence detector

27 Electrode Crystal Laser Amp. (v) Freq. (Hz) Jet-in-Air Nozzle Optics Electronic

28 Amp. (v) Freq. (Hz) Laser Nozzle Jet-in-Air Electrode Crystal Optics Electronic

29 Amp. (v) Freq. (Hz) Laser +/- 190 V Fluorescence Nozzle Delay Time Break-off PointJet-in-Air Electrode Crystal Optics Electronic

30 V V + + _ _Jet-in-Air

31 Analisi pre-sorter Macrofagi peritoneali CD11b positivi

32 Gating Macrofagi peritoneali CD11b positivi

33 Sorted CD11b HIGH sortedCD11b INT. sorted

34 Misurazione e uso di Abs Saggio ELISA ELISPOT Cromatografia daffinità Western Blotting Microscopia ad immunofluorescenza Citometria a flusso

35 Legame diretto con lAg Sandwich ELISA

36 ELISA sandwich

37 ELISPOT

38 Western blotting

39 Cromatografia daffinità

40 Magnetic sorting

41 miniMACS

42 Microscopia ad immunofluorescenza

43 Immuno Staining (anti-occludina) polilisina/vetrino conc. finale di Poli-L. 0,5 mg/ml, in H 2 O 20 min. RT 2 lavaggi con H 2 O asciugare bene PREPARZIONE DEI CAMPIONI Seminare 1,5 x 10 5 cells/vetrino, in 70 µl di terreno NO siero Incubazione, 15 min 37 C (incubatore) Controllare al microscopio FISSARE LE CELLS Aspirare il surnatante Aggiungere 70 µl di PFA1%, 60 min a 4 C Lavare tre volte con PBS 1X (RT) A questo passaggio posso conservare i campioni (in PBS, 4 C) 1 COLORAZIONE Aspirare il PBS Permeare, 0,05%TRITON X-100 in PBS, 5 min on ice. Washing 3X con PBS Blocking con 3%BSA in PBS, 15 min RT Washing 3x con PBS Primary Ab, anti-occludina (rabbit, 1 mg/ml, ZYMED, cat. N ), usare 10 µg/ml finale in BSA 0,5% in PBS. Centrifugare 3 min a 3000 rpm. 70 µl/vetrino 1 h on ice Washing 3x con PBS Secondary Ab, -rabbit, IgG, Cy3-conjugated (donkey Jackson Cod. n ). Suggested dilution 1:700, in BSA 0,5% in PBS. Centrifugare 3 min a 3000 rpm. 70 µl/vetrino. 30 min on ice, al buio. Washing 3x con PBS Montare il vetrino (coverslip) su portaoggetti usando 5-6 µl di moviol 30 min RT, buio Vetrino a – 20 C. 2

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51 Misurazione delle funzioni dei linfociti T A differenza della misurazione della risposta anticorpale umorale, limmunità mediata dalle cells T è tecnicamente più difficile da misurare. Le cells T non secernono prodotti in grado di legare lantigene, per cui non esiste per questo tipo di risposta nessun semplice saggio di legame

52 Studio di funzioni linfocitarie Le funzioni del linfociti T possono essere misurate in 3 modi: 1.Uccisione del bersaglio cellulare 2.Attivazione delle cellule APC 3.Produzione di citochine

53 Metodiche 1. saggio di citotossicità 2. saggio di proliferazione 3. misurazione di citochine

54 Attività citotossica: Rilascio di cromo da cellule bersaglio

55 Proliferazione antigene-specifica delle cellule T

56 Misura citochine prodotte: intracellular staining

57 Intracellular staining 1- cellule in piastra a concentrazione molto alta ( 5x10 5 cells/ml) 2- aggiungere Brefaldine (BFA) 10 µg/ml 3- raccogliere le cellule e suddividerle nei tubi (1-1,5x10 6 cells/ml/sample) 4- blocking: incubare 100 l di PBS-FCS 5% 10 min RT 5- aggiungere anticorpo di superficie 6- lavare 4 volte con 2 ml PBS-FCS 5% 7- fissare con 500 l/tubo di paraformaldeide 2% e incubare 10 minuti RT 8- lavare con 2 ml di PBS-FCS 5% 9- permeare: risospendere le cells in 500 l PB (PBS+FCS 5%+0.5% saponina). 10 min RT 10- aggiungere 1 ml PB e centrifugare 1200 rpm x 5 min 11- risospendere in 100 l di PB+siero per blocking (1:25) 12- aggiungere anticorpo intracellulare 13- incubare 30 min RT al buio 14- lavare 2 volte con PB 15- lavare 2 volte con PBS-FCS 5%

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59 Misura citochine prodotte: cytokine capture

60 CFSE is cell membrane permeable and readily accumulates inside of viable cells where it covalently attaches to intracellular proteins. Hydrolyzed CFSE emits fluorescence and covalently-attached fluorescein molecules seldom leak from cells. CFSE-labeled cells can be monitored over several weeks in vivo. Therefore, CFSE is utilized for viable cell detection as well as for the long-term observation of cell activities by fluorescent microscopy. The excitation and emission wavelengths of CFSE-labeled cells are 500 nm and 520 nm, respectively. 5- or 6-(N-Succiimidyloxycarbonyl)-3',6'-O,O'-diacethylfluorescein CFSE

61 T cell proliferation CFSE staining

62 . WT IL-2 -/- No DCs CD8 CFSE 48 h 72 h FSC Allogeneic CD8 T cell proliferation


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