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The macrophage cholesterol exporter ABCA1 functions as an anti-inflammatory receptor The Journal of Biological Chemistry, published on September 25th,

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1 The macrophage cholesterol exporter ABCA1 functions as an anti-inflammatory receptor The Journal of Biological Chemistry, published on September 25th, 2009 as Manuscript Chongren Tang, Yuhua Liu, Peter S.Kessler, Ashley M.Vaughan and John F.Oram Division of Metabolism, Endocrinology and Nutrition, Department of Medicine, University of Washington, Seattle.

2 ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) è una proteina integrale di membrana, responsabile dellefflusso del colesterolo dalle cellule e… immunomodulante!!!...espleta unazione immunomodulante!!!

3 Funzione e trasporto del colesterolo Struttura e regolazione dellespressione di ABCA1 Receptor-like activity and lipid transport model

4 metabolita essenziale Il colesterolo è un metabolita abbondante nei tessuti dei mammiferi,essenziale per parecchie funzioni biologiche. Fluidità di membrana Lipid rafts Precursore Ormoni steroidei: -Mineralcorticoidi, -Glucocorticoidi, -Ormoni sessuali Vitamina D Acidi Biliari Esteri del colesterolo ACAT

5 a 6b 7 6 6c 8

6 Le lipoproteine sono formate da : 1) apoproteine (alfa-elica amfipatica) 2) fosfolipidi 3) trigliceridi colesterolo libero ed esterificato 4) colesterolo libero ed esterificato 5) acidi grassi liberi

7 Classificazione delle Lipoproteine %proteine

8 LDL Le LDL sono il principale trasportatore di colesterolo ai tessuti. L'uptake delle LDL avviene per via recettoriale al fegato (75/%), corteccia surrenale e tessuto adiposo e MACROFAGI.

9 1 2 3a 3b 4a 4b 5

10 Immagine in TEM dellendocitosi Mediata da recettore delle LDL

11 HDL A subfraction of circulating lipoproteins called high-density lipoproteins (HDLs) is involved in the export of excess cholesterol from cells Una delle maggiori funzioni delle HDL è il trasporto del colesterolo dai tessuti periferici al fegato, dove esso viene escreto nella bile. Si ritiene che la rimozione delleccesso di colesterolo dai macrofagi del connettivo vascolare da parte delle HDL abbia un ormai ben stabilito effetto cardioprotettivo. Core di esteri del colesterolo

12

13 Sono stati identificati tre trasportatori di membrana che mediano lefflusso del colesterolo dalle cellule alle componenti delle HDL. Essi appartengono alla superfamiglia ATP-binding cassette transporters (ABCs) [trasportatori di membrana ATP-dipendenti]: ABCA1 trasporto di colesterolo, fosfolipidi ed altri metaboliti alle apoproteine delle HDL; è altamente espresso in fegato e macrofagi tissutali; ABCG1 e ABCG4 trasporto del colesterolo a HDL e altre lipoproteine; ABCG1 è anchesso espresso nei macrofagi e lavora in sinergia con ABCA1 nel rimuovere il colesterolo in eccesso. ABCG4 è selettivamente espresso nei neuroni dove è specializzato nel trasporto lipidico

14 Funzione e trasporto del colesterolo Struttura e regolazione dellespressione di ABCA1 Receptor-like activity and lipid transport model

15 ABCA1 NBD1 NBD2 WalkerB WalkerA WalkerC

16 Substrati Accettori Fosfolipidi (fosfatidilcolina) Colesterolo Proteine contenenti alfa- eliche anfipatiche (11,22aa),in cui gli aa carichi si dispongono lungo una faccia dellasse,gli aa idrofobici sulla faccia opposta! Apolipoproteine di HDL: A-I, A-II, E, C-I, C-II, C-III, A-IV PLTP: phospholipid-transfer- protein

17 Cytogenetic location: 9q31.1 The cellular transporter ABCA1 is a critical protein that transports excess free cholesterol (FC) out of the cell to an acceptor, lipid-poor apo A-I. ABCA1 gene transcription is regulated by the nuclear receptor heterodimer liver X receptor/retinoid X receptor (LXR/RXR). Cellular oxysterols appear to be one of the endogenous ligands for LXR and promote the transcription of ABCA1. Oxysterols are generated from free cholesterol. Presumably, this represents a homeostatic mechanism by which macrophages rid themselves of excess free cholesterol. LXR gene transcription is also influenced by both peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR- ) and PPAR-

18 oxysterols LXR/RXR ABCA1 PPARs A-I

19 Funzione e trasporto del colesterolo Struttura e regolazione dellespressione di ABCA1 Receptor-like activity and lipid transport model

20 Receptor-like activity ABCA1 is unique among eukaryotic ABC transporters that requires the direct binding of the acceptor for the transported substrate.The ABCA1 binding determinant of apolipoproteins is the amphipatic α- helix.This binding may be mediated by the large extracellular loops of ABCA1,which are unique for this family of transporters.

