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L.S. in Scienze e tecnologie alimentari Anno Accademico 2008/2009 Corso integrato: Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU) Modulo:

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1 L.S. in Scienze e tecnologie alimentari Anno Accademico 2008/2009 Corso integrato: Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU) Modulo: Chimica analitica strumentale (4 CFU) Giorgio Bonaga GASCROMATOGRAFIA (CAS-3c) Giorgio Bonaga

2 5) INIETTORI PER GC Per campioni liquidi o soluzioni si utilizzano apposite siringhe della capacità di 1-5 l (colonne impaccate) e di 1 l (colonne capillari). Per campioni gassosi si utilizzano siringhe da gas, con pistoni a tenuta e iniettori a valvola rotante con loop di riempimento (come nella LC), della capacità di l. La siringa depone la soluzione in dispositivi detti iniettori ( injector ), la cui geometria e le cui specifiche tecniche ed operative dipendono essenzialmente dal fatto che si operi con colonne impaccate o con colonne capillari. Giorgio Bonaga

3 COLONNE IMPACCATE Il campione viene introdotto nelliniettore ( packed column injector ) con una microsiringa che perfora un setto siliconico (s eptum ). Il gas di trasporto ( carrier gas ), al flusso di esercizio ( flow rate ), lambisce il setto per eliminare ( septum purge ) le sostanze che, alla temperatura delliniettore ( heating block ), potrebbero trasferirsi allinterno della colonna e contaminare il campione. Nel cilindro di vetro ( glass liner ) che lo accoglie, il campione vaporizza. Il gas di trasporto spinge le molecole vaporizzate di solvente e di soluto (nella gascromatografia la fase mobile non partecipa al processo di partizione) allinterno della colonna, nelle quantità esattamente corrispondenti a quelle presenti nel volume di soluzione iniettato. Giorgio Bonaga

4 setto septum riscaldatore heating block ghiera septum cap parete del forno oven wall guarnizione gasket pulizia setto septum purge camera di vaporizzazione glass liner gas di trasporto carrier gas inlet

5 COLONNE CAPILLARI Il campione viene introdotto nelliniettore ( capillary column injector ) con una microsiringa, il cui ago perfora un setto siliconico (nella modalità split/splitless ) o viene accolto nel canale dellago della valvola di introduzione (nella modalità on-column ). In considerazione delle specifiche delle colonne capillari (diametro interno, lunghezza, spessore del liquido di partizione, tipologia del supporto) e delle caratteristiche chimico-fisiche della soluzione iniettata, con le colonne capillari si può operare in tre modi: modalità split (= con divisione) modalità splitless (= senza divisione) modalità on-column (= in colonna) Giorgio Bonaga

6 Il campione è iniettato in una camera di vaporizzazione di vetro ( glass liner ) nella quale volatilizza rapidamente. Il flusso di gas è relativamente elevato e segue 3 vie: una parte ( purge line ) lambisce e pulisce il setto siliconico, una parte ( sample line ) trasporta i vapori di campione nella colonna e una parte ( split line ) trasporta i vapori di campione alluscita del separatore ( splitter ), regolato da una valvola a spillo ( split valve ). Il rapporto tra il flusso del separatore ( split flow ) e il flusso della colonna ( column flow ) si chiama rapporto di splittaggio ( split ratio ) ed è quello che, regolato dalla split valve, determina la quantità di campione che effettivamente entra nella colonna cromatografica. Esempi split flow = 50 ml/min column flow = 2 ml/min split ratio = 2:50 = 1:25 (solo 1/25 del campione iniettato entra in colonna) split flow = 500 ml/min column flow = 0,5 ml/min split ratio = 0,5:500 = 1:1000 (solo 1/1000 del campione iniettato entra in colonna) Capillary Column Injector - Split mode Giorgio Bonaga

7 Lo split mode : è semplice; è applicabile a campioni con un ampio intervallo di concentrazioni dei soluti, ma non a bassa concentrazione; produce picchi normalmente di ottima forma; tende a penalizzare i soluti con punti di ebollizione più elevati, a causa della non linearità del processo di splittaggio (ovvero lo split ratio, in realtà, non è costante per tutti i componenti e liniettore opera una sorta di distillazione frazionata che rende poco attendibile la valutazione quantitativa dei soluti); non è facile conoscere il valore reale dello split ratio perché dipende da numerosi parametri: volume iniettato, quantità di soluto, temperatura delliniettore, densità del gas di trasporto, densità del solvente, densità del soluto, ecc.; per le considerazioni precedenti è particolarmente idoneo allanalisi di miscele di soluti con un intervallo ridotto di volatilità (spazi di testa), operando in condizioni isoterme e ad elevate temperature del forno. Giorgio Bonaga

8 split line split valve open carrier gas inlet 3 Giorgio Bonaga sample line 2 [7] [1] purge line 1

