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Studio biochimico dellattivazione dei recettori Le molecole segnale idrofiliche non possono superare il doppio strato lipidico della membrana cellulare.

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Presentazione sul tema: "Studio biochimico dellattivazione dei recettori Le molecole segnale idrofiliche non possono superare il doppio strato lipidico della membrana cellulare."— Transcript della presentazione:

1 Studio biochimico dellattivazione dei recettori Le molecole segnale idrofiliche non possono superare il doppio strato lipidico della membrana cellulare. Il sito recettoriale delle molecole idrosolubili è situato sulla parte extracellulare di recettori transmembrana. Molecole segnale lipofiliche attraversano facilmente la membrana cellulare: i loro recettori sono quindi localizzati all'interno della cellula.

2 Differenti tipi di recettori - Legati a canali ionici - Legati alla proteina G - Recettori steroidei - Recettori legati ad enzimi

3 Recettori legati a canali ionici con effetto di tipo: eccitatorio acetilcolina, glutammato, serotonina (apertura dei canali Na + con conseguente depolarizzazione) inibitorio Gaba, glicina (apertura dei canali Cl - con conseguente iperpoplarizzazione)

4 Recettori steroidei Gli steroidi sono molecole con elevata lipofilia, in grado di attraversare le membrane plasmatiche e a livello nucleare legandosi a recettori specifici (DNA-binding protein) regolano la trascrizione di un gene adiacente al legame

5 Quando attivati funzionano direttamente come enzimi (RTK) o sono associati ad enzimi (PTK) Recettori legati ad enzimi

6 Il ligando endogeno (1) lega specificamente il recettore (2). Viene attivato il sistema G-protein (3). Viene attivato ladenilato ciclasi (4) che produce il secondo messaggero cAMP (5) a partire dallATP (6). Avvengono una serie di reazioni enzimatiche (7) e via fosforilazione (8) il glicogeno (9) viene trasformato in glucosio (10). La fosforilazione può interessare proteine di membrana come canali ionici (11). Recettori legati alla G-protein

7 Attivazione della Proteine G La G-protein è composta da tre subunità legata quando non attivata al GDP Linterazione ligando recettore attiva la G-protein liberando GDP.....legando GTP. Il trimero si suddivide Il GTP legato ad viene idrolizzato a GDP+ P. Le subunità si ricombinano.

8 GqGq R GTP GDP +- GTPGDP GiGi R AC ATPcAMP RGsGs GTPGDP PK-A + Ca ++ RS + Ca ++ PL-C PIP 2 IP 3 + DAG PK-C +

9 Sfruttando il meccanismo di attivazione illustrato si può determinare lattività agonista, agonista inverso, agonista parziale, antagonista. Utilizzando GTP S 35, analogo non idrolizzabile del GTP, si può misurare lattività di un ligando in base allaccumulo di GTP S 35. Nel caso in cui il composto sia antagonista è necessario realizzare la curva di attività in presenza di un agonista pieno e verificare lo spostamento parallelo a destra a dosi crescenti di antagonista. CH 2 O POPO P O O 35 S OH OHOHOH O N N N N O H NH 2 OH OH

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11 cAMP La reazione è basata sulla competizione per lanti-anticorpo tra cAMP legato alla fosfatasi alcalina e quello libero proveniente dalla stimolazione recettoriale Dosaggio del secondo messaggero AP + S+ S S S S

12 cAMP coniugato alla fosfatasi alcalina Anticorpo primario legato al pozzetto cAMP indotto dallattivazione recettoriale del ligando Anticorpo secondario La quantità di cAMP cellulare è inversamente proporzionale alla quantità di colorazione gialla svolta. AP

13 Attivazione di PK-A Glucagone Recettore G-Protein (,,, subunità) PK-A inattivaPK-A Adenilato ciclasi (inattivo) G-Protein (, subunità) Fosforilazione di substrati

14 Substrato PK-A-R110 (bisammide Rhodamina 110 peptide) PK-A R110 non fluorescente PK-A PK-A R110 fluorescente PK-A R110 non fluorescente fosforilato proteasi non fluorescente Eccitazione 485 nm Emissione 530 nM

15 % peptide fosforilato FLU 100,000 50,000 0 Lintensità di fluorescenza misurata nel saggio è inversamente correlata allattività della PK-A

16 Dosaggio del Ca ++ intracellulare IP 2 DAGIP 3 Calmodulina-proteina Kinasi (inattivoa) Calmodulina- proteina Kinasi Proteina kinasi C Proteina kinasi C inattiva Gq- REL

