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Principi e basi della diagnostica virologica A.Azzi, Firenze 19.11.2004.

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Presentazione sul tema: "Principi e basi della diagnostica virologica A.Azzi, Firenze 19.11.2004."— Transcript della presentazione:

1 Principi e basi della diagnostica virologica A.Azzi, Firenze

2 Limportanza della diagnosi Esclusione di altre cause Impiego di terapie antivirali Nella prevenzione Diagnosi precoceDiagnosi rapida

3 Approcci diagnostici Diagnosi indiretta (sierologica) – Sieroconversione – Aumento del titolo – Presenza di IgM specifiche – Avidità delle IgG Diagnosi diretta Ricerca del virus (o di sue componenti) Manifestazioni cliniche Il rischio infettivo in ambito trasfusionale

4 Diagnosi sierologica Risultato ricerca di anticorpi anti HIV nel cs (03/03/03) del Sig ZZ: positivo Il sig ZZ ha una infezione da HIV

5 Diagnosi sierologica Risultato ricerca di anticorpi anti HIV nel cs (04/04/04) del Sig XY: negativo Risultato ricerca di anticorpi anti-HBsAg nel cs (04/04/04) del Sig XY: negativo Risultato ricerca di anticorpi anti HCV nel cs (04/04/04) del Sig XY: IgM neg, IgG pos Il sig XY gode di ottima salute !!!

6 Diagnosi indiretta: limiti Malattie causate da: – riattivazione di virus latenti o infezioni persistenti In: – pazienti immunodepressi Disponibilità dei campioni

7 La ricerca del virus

8 Lisolamento – Nellaminale – Nelle uova embrionate – Nelle colture cellulari

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11 Isolamento nelle colture cellulari Effetti dello sviluppo del virus – ECP (+/- specifico) – Emoadsorbimento – ………………… Necessità di test identificazione del virus: neutralizzazione, IEA, IF …………..

12 Effetti citopatici da virus Morte cellulare – Arrotondamento – Degenerazione – Aggregazione – Perdita di adesione al substrato Cambiamenti istologici caratteristici: inclusioni nucleari o citoplasmatiche Formazione di sincizi Cambiamenti della superficie cellulare: espressione di antigeni virali emoadsorbimento

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14 Problemi nell impiego delle colture cellulari Tempi lunghi per comparsa ECP Determinanti le condizioni di conservazione del campione. Possibii contaminazioni batteriche e fungine. Sostanza tossiche presenti nel campione. Molti virus non crescono nelle colture cellulari e.g. Hepatitis B, Diarrhoeal viruses, parvovirus, papillomavirus.

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17 Test rapidi Test rapidi Ricerca di Ag dei virus influenzali A e B Test immunoenzimatico (ELISA) Supporto: membrana di nitrocellulosa Ab monoclonali specifici per la NP virale Campioni: lavaggi e aspirati nasofaringei, TF Tempo: 15 minuti Distinzione dei tipi (A-B)

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20 La ricerca di componenti del virus nel campione clinico Antigeni virali – Nel siero: antigeni solubili – Nelle cellule : antigeni di superficie o intracellulari Acido nucleico virale – Tecniche di amplificazione – …. ma non solo HBsAg, HBeAg p24 Tecniche di immunoprecipitazione immunoenzimatiche Immunofluorescenza immunoistochimica Tecniche quantitative nel monitoraggio dellinfezione e della terapia Analisi delle sequenze per la determinazione delle resistenze, per la genotipizzazione, per lepidemiologia

21 Limiti tecniche tradizionali EM/IEM Isolamento Ricerca antigeni Virus non coltivabili Scarsamente visualizzabili Agentisconosciuti Costi Manualità Tempi Manualità Sensibilità Difficoltà di individuare antigeni (HCV,TTV…)

22 Tecniche di ibridazione Impiego prevalente per rivelazione e conferma specifictà prodotti di amplificazione Ibridazione in situ Nuove versioni

23 Quali tecniche di amplificazione Amplificazione della sequenza bersaglio Amplificazione del segnale Amplificazione della sonda Applicazioni qualitative e quantitative Non solo PCR

24 Per quali esigenze: per virus non coltivabili o coltivabili con difficoltà a lento sviluppo - effetto per virus ad alto rischio per la ricerca di virus nel liquor o comunque in campioni in cui la carica virale sia bassa Virus epatite B e C Papillomavirus Parvovirus B19, TTV

25 Impiego delle tecniche di biologia molecolare nella diagnostica virologica Applicazioni quantitative per distinzione tra infezione latente e infezione attiva (riattivazione) monitoraggioinfezione(prognosi) monitoraggio terapia valutazione del rischio di trasmissione

26 La ricerca di componenti del virus nel campione clinico Antigeni virali Acido nucleico virale Sensibilità +++ Specificità +++ Rapidità ++ Sensibilità + Specificità +++ Rapidità ++++

27 Linterpretazione Limmunodepressione Infezioni virali latenti e infezioni virali persistenti Infezioni subcliniche Può rendere poco attendibili i risultati della sierologia Luso di tecniche molto sensibili rende Necessario riconsiderare il valore diagnostico di un risultato positivo

28 I marcatori sierologici dellHCV nel periodo seguente allinfezione Infection Infezione HCV RNA 1 2 EIA 3.0 EIA EIA (giorni) 150 Ortho-Clinical Diagnostics

29 Nuovi sviluppi Lanalisi delle sequenze nella diagnostica virologica – Genotipizzazione Nuove tecnologie – Amplificazione real time – Microarray – Pyrosequencing


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