21 The interaction of apolipoproteins with ABCA1- expressing cells also activates signaling molecules that modulate ABCA1 expression or lipid transport activity:these findings suggest that apolipoprotein/ABCA1 interactions behave like a ligand/receptor system.In fact, this interaction stimulates autophosphorylation of tyrosine kinase Jak2,thus generating the active Jak2:apo A-I potentiates its own interaction with ABCA1 by activating Jak2,which in turn increases the apo A-I binding to ABCA1 required for lipid removal RECEPTOR ACTIVITY (FEEDFORWARD MECHANISM)

22 ADP P Chamber LIPID TRANSPORT MODEL

23 (A)Phospholipids and perhaps free cholesterol ( C ) are translocated across the plasma membrane to form tightly packed and disordered lipid domains that protrude from the cells. (B) Apo A-I binds to ABCA1 and stimulates phosphorilation of Jak2.( C ) The phosphorilated/activated Jak2 enhances the Apo A-I binding to ABCA1 required for interaction with lipid domains generated by ABCA1.(D)Apo A-I solubilizes the lipids to form nascent HDL particles. HDL

24 ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) è una proteina integrale di membrana, responsabile dellefflusso del colesterolo dalle cellule e…...espleta unazione i ii immunomodulante!!!

25 Cholesterol uptake LDL e oxLDL Uptake di oxLDL: recettori Scavenger Signaling pathway associato a Recettori Scavenger

26 LDL/LDL-R LDL LDL …Le LDL sono tutte uguali?

27 ox oxLDL (LDL modificate) LDL Danno da Radicali Liberi (ROS,RNS): -respirazione cellulare(mitocondriale) - ossidasi microsomiali -catalizzatori chimici (metalli di transizione) -prodotti di PMN (NADPH ossidasi, Mieloperossidasi) -introito alimentare di lipidi ossidati (termo-ossidazione:frittura)

28 ossidazione Perossidazione del colesterolo

29 LDL Acido linoleico (C18) Acido 9-idrossi- octadecadienoico Tirosina nitrotirosina Glucosio SteroliossiSteroli Formazione di AGE Cross Links oxLDL

30 Site of chemical modifications in in vivo LDL and ONOO-treated LDL The secondary structure of the apoB-100 is showed. We show the chemical modifications in LDL and ONOO-treated LDL.

31 Gli AGE sono in grado di modificare i gruppi aminici primari dei fosfolipidi e delle apo(B-100) delle lipoproteine a bassa densità (LDL). Gli AGE, inoltre, sono in grado di iniziare una serie di reazioni ossidative che promuovono la generazione di LDL ossidate.

32 Treatment of native LDL with ONOO - resulted in extensive tyrosine nitration, accumulation of lipid peroxides, and loss of α -helical structure and, as a corollary, formation of oxLDL : Nitrotyrosine and lipid peroxide accumulation are synergistically responsible for unfolding of α - helices inherent in LDL formation. Glucose reacts nonenzymatically with the amino groups of proteins to form stable, cross-linking adducts called advanced glycation end products or AGEs. tyrosine nitration lipid peroxides cross-linking

33 Self o NON-SELF ? (thats the question!) SELF ALTERATO!!

34 Le LDL modificate sembra che possano essere riconosciute da recettori specifici a livello delle cellule endoteliali e dei monociti/macrofagi e sono in grado quindi di indurre modificazioni fenotipiche di tipo secretorio e proliferativo. Pattern di espressione genica (geni della flogosi) Citochine proinfiammatorie Molecole di adesione cellulare oxLDL Motilità dei macrofagi sulla parete arteriosa Azione chemiotattica induce IMMUNOGENA

35 le LDL modificate (LDL) non vengono riconosciute dal recettore fisiologico LDL-R le LDL modificate (oxLDL) non vengono riconosciute dal recettore fisiologico LDL-R come vengono internalizzate? OOH ROOH.oo ONOO-

36 SCAVENGER Recettori SCAVENGER scavenger Per Recettori scavenger(=spazzini) sintende un gruppo di recettori capaci di legare le LDL modificate(ossidate,acetilate). Sono prevalentemente espressi sui macrofagi( immunità innata) Modified proteins Oxidised LDL Acetylated LDL AGE- proteins Apoptotic cells Phosphatidyl serine Bacterial components LPS Lipoteichoic acid

