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Cinetica enzimatica La costante catalitica 26 In un semplice meccanismo di Michaelis-Menten o Briggs-Haldane k cat = k 3. Per reazioni più complicate la.

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Presentazione sul tema: "Cinetica enzimatica La costante catalitica 26 In un semplice meccanismo di Michaelis-Menten o Briggs-Haldane k cat = k 3. Per reazioni più complicate la."— Transcript della presentazione:

1 Cinetica enzimatica La costante catalitica 26 In un semplice meccanismo di Michaelis-Menten o Briggs-Haldane k cat = k 3. Per reazioni più complicate la k cat è una funzione di tutte le costanti di velocità di primo ordine nel corso della reazione diretta. La costante catalitica k cat è la costante che appare al numeratore dell equazione cinetica così scritta:

2 Cinetica enzimatica La costante catalitica 27 costante catalitica k cat numero di turnover La costante catalitica k cat è detta anche numero di turnover e rappresenta il numero massimo di molecole di substrato convertite in prodotto per sito attivo e per unità di tempo. Quando l' enzima è saturato dal substrato si ha infatti:

3 Cinetica enzimatica La costante di specificità 28 La costante di specificità Per [S] << Km l' equazione assume la seguente forma: Il rapporto k cat /Km è una costante di velocità apparente di secondo ordine per la formazione di E+P da E+S quando il processo dipende dall' incontro di E con S ([S] << Km).

4 Cinetica enzimatica La costante di specificità 29 Per reazioni che seguano un meccanismo di stato stazionario: Quando k 3 >>k 2 la relazione si semplifica in: in queste condizioni k cat /Km è uguale alla costante cinetica k 1 : la velocità di reazione è vicina alla velocità dell' incontro controllato dalla diffusione del substrato sull' enzima ed è quindi la più elevata possibile

5 Cinetica enzimatica La costante di specificità 30 Immaginiamo due substrati differenti A e B in competizione per uno stesso enzima Perché k cat / Km è detta costante di specificità?

6 Cinetica enzimatica La costante di specificità 31 A / B è Quando [A]=[B] il rapporto v A / v B è uguale al rapporto dei rispettivi valori di k cat /Km: specificità l'enzima ha infatti maggior specificità per il substrato per il quale ha il valore più elevato di k cat /Km.

7 Cinetica enzimatica cinetica in accumulo di intermedio 32 Alcuni enzimi,come la chimotripsina,procedono con un meccanismo di questo tipo: Dal primo complesso ES si libera velocemente un primo prodotto P 1 mentre il complesso ES' tende ad accumularsi in quanto la costante cinetica di trasformazione in E e P 2 risulta più piccola della costante cinetica di trasformazione del complesso ES in ES' ( k 4 <

8 Cinetica enzimatica cinetica in accumulo di interm edio 33 Equazione cinetica in accumulo di intermedio Ricaviamo l' equazione cinetica per la formazione di P 2 assumendo una condizione di stato stazionario: (1) (2) Calcoliamo la [ES]: da cui (3)

9 Cinetica enzimatica cinetica in accumulo di intermedio 34 Calcoliamo la [ES'] in condizioni di stato stazionario : da cui risolvendo per [ES'] e sostituendo a [ES] l' espressione (3): (4)

10 Cinetica enzimatica cinetica in accumulo di intermedio 35 Dividiamo ora la (1) per la (2): sostituiamo a [ES] e [ES'] le corrispondenti espressioni calcolate in (3) e (4):

11 Cinetica enzimatica cinetica in accumulo di intermedio 36 Semplifichiamo: Dividiamo per k 1 /k 2 + k 3 :

12 Cinetica enzimatica cinetica in accumulo di intermedio 37 Dividiamo per k 4 +k 3 /k 4 per ottenere l' equazione finale: Ponendo e si ha:

13 Cinetica enzimatica cinetica in accumulo di intermedio 38 Si noti che se k 4 >> k 3 l' intermedio ES' non si accumulerebbe più e l 'equazione di velocità sarebbe quella di un enzima ad un substrato che segue una cinetica di stato stazionario con e

14 Cinetica enzimatica k cat e k cat /Km 39 Considerazioni su k cat e k cat /K m è cataliticamente vantaggioso per un enzima formare un ES stabile complesso ES stabile (legame forte con il substrato) oppure ES* stabile un legame forte con il substrato allo stato di transizione (ES* stabile)?

15 Cinetica enzimatica k cat e k cat /Km 40 Considerazioni su k cat e k cat /K m Immaginiamo di modificare un enzima sostituendo un residuo aminoacidico del sito attivo e di valutarne le conseguenze sulla catalisi in primo luogo in condizioni di saturazione di substrato quando

16 Cinetica enzimatica k cat e k cat /Km 41 Consideriamo ora lo stesso esperimento a basse concentrazioni di substrato, quando l' energia G di ES è maggiore di quella di E+S e la velocità della reazione è espressa da

17 Cinetica enzimatica k cat e k cat /Km 42 Da questi due esperimenti si deduce che: è vantaggioso per l enzima legare debolmente il substrato e fortemente lo stato di transizione il legame forte dell' enzima con lo stato di transizione massimizza k cat /Km principio di massimizzazione di Km a k cat /Km costante: mantenendo k cat /Km costante, la velocità di reazione di un enzima aumenta se aumenta Km.

18 Cinetica enzimatica k cat e k cat /Km 43 principio di massimizzazione di Km a k cat /Km costante: esempio pratico principio di massimizzazione di Km a k cat /Km costante: esempio pratico k cat /Km=10 6 M -1 s -1 [S]= M [E tot ]=10 -6 M Km =10 -3 M k cat =10 3 s -1 Km =10 -2 M k cat =10 4 s -1

19 Cinetica enzimatica Cinetica enzimatica analisi grafica 44 Linearizzazione dell equazione di Michaelis-Menten: Linearizzazione dell equazione di Michaelis-Menten: Metodo di Metodo di Lineweaver-Burk (metodo dei doppi reciproci)

20 Cinetica enzimatica Cinetica enzimatica analisi grafica 45 Linearizzazione dell equazione di Michaelis-Menten: Linearizzazione dell equazione di Michaelis-Menten: la la trasformazione di Eadie-Hofstee:


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