9 SPLIT POINT SPLIT RATIO: 1:25-1:1000 column flow: 0,5-2,0 ml/min split flow: ml/min

10 Capillary Column Injector - Splitless mode Il campione è iniettato in una appropriata camera di vaporizzazione di vetro ( glass liner ) con la valvola dello splitter chiusa. Il processo di volatilizzazione del campione, dunque, è progressivo dal punto di iniezione in poi e il trasferimento verso la colonna dei soluti volatilizzati non solo è lento, ma avviene con una miscelazione solvente/soluti. Dopo un certo tempo ( splitless period ), durante il quale rimane aperta solo la purge line, la split line viene riaperta sia per splittare una parte dei soluti che per fare fluire velocemente laltra parte verso la colonna. Per limitare al massimo la perdita di componenti del campione per condensazione sulla parte superiore delliniettore, la temperatura viene mantenuta costante dal setto in giù grazie ad un riscaldatore supplementare. Dato il maggior tempo di permanenza del campione nella camera di vaporizzazione, la temperatura delliniettore in splitless mode (circa 280°C) è inferiore a quella utilizzata in split mode ed anche il flusso del gas di trasporto è inferiore. Durante liniezione la temperatura del forno, invece, deve essere tenuta a valori bassi per facilitare lintrappolamento freddo ( cold trapping ) dei componenti volatili del campione allentrata della colonna ed anche per sfruttare leffetto solvente Giorgio Bonaga

11 ( solvent effect ), cioè un aumento di concentrazione di soluti per condensazione del solvente, se la temperatura iniziale del forno viene selezionata a 10-20°C sotto il punto di ebollizione del solvente. Tutta lefficienza dello splitless mode dipende comunque dalla scelta del flusso del gas di trasporto e dalla durata dello splitless period (cioè il tempo di chiusura della split valve ). Normalmente per un flusso di 2-4 ml/minuto lo splitless period è compreso tra 50 e 90 secondi (per soluti ben separati può essere più lungo). Lo splitless mode : ha maggiore sensibilità e precisione rispetto lo split mode ; è applicabile a campioni a bassa concentrazione di soluti perché si possono iniettare volumi elevati di campione (> 5 l); è applicabile a matrici così dette sporche, cioè non precedentemente purificate per via preparativa; è particolarmente idoneo allanalisi di miscele di soluti basso-bollenti, cioè con tempi di ritenzione molto simili a quello del solvente, per fare in modo che il picco del solvente sia molto stretto e non presenti asimmetria tailing (scodamento). Giorgio Bonaga

12 split line 1 purge line split valve open 2 column line 3 Giorgio Bonaga carrier gas split valve closed split period (50-90 s)

13 miscela generica di composti basso-bollenti split mode splitless mode solvente Giorgio Bonaga

14 Capillary Column Injector - On-column mode La disponibilità di siringhe capaci di iniettare anche frazioni di l (0,2-0,3) ha contribuito alla diffusione di iniettori per capillari che introducono il campione direttamente nella colonna. Gli iniettori on-column non prevedono un setto, ma una valvola di introduzione manuale (a rotazione) che accoglie lago della siringa in un canale dellago. La valvola viene aperta prima dellintroduzione della siringa e richiusa subito dopo la sua estrazione. La miscela di soluti entra nella glass liner con liniettore mantenuto a temperatura ambiente da un flusso di aria fredda; solo successivamente si opera il riscaldamento delliniettore per ottenere levaporazione del solvente e la vaporizzazione dei componenti del campione, che vengono trasportati dal gas dentro la colonna. Il programma termico del forno ideale è di tipo balistico. La modalità on-column è utile nellanalisi di sostanze termolabili in soluzioni diluite, ma è anche la modalità che non discriminando in alcun modo i soluti fornisce lanalisi quantitativa più attendibile. Giorgio Bonaga

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16 6) RIVELATORI PER GC GENERALITA I rivelatori ( detector ) GC forniscono un segnale di tipo integrale o di tipo differenziale. D A t 1 t 2 t 3 t 4 Giorgio Bonaga segnale differenziale (area A proporzionale alla massa del soluto eluito nellintervallo t 4 -t 3 ) segnale integrale (distanza D proporzionale alla massa del soluto eluito nellintervallo t 4 -t 3 )

17 Il segnale integrale produce un cromatogramma cumulativo, rappresentato da una serie di rampe a cui corrispondono i soluti separati dalla colonna, con un ordine che corrisponde al loro ordine di eluizione. Il segnale differenziale produce un cromatogramma rappresentato da una serie di picchi a cui corrispondono i soluti separati dalla colonna, con un ordine che corrisponde al loro ordine di eluizione. RIVELATORI DIFFERENZIALI Sono i più diffusi perché consentono la valutazione diretta della quantità di sostanza rilevata. Sono classificati: 1. rivelatori con risposta in funzione della concentrazione del soluto (TCD) 2. rivelatori con risposta in funzione della massa del soluto (FID, ECD, NPD) Giorgio Bonaga