37 Scavenger receptor class A: -Trimers -collagene-like domain -cysteine-rich domain Scavenger receptor class B: -two transmembrane domains -situated in specific plasma membrane microdomains, the caveolae (lipid rafts). They preferentially bind modified LDL by acetic acid and oxidized LDL CD36 LOX-1 : lectin-like oxidized low- density lipoprotein receptor-1 LOX-1 : lectin-like oxidized low- density lipoprotein receptor-1

38

39 The binding of oxidized low density lipoprotein(LDL) to CD36 is mediated in part by oxidized phospholipids that are associated with both the lipid and protein moieties of the lipoprotein. endocitosi Ossisteroli Oxidized fatty acid

40 CD36-dependent signaling pathway Dominio di omologia CD4/CD8: CysXCysX 5lys (CXCX 5K) Dominio di omologia CD4/CD8: CysXCysX 5lys (CXCX 5K) LYN ATP Proteina adattatrice P P P Grb2- SoS Ras_GDP GTP MAPK Fos Fos Vav Rac-GDP GTP GTP JNK ATP Jun Jun P AP-1AP-1

41 LYN Proteina adattatrice P P P PLC PKC IKK P NF- κB IκBIκB P

42 Fos Jun P NF- κB Activator Protein – 1 (AP-1) Fas IL12 MMPs (MMP1, MMP2, MMP3, MMP13) Fas IL12 MMPs (MMP1, MMP2, MMP3, MMP13) TNFα iNOS Fas MMPs CD40 IL-1 IL-6,IL-12 CCL2(MCP-1) TNFα iNOS Fas MMPs CD40 IL-1 IL-6,IL-12 CCL2(MCP-1) Induzione della Flogosi Innesco dei meccanismi effettori dellimmunità innata

43 CD36 oxLDL Geni della Flogosi Uptake delle oxLDL Induzione di un nuovo profilo trasduttivo Uptake delle oxLDL Induzione di un nuovo profilo trasduttivo LDL

44 Macrophage response to oxidized lipid-loading: A PATHWAY FOR CHOLESTEROL EFFLUX

45 PPARγ-LXRα-ABCA1 Pathway oxLDL Acidi grassi ossidati ossisteroli PPARγ Attiva la trascrizione di LXRα RXR α CD36 (Meccanismo a feedback) Foam Cells

46 ABCA1 Sembra,quindi,che il rilascio di colesterolo e lipidi ossidati dalle oxLDL provveda alla clearance dei lipidi attraverso la trascrizione attivata di ABCA1 Efflusso di colesterolo (Apo-A1)

47 CD36 oxLDL Geni della Flogosi Uptake delle oxLDL Induzione di un nuovo profilo trasduttivo (profilo infiammatorio) Uptake delle oxLDL Induzione di un nuovo profilo trasduttivo (profilo infiammatorio) Upregulation di ABCA1 PPARγ LXRα ABCA1 APO- A1 HDL

48 ABCA1 as an anti anti- inflammatory receptor

49 APO-A1 P

50 ESPERIENZE

51 Prima Esperienza (FIG.1,A-D) A n established line of Syrian hamster cells, descended from a clone (Clone 13) isolated by Stoker and McPherson from an unusually rapidly growing primary culture of new born hamster kidney tissue. Usually described as fibroblastic, although smooth muscle like in that they express the muscle intermediate filament protein desmin. Widely used as a viral host, in studies of oncogenic transformation and of cell physiology.kidneyfibroblastic Modello sperimentale: BHK-Cells TRANSFEZIONE Introduzione di acidi nucleici (DNA,RNA) in cellule eucariotiche. Si avvale delluso di genomi virali ingegnerizzati(gene Target,sequenze di integrazione), sfruttando la capacità del virus di trasmettere DNA. (in genere retrotrascrizione tramite Retrovirus)

52 ABCA1 APO-A1 ABCA1 C JAK2 IP IB JAK2 ABCA1 P-JAK2 JAK2 P-JAK2 A B D immunoblotting immunoprecipitazione BHK- cells RU-486

53 Lincubazione di BHK-cells che esprimono ABCA1 con APO-A1 induce un aumento di Fosfo-JAK2 (N.B. JAK2 si autofosforila,attivandosi, e fosforila un residuo tirosinico su ABCA1)-(Fig.1A) Laumentata fosforilazione di JAK2 non è direttamente correlata ad un aumento della propria espressione genica: la forma fosforilata,secondo un meccanismo APO-A1/ABCA1-dipendente è relativa ad un pool citoplasmatico preesistente (Fig.1B) Limmunoprecitpitazione di ABCA1 e la rivelazione di JAK2 tramite anticorpi anti-JAK2,(immunoblotting),rivela uninterazione tra ABCA1 e JAK2(non fosforilata),non quantitativamente correlabile con il pretrattamento con APO-A1,suggerendo che tale interazione sia costitutiva. (Fig.1C) La forma fosforilata di JAK2,tuttavia,viene rivelata(con anticorpi anti JAK-2-Fosforilato), solo successivamente a pretrattamento con APO-A1, suggerendo che lattivazione di JAK2 (P-JAK2) sia da imputarsi allinterazione di APO-A1 con ABCA1. (Fig.1D)

