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BIOTECNOLOGIE utilizzo di organismi viventi o loro derivati allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili utilizzo di organismi viventi.

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Presentazione sul tema: "BIOTECNOLOGIE utilizzo di organismi viventi o loro derivati allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili utilizzo di organismi viventi."— Transcript della presentazione:

1 BIOTECNOLOGIE utilizzo di organismi viventi o loro derivati allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili utilizzo di organismi viventi o loro derivati allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili migliorare le caratteristiche di piante ed animali migliorare le caratteristiche di piante ed animali

2 Tecniche biochimiche

3 TECNICHE OTTICHE o SPETTROSCOPICHE Il passaggio della luce o di radiazioni elettromagnetiche attraverso Una sostanza Informazioni Informazioni qualitativequantitative INTERAZIONE tra una radiazione elettromagnetica e la MATERIA FENOMENO QUANTICO

4 Le radiazioni sono onde elettromagnetiche che viaggiano alla velocità di 3x10 8 m/sec. Sono caratterizzate da una componente elettrica ed una magnetica perpendicolari fra loro e che vibrano in una infinità di piani Sono caratterizzate da una componente elettrica ed una magnetica perpendicolari fra loro e che vibrano in una infinità di piani PARAMETRI CHE LE CARATTERIZZANO = lunghezza donda: distanza tra due stessi punti dellonda elettromagnetica (si misura in METRI) T = periodo donda: intervallo di tempo in cui avviene una oscillazione completa (si misura in SECONDI) = frequenza: numero di oscillazioni compiute nellunità di tempo (si misura in Hertz; 1 Hz = 1 ciclo/sec)

5 RAPPRESENTAZIONE DI UNA RADIAZIONE ELETTROMAGNETICA T E = energia o intensità di una radiazione elettromagnetica detta: FOTONE o QUANTO DI LUCE

6 La lunghezza donda ( ) di una radiazione elettromagnetica e la sua frequenza ( ) sono grandezze tra loro inversamente proporzionali: = C C = rappresenta la velocità di propagazione nel vuoto Il suo valore è di circa 3 x 10 8 m/sec. Per una qualsiasi radiazione è necessario conoscere solo uno dei due parametri per poter ricavare anche laltro. E = Radiazioni a bassa lunghezza donda e ad elevata frequenza: elevata energia Elevata lunghezza donda ed bassa frequenza: bassa energia

7 Spettro delle radiazioni elettromagnetiche Nome radiazione Lunghezza donda Å (10 -8 cm) Raggi gamma – Raggi X – 10 Ultravioletto (UV) 10 – 350 Visibile Infrarosso Onde hertziane – 10 10

8 SPETTRO DELLE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE Lunghezza donda Lunghezza donda Nella regione del VISIBILE: radiazioni che possono essere percepite dallocchio umano Radiazioni a bassa lunghezza donda e ad elevata frequenza: elevata energia Elevata lunghezza donda ed bassa frequenza: bassa energia

9 Come avviene linterazione tra le radiazioni elettromagnetiche e la materia ? Il fenomeno può essere spiegato sulla base della teoria quantistica della materia Il fenomeno può essere spiegato sulla base della teoria quantistica della materia Gli elettroni presenti in un orbitale atomico o molecolare si distribuiscono secondo unità discrete di energia o quanti Gli elettroni presenti in un orbitale atomico o molecolare si distribuiscono secondo unità discrete di energia o quanti Lenergia associata al passaggio dallo stato fondamentale E o a quello eccitato avviene solo se è di una particolare frequenza o lunghezza donda = frequenza E eccitato E o fondamentale

10 SI VERIFICANO TRANSIZIONI ELETTRONICHE associabili ALLE DIVERSE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE

11 La spettroscopia atomica o molecolare in seguito a transizioni che si verificano a livello atomico e molecolare Considera lenergia delle radiazioni elettromagnetiche che viene assorbita: SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO Oppure quella parte dellenergia delle radiazioni elettromagnetiche che viene emessa: SPETTROSCOPIA DI EMISSIONE

12 Sulla base delle diverse radiazioni elettromagnetiche avremo: · spettroscopia rotazionale (onde radio) · spettroscopia vibrazionale (infrarosso) spettroscopia molecolare elettronica (visibile e ultravioletto) · spettroscopia atomica (raggi X)