18 1. La risposta R di un rivelatore differenziale sensibile alla concentrazione del soluto è un picco gascromatografico la cui area A è proporzionale alla concentrazione del soluto rivelato. Larea A del picco è data dallintegrale: in cui: R = k. C (funzione della concentrazione) dove: k = costante di proporzionalità tipica del rivelatore C = concentrazione del soluto rivelato Pertanto: A R t 1 t 2 t Giorgio Bonaga

19 da cui: Conoscendo la dipendenza della concentrazione rispetto il tempo, si può integrare lequazione. Se, in altre parole, consideriamo il picco come una gaussiana perfetta lequazione può essere risolta tenendo conto che: C = costante = massa/volume ( m/V ) Infatti: da cui: Essendo: V = F. t con : F = flusso del carrier gas t = tempo si ottiene: ovvero: In conclusione larea del picco è inversamente proporzionale al flusso del carrier gas. Giorgio Bonaga

20 2. La risposta R di un rivelatore differenziale sensibile alla massa del soluto è un picco gascromatografico la cui area A è proporzionale al flusso di massa del soluto rivelato. Larea A del picco è data dallintegrale: in cui: R = k. (funzione della massa) dove: k = costante di proporzionalità tipica del rivelatore = flusso di massa del soluto rivelato essendo: A R t 1 t 2 t Giorgio Bonaga

21 si ottiene: da cui: A = k. m In definitiva larea del picco è proporzionale al flusso di massa del soluto, indipendentemente dal flusso del carrier gas. RANGE DINAMICO LINEARE Dalla espressione: R è ragionevole porsi una domanda: per quale intervallo di massa è valida ? Questo intervallo, detto range dinamico lineare, esprime la linearità della risposta del rivelatore in funzione della variazione di quantità di soluto introdotto (a flusso costante di carrier gas ) ed è una delle specifiche tecniche più importanti dei rivelatori GC perché correla lattendibilità della risposta del rivelatore ad un intervallo di concentrazione dei soluti.. Diagrammando la forma logaritmica dellespressione si ottiene un andamento lineare con pendenza unitaria (bisettrice) e con intercetta pari a log K. Giorgio Bonaga

22 Range dinamico lineare di un FID in funzione della massa del soluto Risposta del FID massa di soluto b = 10 7 a a b c c = 1, b logk Giorgio Bonaga

23 Il rivelatore ideale dovrebbe avere le seguenti caratteristiche: selettività: fornire un segnale soltanto per una classe di soluti (lopposto del rivelatore universale); sensibilità: fornire un segnale ( signal ), anche per ultra subtracce di soluto ( g = 1 fg); basso rumore di fondo: in assenza di soluto il rumore ( noise ) devessere minimo, in modo da ottimizzare il rapporto signal/noise (S/N); risposta elevata: un elevato rapporto signal/noise (LOD e LOQ); range dinamico lineare ampio: la dipendenza della risposta dalla concentrazione o dalla massa è lineare per ampi intervalli di concentrazione o di massa; stabilità: fornire prestazioni costanti nel tempo. Giorgio Bonaga

24 LOD = lowest (amount) detectable È la quantità di soluto che produce un segnale pari a 5 volte (per alcuni autori 2) la deviazione standard (SD) del rumore di fondo, per un mol wt pari a 200 e iniettando 10 l. rumore di fondo SD rumore di fondo segnale analita 5 Giorgio Bonaga

25 FLAME IONIZATION DETECTOR (FID) Il rivelatore a ionizzazione di fiamma si basa sul principio che una fiamma prodotta dal giusto rapporto combustibile (H 2 )/comburente (aria o O 2 ) pirolizza le molecole organiche producendo ioni ed elettroni che possono condurre lelettricità attraverso la fiamma. I due elettrodi collegati al circuito di misura sono lugello stesso della fiamma (anodo +) e il cilindro metallico che lo circonda (catodo -). Tra gli elettrodi è applicata una d.d.p. di circa 300 volt. Se dalla colonna arriva soltanto il carrier gas (inerte), la fiamma produce prevalentemente i radicali liberi dellacqua: 2H 2 + O 2 2H 2 O 3H. +. OH +. O Se il carrier gas trasporta dei soluti organici la fiamma provoca la loro combustione finale a CO 2 e H 2 O, ma la pirolisi intermedia dei soluti organici forma i radicali R. e HC.. Questi ultimi reagiscono con i radicali. O presenti nella fiamma, secondo la reazione: HC. +. O HCO + + e - Giorgio Bonaga

26 La formazione di ioni positivi e di elettroni produce la loro migrazione rispettivamente verso il catodo e verso lanodo, con produzione di un flusso di cariche, cioè di una corrente elettrica capace di fornire un segnale. La risposta del FID non dipende dalla concentrazione del soluto, ma dal numero di atomi di carbonio presenti nella molecola. entrata H 2 entrata aria CHO + ddp = 300 volt segnale + innesco fiamma Giorgio Bonaga