54 *AG490:potente inibitore della tirosin-chinasi JAK2; permea attraverso la membrana plasmatica. Le BHK-Cells che esprimono ABCA1sono state incubate con APO-A1. Il pretrattamento con AG490*(+) è stato operato 30minuti prima. Gli immunoprecipitati(ABCA1) sono stati trattati con anticorpi anti-fosfotirosina. Plasmide vuoto(controllo negativo)

55 La tirosin-chinasi JAK2 è responsabile della fosforilazione di ABCA1. Inibitori di JAK2(es.AG490) rivelano,infatti,una minore (ma non nulla)fosforilazione di ABCA1,definibile come basale. Lattivazione di JAK2 incrementa di due volte lo stato di fosforilazione di ABCA1

56 ApoA-I stimulates ABCA1-bound JAK2 autophosphorylation and ABCA1 tyrosine phosphorylation XII P APO-A1 JAK2 P P -Tyr

57 JAK2..e STATs? STATSTAT STAT: Signal Transducers and Activator of Transcription Janus (fattori trascrizionali attivati da Chinasi della famiglia Janus) STATSTAT STAT: Signal Transducers and Activator of Transcription Janus (fattori trascrizionali attivati da Chinasi della famiglia Janus)

58 2 a esperienza (Fig.2) Modello sperimentale -Linea cellulare J774 (macrofagi murini): modello Biologico -BHK-cells Induttori di ABCA1 (N.B.:in assenza dellinduttore,ABCA1 non si rileva!) - TO :agonista non steroideo di LXR,permeante la membrana (in J774,acLDL overnight) -Mifepristone / RU-486 (in BHK-cells)

59 (/P-STAT 5) AG409

60 Lattivazione di JAK2 lascia prevedere che associato ad ABCA1 sussista un meccanismo di trasduzione tramite il sistema JAK/STAT. Lincubazione con di BHC-cells non transfette non rivela nessun effetto sulla fosforilazione di STAT1,3,5. Tuttavia sia nel modello sperimentale(BHC-Cells transfette cn ABCA1) sia in quello biologico di macrofagi carichi di colesterolo (J774,trattate cn TO che induce ABCA1),si determina un aumento di P-STAT3 ma solo dopo preincubazione con APO-A1. Tale effetto non si osserva per STAT1,5. Linterazione di APO-A1,induce il reclutamento di STAT3 nonché della tirosin-chinasi-JAK2. STAT3 è fosforilata da JAK2 ApoA1 interactions with ABCA1- expressing cells increases phosporylation of ABCA1- associated STAT3 ApoA1 interactions with ABCA1- expressing cells increases phosporylation of ABCA1- associated STAT3

61 I domini citoplasmatici di legame a STAT3(docking sites) presentano una sequenza aa altamente conservata YXXQ (-Tyr-X-X-Gln-) YXXQ (-Tyr-X-X-Gln-) aa aa Tyr Glu Gly Gln Tyr Cys Pro Gln Y E G Q Y C P Q ̴ NBD1 ̴ NBD2 G G gp130 ( prototypic STAT3 docking site ) gp130 ( prototypic STAT3 docking site )

62 3° esperienza Modello sperimentale: transfected BHK-cells ( Mifepristone; [ 3 H]colesterolo) ABCA1-WT ABCA1 Y924F ABCA1 Y1990F ABCA1 Y924/1990F ABCA1-WT ABCA1 Y924F ABCA1 Y1990F ABCA1 Y924/1990F Tyr 924, 1990 Phe Mutagenesi sito-diretta (QuikChange XL SiteDirected Mutagenesis Kit) Mutagenesi sito-diretta (QuikChange XL SiteDirected Mutagenesis Kit)

63 Mutagenesi sito-specifica mutagenesi sito diretta o mutagenesi oligonucleotide diretta.è una tecnica di biologia molecolare in cui una mutazione è creata in modo selettivo in un particolare sito di una molecola di DNA, solitamente un plasmide. La tecnica differisce quindi dalla normale mutagenesi in cui vengono indotte mutazioni che però si distribuiscono in modo casuale nella sequenze di DNA. In genere la mutagenesi sito specifica richiede la conoscenza della sequenza di tipo selvatico (wild type) del gene da mutagenizzare. La mutazione inserita potrà essere una sostituzione di base o una inserzione o delezione di nucleotidi rispetto alla sequenza originaria.La tecnica è talvolta chiamata anche mutagenesi sito diretta o mutagenesi oligonucleotide diretta. DNAsi di restrizione per DNA metilato