13 LA TECNICA SPETTROSCOPICA CONSENTE AI CHIMICI DI OTTENERE INFORMAZIONI QUALI-QUANTITATIVE Le tecniche spettroscopiche sono basate sullo scambio di energia che si verifica fra lenergia radiante e la materia SPETTROFOTOMETRIA DI ASSORBIMENTO assorbimento delle radiazioni luminose della regione dello spettro elettromagnetico appartenenti al campo del visibile (350 – 700 nm) e del vicino ultravioletto (200 – 350 nm) Lassorbimento di questi tipi di radiazioni da parte delle molecole è in grado di produrre delle transizioni energetiche degli elettroni esterni della molecole

14 Quando una radiazione elettromagnetica attraversa una sostanza, provocherà una transizione elettronica e la radiazione emergente dalla sostanza avrà una intensità Inferiore (SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO ) I 0 = Intensità radiazione incidente I R = riflessa I A = assorbita I T = trasmessa I 0 = I R + I A + I T

15 LA LEGGE DI LAMBERT-BEER I t / I 0 = LA LEGGE DI LAMBERT-BEER I t / I 0 = 10 - cl Nelle soluzioni: Nelle soluzioni: I 0 = I A + I t IL SOLUTO è responsabile dellassorbimento l = il cammino ottico (cm) c = concentrazione molare del soluto = coefficiente di estinsione molare, costante caratteristica di ogni soluto = coefficiente di estinsione molare, costante caratteristica di ogni soluto ma il log I 0 / I t = E = c l ma il log I 0 / I t = E = c l E = c l E = Densità ottica o ASSORBANZA è direttamente proporzionale alla concentrazione del soluto che sta assorbendo la luce

16 E = c l I t I 0, ed il cammino ottico I t / I 0 = 10 - cl E = c l La legge di Lambert-Beer consente di calcolare facilmente la concentrazione di una soluzione dalla misura dellintensità della radiazione trasmessa I t quando è nota lintensità della luce incidente I 0, ed il cammino ottico = coefficiente di estinsione molare Rappresenta quella densità ottica di una soluzione in cui la concentrazione = 1 (C = 1) ed il cammino ottico è unitario ( l = 1)

17 T = TRASMISSIONE PERCENTUALE T = 100 I t I 0 Log T = 2 - log I 0 / I t Log T = 2 - log I 0 / I t Log T = 2 - E Log T = 2 - E E = 2 - Log T E = 2 - Log T T = 1 sostanza trasparente E = 0 T = 0 sostanza opaca E = T varia da 0 a 100 E varia da + a 0 E = 2 – log T 8 8

18 Componenti schematici di una apparecchiatura per analisi spettroscopica S = Sorgente di radiazioni (lampada) LP = Radiazione policromatica M = Monocromatore LMI = Rad. Monocromatica incidente LME = Rad. Monocromatica emergenteSP = Specchio C = Contenitore campione (cuvetta) R = Rivelatore

19 Spettrofotometri UV-VISIBILE, i tipi più comuni sono il monoraggio e il doppio raggio: 1) SORGENTE DI RADIAZIONE SORGENTE SORGENTE 2) SELEZIONATORE DI LUNGHEZZE DONDA O MONOCROMATORE MONOCROMATORE 3) CELLA CELLA 4) RIVELATORE RIVELATORE 5) LETTORE LETTORE

20 Sorgenti di radiazioni per spettroscopia nel visibile ed ultravioletto (spettroscopia molecolare elettronica) · Ad incandescenza · Ad incandescenza ( compresa tra nm) adatte solo per il visibile ( compresa tra nm) adatte solo per il visibile · Ad idrogeno · Ad idrogeno ( compresa tra nm) adatte solo per ultravioletto ( compresa tra nm) adatte solo per ultravioletto

21 Lampada al Tungsteno + deuterio

22 Il monocromatore è il sistema ottico usato per disperdere la luce policromatica in bande monocromatiche, che vengono inviate in successione sul campione. Il monocromatore è il sistema ottico usato per disperdere la luce policromatica in bande monocromatiche, che vengono inviate in successione sul campione. Essi sono basati su un ELEMENTO DISPERDENTE Essi sono basati su un ELEMENTO DISPERDENTE (prisma o reticolo), che separano le varie componenti della radiazione e ne permettono la successiva selezione della banda desiderata. (prisma o reticolo), che separano le varie componenti della radiazione e ne permettono la successiva selezione della banda desiderata. Consistono nel far incidere il fascio policromatico su un oggetto (un prisma o un reticolo) in grado di deviare le diverse radiazioni con diversi angoli: la radiazione uscente sarà quella che passa attraverso la fenditura di uscita.