27 C10 2 C11 3 C12 4 C13 5 C14 7 C16 8 C17 9 C18 10 C20 11 C21 12 C22 13 C23 14 C24 15 C25 16 C26 Giorgio Bonaga ANALISI DI UN DIESEL (RIVELATORE FID )

28 CARATTERISTICHE DEL FID selettività: universale (composti organici) sensibilità: g = 1 pg (risposta proporzionale al numero di C) range dinamico: 10 7 stabilità: elevata modalità:distruttiva gas di trasporto:N 2, He temperatura limite:< 400°C esigenze:carrier gas puri e flusso costante I limiti del FID sono la sua scarsa sensibilità verso i gruppi funzionali C=O, -NH2, -OH e limpossibilità di ottenere il segnale elettrico dalle molecole che non possono essere carbonizzate (He, Ne, Ar, Kr, Xe, O 2, N 2, H 2 O, CS 2, H 2 S, SO 2, NO, N 2 O, NO 2, NH 3, CO, CO 2, SiCl 4, SiF 4 ). FLUSSI IMPACCATECAPILLARI carrier gas ml/min 1-2 ml/min idrogeno 30 ml/min 25 ml/min aria600 ml/min 350 ml/min Giorgio Bonaga

29 THERMAL CONDUCTIVITY DETECTOR (TCD) Il rivelatore a conducibilità termica (detto in passato catarometro ) si basa sul principio che un gas, fluendo su un filamento riscaldato, ne abbassa la temperatura rimuovendo parte del calore. La quantità di calore rimosso dipende dal flusso e dalla conducibilità termica del gas che fluisce. In una miscela di gas, pertanto, dipende dalla conducibilità termica di ogni componente (soluti, solvente, gas di trasporto) e dalla pressione parziale di ciascuno di essi. Il corpo del TCD a doppia cella è un blocco metallico di massa ed inerzia termica elevate nel quale sono ricavate due celle. Esso è termostatato ad una temperatura di circa 50°C superiore a quella massima della colonna, in modo da evitare fenomeni di condensazione. Sia nella cella di riferimento che nella cella di misura è alloggiato un filamento di tungsteno (o di leghe tungsteno/renio) riscaldato elettricamente. Il carrier gas attraversa sia la cella di riferimento che la cella di misura, mentre leffluente dalla colonna (carrier gas, solventi e soluti) attraversa soltanto la cella di misura. Giorgio Bonaga

30 zoccolo ceramico Giorgio Bonaga filamenti cella di riferimento cella di misura

31 La resistenza R (in ohm) del filamento varia in funzione della temperatura Lalimentatore elettrico porta la temperatura del filamento da T 0 a T 1 e, al passaggio del carrier gas, che è alla temperatura T 0, si ha un trasferimento di calore per conduzione e per irraggiamento dal filamento (che ritorna a T 0 ) alle molecole del carrier gas (che salgono a T 1 ), ma anche per convezione tra le molecole. Il blocco metallico è costruito in modo che il filamento trasferisca il calore al gas quasi esclusivamente per conduzione (90%). T1T1 T0T0 T0T0 T1T1 conduzione (90%) convezione irraggiamentoT0T0 R 1 = R 0 [1+0,04. (T 1 -T 0 )] Giorgio Bonaga

32 Se il flusso di gas è costante la temperatura del filamento si porta ad un valore di equilibrio (ovviamente dipendente dal valore del flusso) e se la temperatura è costante anche la resistenza elettrica R è costante. Quando il carrier gas trasporta sul filamento un soluto volatilizzato del campione, in teoria ci potrà essere un minore o maggiore trasferimento di calore in funzione del fatto che il soluto abbia rispettivamente una minore o una maggiore conducibilità termica rispetto il carrier gas. In realtà i gas di trasporto impiegati nel TCD sono quelli a più elevata conducibilità termica (H 2 e He, questultimo preferito per problemi di sicurezza e di minore reattività con i soluti) in modo che la presenza di soluti produca un abbassamento della conducibilità termica del carrier gas. Questo effetto produce un aumento di temperatura del filamento che determina un aumento della sua resistenza R, ovvero una diminuzione dellintensità I della corrente. conducibilità termica ( ) (W/cm°K) H 2 = 18, He = 15, N 2 = 2, Ar = 1, Giorgio Bonaga