17 Saggio dellAequorina LAequorina è una fotoproteina riscontrata nella medusa Aequorea Victoria. Lapoaequorina è una proteina di 21 KDalton e necessita di un gruppo prostetico idrofobico coeletranzina per essere convertita nella forma enzimatica attiva: aequorina. Dosaggio del Ca ++

18 In presenza di Ca ++ aequorina ossida la coeletranzina in coelentramide con produzione di CO 2, ed emissione di luce. Questi saggi vengono effettuati in linee cellulari stabili in grado di esprimere il GPCR ed apo-aequorina

19 Sistemi di modulazione del segnale Oltre a sistemi di attivazione recettoriale e di amplificazione del segnale sono presenti meccanismi di interruzione del segnale Autoregolazione del rilascio del neurotrasmettitore (feedback negativo) Questo meccanismo si realizza mediante recettori presinaptici che possono essere controllati dallo stesso neurotrasmettitore (autorecettori) o da un neurotrasmettitotre differente (eterorecettori)

20 Sistemi enzimatici preposti alla degradazione Sistemi di recupero del neurotrasmettitore Desensitizzazione recettoriale (in recettori accoppiati alla G-protein) La desensitizzazione può essere: omologa (specifica per un recettore) oppure eterologa (non specifica); rapida (~ 20 minuti) oppure lenta (giorni); perdita funzione recettoriale (uncoupling) o con diminuzione dei recettori (down-regulation)

21 Uncoupling del recettore (desensitizzazione rapida) La fosforilazione non altera la capacità del recettore di attivare la G- protein ma aumenta laffinità del recettore fosforilato per la proteina - arrestina che inibisce linterazione del recettore con la G-protein determinando il disaccoppiamento).

22 Uncoupling del recettore (desensitizzazione lenta) Molti sistemi recettoriali sono fosforilati dai loro stessi enzimi effettori PKA e PKC Questo tipo di fosforilazione è un feedback diretto negativo che al tempo stesso sopprime lattivazione dellenzima effettore PKA. Questo meccanismo di desensitizzazione è eterologo in quanto lattivazione di PKA PKC è sufficiente a determinare la fosoforilazione del recettore. La desensitizzazione da PKA è più lenta ma è molto più sensibile alla concentrazione di agonista.

23 Saggi funzionali su organo isolato In questi esperimenti in seguito ad uno stimolo (farmacologico o elettrico) deve essere apprezzabile e misurabile una risposta in un preparato biologico variazioni del volume del preparato biologico che viene valutato mediante semplici registratori a galleggiante variazione di lunghezza o di tensione del preparato biologico Leffetto che si dovrà valutare può essere rappresentato da: variazioni di pressione

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25 La stimolazione del preparato biologico può essere effettuata Elettricamente Farmacologicamente In alcuni esperimenti può essere necessario stimolare elettricamente il preparato. La forma e la durata degli impulsi sono parametri importanti soprattutto in preparati neuromuscolari. Le concentrazioni di farmaco necessarie in questo tipo di esperimento sono molto basse anche perché quando impiegati a dosaggi elevati sono dotati di vari effetti ed è quindi importante scegliere quelle concentrazioni alle quali agiscono in modo specifico.

26 Esperimenti farmacologici QualitativiQuantitativi Studio del meccanismo di azione Quantizzazione dellattività caratterizzata Agonisti producono effetti attivi o diretti sui preparati biologici Antagonisti producono effetti negativi o indiretti e inibizione o alterazione degli effetti degli agonisti

27 Curva dose-risposta di un agonista pieno Effetto massimo percentuale Log dose Effetto massimo In rosso la curva dose-risposta dellagonista. In nero le curve dose risposta dellantagonista in presenza di dosi crescenti di antagonista.

28 dose carbacolo 1 M carbacolo 1 M in presenza di 0.1 M di atropina Risposta dellileo di cavia ad una dose di carbacolo

29 Impulso elettricoContrazione Attività pre- post- giunzionale Agonista pre- Un agonista pre- è in grado di ridurre il rilascio di mediatore chimico successivo alla stimolazione elettrica. Es: 8-OH-DPAT sui recettori serotoninergici 5-HT 1A nella vescica o ileo di cavia

30 Agonista post- Un agonista post è in grado di attivare autonomamente leffetto biologico Es: carbacolo su recettori muscarinici nell ileo di cavia


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