64 Fig.3

65 La mutazione sito diretta su ABCA1 dei siti di interazione di STAT3 ha prodotto i risultati attesi:le cellule Y924P,Y1990P e Y924/1990P mostrano una marcata riduzione nella fosforilazione di STAT3 APO-A1-indotta;essa è abolita nelle cellule a doppia mutazione,suggerendo un meccanismo di cooperazione tra i due docking-sites(Fig.3B) La co-immunoprecipitazione di ABCA1 e STAT3 si osserva in cellule WT e non in cellule a doppia mutazione(Y924/1990P),implicando il ruolo determinante di tali siti di legame(aa924,aa1990) nel reclutamento APO-A1 dipendente di STAT3(Fig.3C) Il reclutamento di STAT3,inoltre,sembra essere non richiesto per lattività di trasporto del colesterolo da parte del trasportatore ABCA1(Fig.3A) Mutating candidate STAT3 docking sites in ABCA1 reduces apoA-I-stimulated STAT3 phosphorylation and ABCA1 association without affecting cholesterol efflux Mutating candidate STAT3 docking sites in ABCA1 reduces apoA-I-stimulated STAT3 phosphorylation and ABCA1 association without affecting cholesterol efflux

66 XII P APO-A1 P -Tyr (924,1990) JAK2 P P-STAT3 P

67 4° Esperienza Modello biologico(macrofagi carichi di colesterolo): J774(+colesterolo derivato da acLDL) + TO901317(LXR-agonist ABCA1) Pre-Incubazione con/senza APO-AI (3h) Incubazione con/senza LPS (3h) [=attivazione cellulare,profilo proinfiammatorio] NF-κB IL-6 TNF-α IL-1β (RT-PCR) IL-6 TNF-α IL-1β (RT-PCR)

68 Fig.4 Linterazione di APO-A1 riduce leffetto stimolatorio(proinfiammatorio) dellLPS

69 RNAi: silenziamento genico a livello post-traduzionale siRNAi is a form of post-transcriptional gene regulation in which double- stranded RNA (dsRNA) molecules called small interfering RNA (siRNA) mediate sequence specific degradation of homologous mRNA. mSTAT3: 5-AAGGCCGTGGTGGTGCGTGAGAAA-3 Scramble siRNA: 5-GCGTGGAAGCGGAGCATGATA-3

70 siRNA J774 MP 100nM 50nM 100nM MP: mouse peritoneal macrophages( +acLDL ) STAT3-IB 60% 80%

71 Linterazione di APO-A1 con differenti linee macrofagiche che esprimono ABCA1, deprime la produzione di citochine proinfiammatorie attraverso il sistema JAK2/STAT3 Linterazione di APO-A1 con differenti linee macrofagiche che esprimono ABCA1, deprime la produzione di citochine proinfiammatorie attraverso il sistema JAK2/STAT3 Inbitore solubile di STAT3 MP SH2-DOMAIN

72 5° ESPERIENZA Modello in-vivo: Topi C57B/6 che non esprimono STAT3 ( ˜ macrofagi) C57Black/6 KnockOut (ricombinasi CRE-Lox) KnockOut (ricombinasi CRE-Lox) Cholesterol-loaded macrophages from WT or myloid-specific STAT3 KO mice were pretreated for 3h with apoA-I or 10 ng/ml IL-10 and incubated for 3h with LPS, and cytokine mRNA levels were measured.

73 Knock-OUT:metodo Cre-Lox Il metodo Knock-out condizionale più usato è il metodo Cre-Lox, che si basa sullazione della Ricombinasi Cre, che è un enzima che taglia un frammento di Dna inserito tra due siti LoxP: la ricombinasi fa avvenire lo scambio di filamenti (ricombinazione omologa) tra due strutture Lox allineate originando delezione del frammento interposto. LysM STAT-3 Macrofagi (STAT3 -/- ) STAT3 flox/flox /C57BL/6 mouseLys-M-Cre/C57BL/6 mouse

74 PM= macrofagi peritoneali BMM= macrofagi del midollo osseo WBC= cellule della serie bianca(leucociti) Fig.5 Il K.O. di STAT3 chiaramente deprime lazione antiinfiammatoria di APO-A1, supportando lidea di un coinvolgimento centrale di STAT3 (APO-A1 mimics IL-10 in suppressing inflammatory cytokine production) Il K.O. di STAT3 chiaramente deprime lazione antiinfiammatoria di APO-A1, supportando lidea di un coinvolgimento centrale di STAT3 (APO-A1 mimics IL-10 in suppressing inflammatory cytokine production)

75 …ABCA1 -/- ? Labilità di APO-A1 di sopprimere la produzione di citochine pro- infiammatorie (TNF-α,IL-6) è abolita dal K.O. di ABCA1, Indicando che ABCA1 è primariamente richiesto per lattività di APO-A1. Labilità di APO-A1 di sopprimere la produzione di citochine pro- infiammatorie (TNF-α,IL-6) è abolita dal K.O. di ABCA1, Indicando che ABCA1 è primariamente richiesto per lattività di APO-A1.