33 = 10 x 15, watt/cm°K 1, = 5 x 15, watt/cm°K 7, Giorgio Bonaga

34 Le variazioni di conducibilità si misurano indirettamente con il ponte di Wheatstone, un circuito a sei lati e quattro nodi idoneo alla misura di precisione delle resistenze medie. Dei sei lati, uno è costituito dalla resistenza incognita R X, tre da altrettante resistenze di precisione tarate, di cui almeno una variabile, mentre le altre due sono rappresentate da un galvanometro G (sulla diagonale di rivelazione ) e da un generatore V costituito da una pila o da un accumulatore (sulla diagonale di alimentazione ). In un circuito di questo tipo risultano determinati a priori, in base alla polarità della pila, i versi delle correnti nella diagonale di alimentazione e nei quattro lati del quadrilatero,, mentre la corrente nella diagonale di rivelazione può assumere l'uno o l'altro dei due versi oppure annullarsi, a seconda che il potenziale elettrico in B risulti maggiore, minore o eguale a quello in D. Se B = D, il galvanometro G non rileverà alcuna deviazione perché il ponte si trova nella condizione di equilibrio. Nelle condizioni di equilibrio del ponte valgono le seguenti relazioni: I G = 0 ; I 1 = I 4 ; I 2 = I 3 ; V B = V D Poiché in tali condizioni i punti B e D vengono a trovarsi allo stesso potenziale, la caduta di tensione che si ha nella resistenza R 1 eguaglia esattamente la caduta che si ha nella resistenza R 2, e risulta quindi: R 1. I 1 = R 2. I 2 e R X ·I 4 = R 3. I 3 Giorgio Bonaga

35 Dal rapporto tra queste 2 relazioni, ricordando le eguaglianze I 1 =I 4 e I 2 = I 3, si ottiene la condizione di equilibrio del ponte: da cui: Il procedimento per la misura della resistenza incognita si riduce pertanto a variare almeno una delle tre resistenze fino a realizzare la condizione di equilibrio del ponte, la quale è raggiunta quando si osserva che aprendo e chiudendo il tasto TG del galvanometro, questo rimane immobile. Poiché la misura si effettua regolando il ponte in modo da annullare la corrente che attraversa il galvanometro, si dice che il procedimento in questione è un metodo di riduzione a zero. Le due resistenze R 1 ed R 2 di cui interessa sostanzialmente il solo rapporto vengono indicate col nome di lati di proporzione del ponte, mentre la resistenza R 3 viene considerata come lato di paragone. Giorgio Bonaga R1R1 RXRX = R2R2 R3R3 = RXRX R1R1 R2R2 =. R X ( )

36 Giorgio Bonaga Quando dalla colonna fluisce il solo carrier gas le resistenze ohmiche sono bilanciate e i punti B e D si trovano alla stessa tensione. Il ponte è nella condizione di equlibrio e il galvanometro non produce alcun segnale. da cui: dove: V = tensione (in volt) I = intensità della corrente (in ampère) R = resistenza elettrica (in ohm) Quando dalla colonna fluisce il carrier gas con i soluti, la diminuzione di conducibilità termica del gas dovuta ai soluti produce un aumento della resistenza ohmica e, dunque, lo sbilanciamento del ponte. Leffetto è la produzione di un segnale elettrico tra B e D, perché ora i due punti hanno tensioni diverse. Questo segnale viene inviato ad un registratore che produce il gascromatogramma differenziale. V = I. R R = V I

37 TGTG Giorgio Bonaga A R0R0 TATA V0V0 A B R3R3 R2R2 D RSRS RXRX R1R1 I4I4 I2I2 I I1I1 I3I3 I IGIG PONTE DI WHEATSTONE C - VBVB VDVD diagonale di alimentazione diagonale di rivelazione

38 ANALISI DI UNA MISCELA GASSOSA (DETECTOR TCD) 0 5 t (min) Giorgio Bonaga H2H2 O2O2 N2N2 CO CH 4 CO 2

39 CARATTERISTICHE DEL TCD selettività: universale sensibilità: g (10 ng) range dinamico: 10 4 stabilità: buona modalità:non distruttiva gas di trasporto:He temperatura limite:< 450°C esigenze:flusso e temperatura costanti Giorgio Bonaga

40 ELECTRON CAPTURE DETECTOR (ECD) Il rivelatore a cattura di elettroni si basa sulla ionizzazione primaria delle sostanze per emissione di particelle (elettroni veloci) da parte di un debole emettitore, come lisotopo radioattivo 63 Ni. Quando nel detector entra solo il carrier gas (ad esempio Ar) avviene la ionizzazione con formazione di un plasma di elettroni e cationi Ar +, a cui segue la loro migrazione (accelerati da un d.d.p. tra gli elettrodi) rispettivamente allanodo e al catodo. Si genera quindi una corrente elettrica stazionaria allinterno del circuito di misura. 63 Ni placca di oro ANODO + CATODO - 63 Ni d.d.p. + Giorgio Bonaga e Ar