23 MONOCROMATORI separa la luce policromatica in bande monocromatiche, che vengono inviate in successione sul campione. A prismaA reticolo

24 CUVETTE Sono i contenitori dei campioni da analizzare Sono i contenitori dei campioni da analizzare Cammino ottico calibrato (1 cm) Cammino ottico calibrato (1 cm) Volume diverso Volume diverso Materiale diverso in dipendenza della lunghezza donda Materiale diverso in dipendenza della lunghezza donda Quarzo per UV e visibile Quarzo per UV e visibile Vetro solo per il visibile Vetro solo per il visibile

25 Durante questi esperimenti vengono utilizzate cuvette in quarzo,in quanto questo materiale permette alla luce bianca di oltrepassare senza alcun cambiamento.

26 PORTACUVETTE dove inserire il campione PORTACUVETTE dove inserire il campione

27 Sono dispositivi capaci di produrre un segnale elettrico che dipende dall'energia delle radiazioni ricevuta. Tale segnale elettrico (proporzionale all'intensità luminosa) viene poi trasferito a un indicatore

28 RILEVATORI Sistemi capaci di determinare lintensità di una radiazione trasformando un segnale luminoso in energia elettrica Sistemi capaci di determinare lintensità di una radiazione trasformando un segnale luminoso in energia elettrica Fotocella (o fototubo) Fotocella (o fototubo) Effetto fotoelettrico Fotomoltiplicatori Fotomoltiplicatori Effetto fotoelettrico amplificato Rivelatori a serie di diodi Rivelatori a serie di diodi Elettronici, fanno anche lo spettro delle radiazioni di cui determinano lintensità.

29 Tramite un convertitore analogico digitale è possibile così ottenere i risultati dellanalisi direttamente su un personal computer che ne elabora i dati. Il segnale proveniente dal rivelatore viene opportunamente amplificato e un amperometro ne rileva lintensità. Il lettore converte quindi il segnale elettrico in un valore numerico proporzionale allintensità del segnale, e questo valore va da 0 a 100. Ponendo pari a 100 il valore del segnale in assenza del campione, otteniamo la trasmittanza e da questa lassorbanza. trasmittanza lassorbanzatrasmittanza lassorbanza

30 ASSORBANZA Lassorbanza è il logaritmo negativo della trasmittanza A = 2 - log(T) A = 2 - log(T) A = cl Secondo la legge di Lambert – Beer lassorbanza A è proporzionale alla concentrazione della sostanza assorbente, per cui più elevata è la concentrazione delle molecole che passano dallo stato fondamentale a quello eccitato, maggiore sarà lassorbanza

31 Esistono diversi tipi di spettrofotometro, a seconda di come sono organizzate le varie componenti: SPETTROFOTOMETRI MONORAGGIO SPETTROFOTOMETRI MONORAGGIO SPETTROFOTOMETRI A DOPPIO RAGGIO SPETTROFOTOMETRI A DOPPIO RAGGIO Gli SPETTROFOTOMETRI MONORAGGIO, sono usati prevalentemente in analisi quantitativa e non sono comodi per ottenere spettri di assorbimento Gli SPETTROFOTOMETRI MONORAGGIO, sono usati prevalentemente in analisi quantitativa e non sono comodi per ottenere spettri di assorbimentoSPETTROFOTOMETRI MONORAGGIOSPETTROFOTOMETRI MONORAGGIO La difficoltà sta nel fatto che per ogni misura, si deve ripetere l'azzeramento contro il bianco, oppure registrare prima lo spettro del bianco, poi lo spettro del campione ed infine sottrarre al secondo il primo. Negli SPETTROFOTOMETRI A DOPPIO RAGGIO si ha invece un sistema che invia due raggi, identici per frequenza e intensità, uno attraverso il campione e l'altro attraverso il bianco, per cui si ha un confronto continuo tra l'assorbanza del campione e quella del bianco. Negli SPETTROFOTOMETRI A DOPPIO RAGGIO si ha invece un sistema che invia due raggi, identici per frequenza e intensità, uno attraverso il campione e l'altro attraverso il bianco, per cui si ha un confronto continuo tra l'assorbanza del campione e quella del bianco.SPETTROFOTOMETRI A DOPPIO RAGGIO SPETTROFOTOMETRI A DOPPIO RAGGIO Grazie a queste caratteristiche è possibile effettuare misure direttamente senza ripetere azzeramenti, e soprattutto registrare continuativamente lo spettro di assorbimento. Grazie a queste caratteristiche è possibile effettuare misure direttamente senza ripetere azzeramenti, e soprattutto registrare continuativamente lo spettro di assorbimento.