76 P APO-A1 JAK2 P P P-STAT3 P P Dimero P-STAT3 Il sistema trasduttivo APO- A1/ABCA1 e IL-10/IL-10R è del tutto analogo! ( JAK/STAT3)

77 STAT3 NETWORK IL-10 family: IL-10 IL-20 IL-22 IL-10 family: IL-10 IL-20 IL-22 APO-A1 APO-A1 BIRC5 (survivin) HSP-90 MCL1 (BCL 2 family) TNF-α IFN-γ IL-1 IL-6 Oncogene Risoluzione dellinfiammazione

78 CD36 oxLDL Geni della Flogosi Uptake delle oxLDL Induzione di un nuovo profilo trasduttivo (profilo infiammatorio) Uptake delle oxLDL Induzione di un nuovo profilo trasduttivo (profilo infiammatorio) Upregulation di ABCA1 PPARγ LXRα ABCA1 APO- A1 HDL Efflusso del colesterolo Attività antiinfiammatoria STAT-3

79 Bilancio Colesterolo LDL oxLDL LDL-R Recettori Scavenger Acidi Grassi ossisteroli PPARγ LXR ABCA1 PAMP RESOLUTIONRESOLUTION Dinamiche di una risposta infiammatoria Centralità nel ruolo dei macrofagi

80 OMEOSTASI Segnali proinfiammatori Segnali antiinfiammatori Livelli plasmatici di HDL (colesterolo HDL > 40 mg/dL ) Funzionalità di ABCA1 Livelli plasmatici di LDL (colesterolo LDL <100mg/dl) Ossidanti/antiossidanti Quota di lipidi ossidati

81

82 Pathophysiology

83 Gene variants Over 70 mutations in ABCA1 have been identified in subjects with low plasma HDL levels ABCA1 GENE 1 2 3

84 ABCA1 and Cardiovascular disease Numerous population studies have shown an inverse relationship between plasma HDL levels and CVD risk..its clear that the relative activity of ABCA1 plays a role! Subjects with loss-of-function homozygous or heterozygous mutations in ABCA1 have a 4-6 fold higher than normal incidence of CVD,which applies equally to both men and women. Accumulation of sterol-laden foam cells in the artery wall and inflammation are early events in formation of atherosclerotic lesions.Thus,ABCA1s role in cholesterol export and anti- inflammation suggests its impact on ATHEROGENESIS.

85 ATEROSCLEROSI LATEROSCLEROSI è una patologia delle grosse e medie arterie, caratterizzata da lesioni infiltrate di lipidi,definite PLACCHE ATEROMATOSE, che si sviluppano sulla superficie interna dei vasi.

86 Ateroma ( o placca fibrolipidica)

87 Inflammation & Atherosclerosis Numerose e controverse sono le ipotesi formulate nel tentativo di identificare meccanismi responsabili di comparsa e progressione dellaterosclerosi. Al momento, la teoria più accreditata è quella infiammatoria di Russel Ross (The response to injury),che ipotizza nellinfiammazione il meccanismo mediante il quale i fattori di rischio cardiovascolare evocano una risposta riparativa da parte della parete vascolare,risposta che inizia con lattivazione endoteliale (alterazione meramente funzionale), per poi progredire e stabilizzarsi con la formazione della placca aterosclerotica,vera e propria alterazione morfologica. Le basi biologiche dellinfiammazione applicata allaterosclerosi hanno fornito una nuova chiave di lettura dei meccanismi fisiopatologici,sottolineando il ruolo del RECLUTAMENTO LEUCOCITARIO.

88

89 IFN-γ e LDL ox

90 INFIAMMAZIONE CRONICA Durata relativamente lunga (giorni - anni) Accumulo di linfociti e macrofagi Caratterizzata dalla infiltrazione di linfociti e macrofagi, da proliferazione vascolare e formazione di tessuto fibroso Le cellule predominanti sono, in genere, quelle mononucleate (macrofagi, linfociti) ATEROSCLEROSI=Patologia infiammatoria cronica multifattoriale

91 Citochine & Aterosclerosi Macrofagi e linfociti secernono una serie di mediatori,tra cui le CITOCHINE, responsabili di amplificare e perpetuare il processo infiammatorio fino alla rottura della placca a livello del cappuccio fibroso,come risultato dello sbilanciamento tra fattori pro- e anti-infiammatori (perdita del BALANCE CITOCHINICO). Non a caso, i pz aterosclerotici presentano elevati livelli sierici di PCR e di citochine pro- infiammatorie (IL-1,IL-6,IFN-γ,etc.)