41 e Quando nel detector entra il carrier gas con i componenti del campione separati dalla colonna, se i soluti contengono gruppi elettron-attrattori (alogeni, perossidi, chinoni, nitrogruppi, ecc.), avviene il fenomeno inverso, ovvero una ionizzazione secondaria dei gruppi elettron-attrattori in seguito alla cattura di una frazione dei numerosi elettroni presenti nel circuito di misura. La conseguenza è una diminuzione della corrente che è, ovviamente, il segnale rivelatore del soluto. Gli anioni che si formano hanno una mobilità ridotta verso lanodo (rispetto quella degli elettroni verso lo stesso anodo) e dunque una conducibilità elettrica talmente modesta da non alterare il valore della diminuzione di corrente elettrica dovuta alla cattura degli elettroni. R-Cl ANODO + CATODO - d.d.p. - Giorgio Bonaga

42 elettrodo centrale (ANODO) pareti di Pb + elettrodo esterno (CATODO) 63 Ni LECD è costituiito da un corpo con pareti di piombo, non permeabile alle radiazioni. Lelettrodo centrale cilindrico (anodo + ) è circondato da un cilindro cavo la cui parete interna è in parte rivestita da una placca di oro sulla quale è stato elettrodepositato il 63 Ni, la parete esterna del rivelatore è laltro elettrodo (catodo - ). Tra i due elettrodi è applicata una d.d.p. che genera una corrente elettrica costante (D.C.). cilindro cavo d.d.p. (D.C.) Giorgio Bonaga

43 In realtà la ionizzazione e la cattura degli elettroni è un fenomeno più complesso: i prodotti della ionizzazione primaria (Ar + ) e della ionizzazione secondaria (gli anioni dei soluti contenenti sostituenti elettron-attrattori, ma che non incidono sul bilancio della corrente elettrica), accelerati dagli impulsi del campo elettrico applicato in modo continuo (DC = direct current ), prima di scaricarsi sugli elettrodi, acquistano energia cinetica e producono una serie di collisioni che determinano una ionizzazione terziaria di parte dei soluti eluiti dalla colonna, con produzione di altri ioni positivi ed altri elettroni. Il saldo di tutti questi fenomeni è la diminuzione di corrente elettrica per effetto della ionizzazione secondaria dei soluti, ma anche un aumento di corrente per effetto della ionizzazione terziaria. Per evitare questo scarso rendimento del rivelatore in termine di range dinamico, la soluzione logica è quella di evitare gli effetti della ionizzazione terziaria. Questo obiettivo si raggiunge operando 1) sulla corrente elettrica o 2) sulla composizione del carrier gas. Nel primo caso si tratta di trasformare la corrente continua (DC) - che accelera tutti gli ioni positivi e negativi presenti nel rivelatore - in una corrente pulsata ( pulsed current = PC) a modulazione di frequenza. La durata dellimpulso e l intervallo degli impulsi sono scelti in modo da evitare laccelerazione verso gli elettrodi di tutti gli ioni prodotti dalla ionizzazione terziaria. Nel secondo caso al carrier si aggiunge una sostanza pulitrice ( scavenger ) che reagisce con gli ioni positivi prodotti dalla ionizzazione terziaria (ad esempio, Ar + 5% di CH 4 ).

44 Modulazione di frequenza: durata degli impulsi e intervallo degli impulsi di accelerazione in P.C. CATODO - scavenger (5% in Ar) CH 4 s s Effetti delluso di uno scavenger sugli ioni positivi accelerati verso il catodo Giorgio Bonaga

45 ANALISI DI ACIDI ALO-ACETICI IN ACQUA (RIVELATORE ECD) Giorgio Bonaga CAA= acido cloroacetico BAA= acido bromoacetico DCAA= acido dicloroacetico 2,2-DCPA= acido 2,2-dicloropropanoico TCAA= acido tricloroacetico BCAA= acido bromocloroacetico DBAA= acido dibromoacetico BDCAA= acido bromodicloroacetico CDBAA= acido clorodibromoacetico TBAA= acido tribromoacetico

46 CARATTERISTICHE DELLECD selettività: elevata sensibilità: g = 1 pg range dinamico: 10 3 stabilità: moderata modalità:non distruttiva gas di trasporto:N 2 o Ar (+ 5% CH 4 ) temperatura limite:< 350°C esigenze:carrier gas purissimo Giorgio Bonaga

47 e NITROGEN PHOSPHORUS DETECTOR (NPD) Il rivelatore azoto/fosforo, si basa su una ionizzazione di fiamma (tipo FID) in presenza di sali alcalini (silicato di Rb o di Cs). d.d.p. e T fiamma = costanti CN d.d.p. R Giorgio Bonaga Rb ee