32 SCHEMA DI UNO STRUMENTO A SINGOLO RAGGIO IL MONOCROMATORE è un PRISMA o un RETICOLO DI DIFFRAZIONE Converte lIntensità della radiazione in Intensità di corrente 1) Si mette nella cuvetta il solvente e si misura lIntensità. 2) Si lava la cuvetta. 3) Si mette la soluzione e si misura lintensità. 4) Si fa il rapporto fra le due Intensità

33 SCHEMA DI UNO STRUMENTO A DOPPIO RAGGIO Il bianco (o riferimento) è costituito dal solvente ad eccezione della sostanza di cui si vuol esaminare lassorbimento La radiazione proveniente dal MONOCROMATORE si divide in due raggi che sono inviati contemporaneamente al campione ed al solvente. Il secondo raggio passa attraverso il campione e fuoriesce con lIntensità trasmessa I campione Il computer registra entrambe in modo alterno e calcola il rapporto.

34 I valori di T sono convertiti in E o assorbanza (A) Per risalire dai valori di E alla concentrazione della soluzione in esame : Noto il coefficiente di estinsione molare Noto il cammino ottico Si allestisce una CURVA STANDARD di una soluzione a concentrazione nota FOTOMETRIA

35 Assorbanza 280nm Concentrazione albumina mg 051,01,5 Conoscendo il valore dellassorbanza del campione si può Interpolare graficamente il valore della sua concentrazione 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 2,02,5.

36 Lo studio delle radiazioni assorbite da una sostanza (SPETTRO DI ASSORBIMENTO) può essere utilizza A SCOPO ANALITICO Il colore delle sostanze è dovuto al fatto che esse assorbono specifiche radiazioni e ne lasciano passare o riflettono altre SOSTANZA COLORATA: assorbe solo alcune radiazioni che costituiscono la luce bianca e lascia passare tutte le altre SOSTANZA INCOLORE: non assorbe nessuna radiazione che costituisce la luce bianca ma assorbe radiazioni a lunghezza donda comprese nellultravioletto o nellinfrarosso

37 Il massimo dellassorbimento dipende dai gruppi funzionali presenti nelle molecole ed identifica LO SPETTRO DI ASSORBIMENTO

38 ASSORBIMENTO DELLA LUCE ULTRAVIOLETTA DA PARTE DEGLI Aa AROMATICI Il triptofano e la tirosina Assorbono la luce ultravioletta, ciò spiega perché la maggior parte delle proteine hanno un caratteristico assorbimento della luce ad una lunghezza donda di 280nm

39 Spettri di di assorbimento della luce da parte dei comuni nucleotidi, gli spettri sono quasi identici, per effettuare misure di assorbimento viene usata la luce a 260 nm

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41 I citocromi possono essere distinti in base agli spettri diassorbimento della luce LUNGHEZZA DONDA

42 Applicazioni METODI DIRETTI Sfruttano le proprietà ottiche delle molecole analizzate PROTEINE = 280 nm ACIDI NUCLEICI = 260 nm METODI INDIRETTI Amminoacidi = ninidrina (570nm) Proteine = biureto (540) Zuccheri = proprietà riducenti Enzimi = substrati o prodotti