92 CITOCHINE Mediatori polipeptidici che fungono da segnali di comunicazione fra le cellule del sistema immunitario, non antigene specifici, e fra queste e diversi organi e tessuti. Classificazione funzionale delle Citochine Emopoietiche (IL-3,Il-7,IL-11..) Citochine della Immunità specifica (IL-2,IL-12,IL-23..) Citochine infiammatorie Primarie (IL-1,TNF,IL-6) Citochine anti- infiammatorie o immunosoppressive (IL-10,TGF-β) Citochine infiammatorie Secondarie (chemochine)

93

94 La composizione cellulare delle placche vulnerabili è caratterizzata da infiltrati di linfociti Th1 e macrofagi,entrambi attivati dalle LDL ossidate,le quali possono stimolare i monociti a produrre fattori pro- infiammatori e citochine. LDL ox

95 IFN-γ IFN-γ è la principale citochina per lATTIVAZIONE CLASSICA dei macrofagi e svolge importanti funzioni sia nellimmunità innata sia nelle risposte cellulo- mediate specifiche contro i microrganismi intracellulari. IFN-γ signalling pathway

96 Attività biologiche di IFN-γ

97 IFN-γ e ABCA1 IFN-γ X IFN-γ inibisce lespressione di LXR,determinando così DOWN REGULATION DI ABCA1 e conseguente diminuzione dellefflusso di colesterolo dai macrofagi: IFN-γ EFFETTO PRO-ATEROGENICO

98 PROLIFERATION

99 Lespressione della citochina anti-infiammatoria IL-10 è stata rilevata negli ateromi umani e suoi alti livelli sono stati associati a significativa riduzione di morte cellulare ed espressione di iNOS. IL-10 Inibizione di NFkb e delle metalloproteasi TNF-α e COX-2 Inibizione apoptosi monociti/macrofagi e soppressione della funzione macrofgica Inibizione produzione di citochine pro-infiammatorie Linfociti Th1 Linfociti Th2 Si può prevedere che la misurazione della concentrazione plasmatica delle citochine pro-infiammatorie nei pz aterosclerotici assumerà nel futuro unimportanza clinica sempre maggiore,che permetterà di individuare terapie mirate per determinati sottogruppi di pazienti.

100 LATEROSCLEROSI si sviluppa anche in soggetti che presentano livelli perfettamente normali di colesterolo e di lipoproteine.Alcuni dei fattori che predispongono allaterosclerosi sono: (1) inattività fisica e obesità; (2) Diabete mellito; (3) Ipertensione; (4) Iperlipidemia; (5) Fumo. Questi fattori predisponenti interagiscono tra loro in modo sinergico nellaumentare Il rischio di aterosclerosi.

101 ABCA1 is highly expressed in islet β-cells, where its selective ablation increases their cholesterol content.These islets have reduced glucose- stimulated insulin secretion,suggesting that the increased cell cholesterol caused by the absence of ABCA1 impairs islet function. rosiglitazone Activation of genes in insulin-responsive cells Rosiglitazone improves glucose tolerance,but these beneficial effects disappear when ABCA1 is ablated in β-cells.These findings suggest that β-cells ABCA1 contributes to The insulin sensitizing effects of thiazolidinediones.

102 Difetti di ABCA1 potrebbero essere implicati nelle complicazioni microvascolari del diabete mellito di tipo 2. Due caratteristiche del diabete e della sindrome metabolica sono eccesso di glucosio e acidi grassi. Prolonged hyperglycemia AGE Distruzione diretta di ABCA1 nei macrofagi Fosforilazione di ABCA1 Degradazione di ABCA1

103 Conclusioni ABCA1 activity Previene laterosclerosi inibendo la formazione di foam cells e sopprimendo linfiammazione nei macrofagi Livelli plasmatici delle HDL cardioprotettive nel fegato Stimola la produzione di insulina nelle β-cellule ABCA1 target terapeutico contro aterosclerosi e diabete!