48 NellNPD, detto anche rivelatore a emissione termoionica ( Thermoionic Emission Detector = TED), la fiamma vaporizza e ionizza il Rb del silicato, con formazione di ioni Rb + ed elettroni. Gli ioni Rb + migrano verso il catodo, dove si scaricano e riformano il sale, mentre gli elettroni sono attratti dallanodo. Se la d.d.p. tra i due elettrodi e la temperatura della fiamma sono costanti, si realizza un equilibrio: Rb Rb + + e - a cui corrisponde una corrente elettrica costante tra i due elettrodi. Quando nel rivelatore entrano i soluti che eluiscono dalla colonna, se alcuni di essi contengono degli atomi di N, di P o di alogeni, vengono decomposti dalla fiamma e formano delle specie radicaliche (CN.,. PO2, CX. ). Questi radicali reagiscono selettivamente con gli ioni Rb + presenti nella fiamma, sottraendoli allequilibrio di ionizzazione del silicato di Rb. Per ripristinare questo equilibrio il sistema ricorre ad unulteriore vaporizzazione e ionizzazione del silicato di Rb, con formazione di nuovi elettroni. Il saldo netto di questi processi è, dunque, un aumento della corrente elettrica nel circuito, cioè il segnale che rivela i soluti. Giorgio Bonaga

49 LNPD è sostanzialmente uguale al FID; le uniche varianti sono la presenza di un filamento elettrico riscaldato sul quale è depositata una sferetta di silicato di Rb (o di Cs) e lelettrodo collettore degli elettroni collocato al di sopra del sale alcalino. entrata H 2 entrata aria ddp segnale + innesco fiamma elettrodo collettore silicato di Rb Giorgio Bonaga e RbRb

50 ANALISI DI RESIDUI DI PESTICIDI NEL PEPERONE (RIVELATORE NPD) Giorgio Bonaga 1. metamidophos (P), 2. acephate (P), 3. omethoate (P, S), 4. diazinon (N, P, S), 5. dimetoate (N,P, S) 6. chlorothalomil (N, Cl), 7. chloropyrifos-methyl (N, P, N), 8. tolchofos-methyl (N, P, S), 9. pirimiphos-methyl (N, P, S), 10. malathion-methyl (P, S), 11. matacarban (N, S), 12. thiabendazole (N, S) 13. triazophos (N, P, S), 14. phosalone (N, P, S), 15. azinphos-methyl (N, P, S)

51 CARATTERISTICHE DELLNPD selettività: elevata (sostanze contenenti N, P, X) sensibilità: /-12 g = 10 pg (P)/1 pg (N) range dinamico: 10 4 stabilità: moderata modalità:non distruttiva gas di trasporto:N 2 o He temperatura limite:< 350°C esigenze:controllo accurati dei flussi della fiamma Giorgio Bonaga

52 FAST–GC E ULTRA FAST-GC Perché questa ossessione ? Per almeno 3 motivi: 1.riducono drasticamente i tempi dellanalisi 2.hanno unelevata risoluzione R (compressione dei picchi) 3.forniscono risultati quali-quantitativi molto attendibili 4.consentono analisi di composti presenti in sub-tracce ( ) Quali colonne impiegano ? GC GC convenzionale fast ultra fast diametro interno (mm) 0,25-0,32 0,10-0,18 0,05 lunghezza (m) film thickness ( m) 0,25-5,0 0,05-0,4 tempi (minuti) gas di trasportoHe, H 2 H 2 Giorgio Bonaga

53 Quali condizioni strumentali offrono ? flessibilità verso i detector (FID, TCD, ECD, NPD, MS) purché ad alta velocità di acquisizione (es.: FAST FID) rampe termiche con notevoli incrementi di temperatura (FAST: 120°C/min; ULTRAFAST: 1200°C/min) tempo di raffreddamento da 350 a 50°C in 1 minuto; temperatura accurata (± 0,01°C) flessibilità della temperatura (intervalli di 0,1°C) vita media delle colonne più lunga di oltre 3 volte elemento riscaldante fibra ceramica sensore della T colonna capillare Giorgio Bonaga

54 Quali injector impiegano ? pressioni elevate (quasi 1000 kPa) split ratio elevato (1:1200) riproducibilità dello split ratio possibilità di lavorare in splitless controllo elevato di velocità media lineare ( v ), pressione (P) e flusso (F) Quali i settori di applicazione ? ambientale alimenti e bevande chimico-farmaceutico ricerca Quali sono i limiti ? strumenti dedicati (injector, oven, detector) Giorgio Bonaga

55 = C14:0 2 = C15:0 3 = C16:0 4 = C16:1 ( -9) 5 = C17:0 6 = C18:0 7 = C18:1 ( -9) 8 = C18:2 ( -6) 9 = C18:3 ( -3) 10 = C20:0 11 = C20:4 ( -6) 12 = C20:5 ( -3) 13 = C22:6 ( -3) Ultrafast GC unknow 1 = C14:0 2 = C15:0 3 = C16:0 4 = C16:1 ( -9) 5 = C17:0 6 = C18:0 7 = C18:1 ( -9) 8 = C18:2 ( -6) 9 = C18:3 ( -3) 10 = C20:0 11 = C20:4 ( -6) 12 = C20:5 ( -3) 13 = C22:6 ( -3) min 0 0,5 1,0 1,5 2,5 3,0 min Tradizionale 13 3 minuti 30 minuti Giorgio Bonaga