43 Metodi enzimatici indiretti Reazioni enzimatiche accoppiate in cui il prodotto viene utilizzato come substrato in unaltra reazione nella quale è coinvolta una sostanza cromofora Reazioni enzimatiche accoppiate in cui il prodotto viene utilizzato come substrato in unaltra reazione nella quale è coinvolta una sostanza cromofora Glucosio ossidasi Glucosio ossidasi Glucosio + O 2 + H 2 O = ac. Gluconico + H 2 O 2 Glucosio + O 2 + H 2 O = ac. Gluconico + H 2 O 2 perossidasi perossidasi H 2 O 2 + sost. Ridotta (incolore) = sost. colorata H 2 O 2 + sost. Ridotta (incolore) = sost. colorata Glucosio + ATP = Glucosio-6-fosfato + ADP Glucosio + ATP = Glucosio-6-fosfato + ADP Glucosio-6-fosfato + NADP = 6-fosfogluconato + NADPH Glucosio-6-fosfato + NADP = 6-fosfogluconato + NADPH

44 La riduzione dellanello nicotinamidico produce una nuova banda di assorbimento della luce con un massimo a 340 nm

45 FLUORIMETRIA Tecnica ottica quantitativa e qualitativa Tecnica ottica quantitativa e qualitativa Una molecola assorbe una radiazione elettromagnetica Una molecola assorbe una radiazione elettromagnetica Si produce uno stato eccitato instabile Si produce uno stato eccitato instabile nel ritornare allo stato basale nel ritornare allo stato basale EMETTE ENERGIA A LUNGHEZZA DONDA MAGGIORE EMETTE ENERGIA A LUNGHEZZA DONDA MAGGIORE Lenergia della radiazione emessa è sempre inferiore a quella assorbita, pertanto avrà una frequenza inferiore e lunghezza donda superiore Lenergia della radiazione emessa è sempre inferiore a quella assorbita, pertanto avrà una frequenza inferiore e lunghezza donda superiore

46 SPETTROFLUORIMETRIA Tecnica ottica di analisi qualitativa e quantitativa basata sul fenomeno della fluorescenza. Tecnica ottica di analisi qualitativa e quantitativa basata sul fenomeno della fluorescenza. La fluorescenza è un fenomeno di emissione di una radiazione elettro-magnetica che si verifica in seguito ad una transizione elettronica da uno stato energetico superiore ad uno inferiore. La fluorescenza è un fenomeno di emissione di una radiazione elettro-magnetica che si verifica in seguito ad una transizione elettronica da uno stato energetico superiore ad uno inferiore. Affinché possa avvenire è necessario che una molecola si trovi in uno stato eccitato. Affinché possa avvenire è necessario che una molecola si trovi in uno stato eccitato. Lenergia della radiazione emessa è sempre inferiore a quella assorbita, pertanto avrà una frequenza inferiore e lunghezza donda superiore. Lenergia della radiazione emessa è sempre inferiore a quella assorbita, pertanto avrà una frequenza inferiore e lunghezza donda superiore.

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48 RAPPRESENTAZIONE SCHEMATICA DI UNO SPETTROFLUORIMETRO

49 APPLICAZIONI · Metodi diretti · Metodi diretti Sfruttano la fluorescenza intrinseca delle molecole da analizzare Proteine nm Proteine nm Gruppi prostetici ( nm) Gruppi prostetici ( nm) · Metodi indiretti · Metodi indiretti Sfruttano le proprietà di sostanze che diventano fluorescenti in seguito alla loro interazione con le sostanze da analizzare. Cloruro di dansile (DNS) Cloruro di dansile (DNS) · Acido 1-anilinonaftalen-8-solfonico (ANS) · Acido 1-anilinonaftalen-8-solfonico (ANS) · Etidio bromuro (EB) · Etidio bromuro (EB)

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55 BIOTECNOLOGIE utilizzo di organismi viventi o loro derivati allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili utilizzo di organismi viventi o loro derivati allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili migliorare le caratteristiche di piante ed animali migliorare le caratteristiche di piante ed animali Ingegneria genetica: tecniche che consentono di modificare il patrimonio genetico di organismi in modo da trasferire da un essere vivente ad un altro caratteristiche utili Ingegneria genetica: tecniche che consentono di modificare il patrimonio genetico di organismi in modo da trasferire da un essere vivente ad un altro caratteristiche utili


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