104 Pharmacology The activity of the ABCA1 pathway can be modulated at multiple levels. Transcription Agonisti di LXR inducono la trascrizione di ABCA1 e forniscono un ulteriore vantaggio, inducendo altre proteine coinvolte in alcuni trasporto del colesterolo: steps del trasporto del colesterolo: ABCG1ABCG1 efflusso di colesterolo alle HDL APO-EAPO-E efflusso di colesterolo dai macrofagi in modo sia dipendente che indipendente da ABCA1 ABCG5 e ABCG8ABCG5 e ABCG8 escrezione del colesterolo endogeno e di quello esogeno nella bile. RISCHI: gli agonisti di LXR inducono lespressione della ACIDO GRASSO SINTASI e di un fattore trascrizionale detto Sterol Regulatory Binding Protein-1c (SREBP-1c) che attiva geni di diversi enzimi coinvolti nella biosintesi degli acidi grassi. ipertrigliceridemia

105 Agonisti di RXR, il partner eterodimerico di LXR,stimolano anchessi lespressione di ABCA1. Rischi : il limite maggiore di questa classe di agonisti è che RXR forma eterodimeri attivi con molti altri recettori nucleari che controllano diversi pathways metabolici.Tuttavia,gli attivatori di RXR inducono ABCA1 senza influenzare i geni target di LXR e ciò rende il sistema RXR il possibile bersaglio di una terapia selettiva. Post-transcription Agonisti che stimolano la trascrizione di ABCA1hanno unefficacia limitata,giacchè i livelli e lattività di ABCA1 sono regolati soprattutto a livello post-trascrizionale. La ricerca,attualmente,mira allo sviluppo di peptidi e altri piccoli agonisti che interagiscano con ABCA1.Finora,sono stati prodotti alcuni peptidi dotati di α-elica anfipatica di 18- e 37- aa che mimano le interazioni della apolipoproteine con ABCA1. Un potenziale vantaggio di questi peptidi è che si possono somministrare per via orale e hanno una lunga emivita. Uno svantaggio è che essi hanno effetti detergenti non specifici sulle membrane fosfolipidiche e possono accumularsi nei tessuti e danneggiare le cellule. Studi recenti supportano lipotesi che peptidi e molecole apolipoproteino-mimetiche potrebbero essere validi agenti terapeutici nel trattamento della CVD e della sindrome metabolica.

106 …in conclusione…

107 LDL e oxLDL Yin e Yang sono opposti Lo Yin e lo Yang sono interdipendenti Lo Yin e lo Yang si consumano e si sostengono a vicenda Lo Yin e lo Yang possono trasformarsi l'uno nell'altro LDL e oxLDL YIN e YANG

108 BUONOMO BARBARA TRAPANI DARIO

109 Tang,Oram et al.The macrophage cholesterol exporter ABCA functions as an anti-inflammatory receptor. The Journal of Biological Chemistry,200 Cellular and Molecular Immunology, Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman Textbook of Medical Physiology, 11th Edition, By Arthur C. Guyton, MD and John E. Hall, PhD Chawla et al.A PPARγ-LXR-ABCA1 Pathway in Macrophages Is Involved in Cholesterol Efflux and Atherogenesis.Molecular cell, Volume 7, Issue 1, 1 January 2001, Correale,Di Biase.Ruolo delle citochine proinfiammatorie nei meccanismi patogenetici dell'aterosclerosi Coronarica.dipartimento di cardiologia,università di Foggia. Dean et al.The Human ATP-Binding Cassette (ABC) Transporter Superfamily. Genome Res : Navab et al.Peptide Mimetics of Apolipoproteins Improve HDL Function. J Clin Lipidol May ; 1(2): 142–147. Rahaman et al.A CD36-dependent signaling cascade is necessary for macrophage foam cell formation. Cell Metab September ; 4(3): 211–221.

110 Remaley,Brewer, et al.Synthetic amphipathic helical peptides promote lipid efflux from cells by an ABCA1-dependent and an ABCA1-independent pathway. Journal of lipid research :2003, vol. 44, n o 4, pp Suzuki H. et al.A role for macrophage scavenger receptors in atherosclerosis and susceptibility to infection. Nature Mar 20;386(6622): Tang,Oram.the cell cholesterol exporter ABCA1 as a protector from CVD and diabetes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids,Volume 1791, Issue 7, July 2009, Xin-rui Hao,Tang et al.IFN-γ downregulates ABCA1 expression by inhibiting LXRα in a JAK/STAT signaling pathway-depedent manner. Atherosclerosis, 2009, vol. 203, n o 2, Xueweyi,Parks et al.Increased Cellular Free Cholesterol in Macrophage- specific Abca1 Knock-out Mice Enhances Pro-inflammatory Response of Macrophages. J Biol Chem August 22; 283(34): 22930– Young Mi Park et al.CD36 modulates migration of mouse and human macrophages in response to oxidized LDL and may contribute to macrophage trapping in the arterial intima. The Journal of Clinical Investigation.Volume 119 Number 1 January 2009.


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