56 COLONNA: silice fusa di 5 m x 0,1 mm i.d., MEGAWAX, 0,2 m f.t. PROGRAMMA TERMICO: da 150°C (10) a 250°C (20) con 1,7°C/s FAME dellolio di oliva C16:0 C16:1 C17:0 C17:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C24:1 C24:0 C20:1 C22:0 C23:0

57 ANALISI DEI COSTITUENTI DELLHASHISH TH C 110 i.s. CBD THC CBN 0 COLONNA: silice fusa 5 m x 0,1 mm i.d., RT-X5, 0,1 µm f.t. PROGRAMMA TERMIVO: da 50°C (6) a 150°C con 10°C/s e da 150°C a 320°C (0,2) con 6°C/s Giorgio Bonaga

58 ANALISI DI UN LUBRIFICANTE Giorgio Bonaga COLONNA: silice fusa 5 m x 0,32 mm i.d., RTX1 0,25 µm f.t. PROGRAMMA TERMICO: da 40°C (6) a 370°C (30) con 5°C/s olio lubrificante standard C13C15 C17 C19 C21 C22 C23 C25 C26 C27

59 ANALISI DI PESTICIDI Giorgio Bonaga

60 2D GC E COMPREHENSIVE GC (GCxGC) A volte le matrici naturali, di varia complessità, mostrano dei tracciati gascromatografici talmente complicati che diventa necessario un livello molto elevato di efficienza per ottenere la completa risoluzione dei componenti. Di conseguenza, limpiego di una singola colonna capillare può essere insufficiente. I metodi bidimensionali si stanno diffondendo in tutti i campi (scienze farmacologiche, scienze degli alimenti, scienze biologiche e ambientali, industria petrolifera) perché queste tecniche hanno un potere risolutivo R molto maggiore rispetto la gascromatografia tradizionale. Un sistema GC bidimensionale deve possedere i seguenti requisiti: tutti i componenti presenti in un campione vengono sottoposti a due separazioni basate su criteri di selettività diversi (punto di ebollizione e polarità dei soluti); i composti separati nella prima dimensione non devono riunirsi nella seconda dimensione; i profili di eluizione devono conservarsi in entrambe le dimensioni. Una separazione bidimensionale viene effettuata su due distinte colonne (con diversa selettività) connesse in serie mediante un modulatore di flusso capillare.

61 La funzione del modulatore di flusso ( jet flow modulator o differential flow modulator ) è quella di raccogliere le frazioni che eluiscono dalla prima colonna ( conventional capillary, 30 m x 0,25 mm i.d., f.t. 0,25 m, non polare) e trasferirle in una seconda colonna più corta ( short narrow bore, 5m x 0,25 mm i.d., f.t. 0,15 m, polare). I modulatori impiegano: jet a gas criogenico (CO 2 ) flusso differenziale di carrier gas Indipendentemente dal principio su cui si basa il modulatore svolge 3 funzioni: raccoglie una frazione di effluente dalla prima colonna per un tempo uguale alla larghezza del picco, suddiviso in cut (ad es: se la larghezza di un picco è di 6, il modulatore accumula materiale ogni 2-3, pari a 3-2 cut; compatta il materiale raccolto da ciascun cut in una banda (picco) molto stretta, mediante un gas criogenico o un aumento del flusso; introduce le bande compattate, in sequenza, nella seconda colonna per una nuova separazione degli analiti che costituiscono ciascuna banda. Giorgio Bonaga

62 prima colonna (non polare) conventional capillary seconda colonna (polare) short narrow bore MODULATORE DUAL JET (CO 2 spray) injector focalizzazione pulsata 10 ms e riiniezione fast detector (sampling rate > 100 Hz) Giorgio Bonaga DUAL JET MODULATOR

63 short narrow bore ( 20 ml/min) injector Giorgio Bonaga DIFFERENTIAL FLOW MODULATOR fast detector (sampling rate > 100 Hz) conventional capillary (0,8 ml/min) H2H2 collection channel modulation valve MODULATORE

64 Affinchè la separazione nella prima dimensione venga conservata, una banda introdotta nella seconda colonna deve eluire prima dellintroduzione della banda successiva. In sintesi, tempi di ritenzione secondari devono essere, al massimo, uguali alla durata di un singolo periodo di modulazione. I dati cromatografici bidimensionali possono essere meglio apprezzati se trasformati in un cromatogramma bidimensionale nel quale ad ogni componente corrisponde un picco definito dai due tempi di ritenzione (uno nella coordinata x, laltro in quella y). Nei diagrammi tridimensionali è invece riportata anche il colore e la dimensione della coordinata z che è correlata alla quantità totale del soluto presente nel campione. Lo spazio bidimensionale può contenere molti più picchi e quindi ha una maggiore capacità rispetto ad un gascromatogramma monodimensionale. La sovrapposizione di due soluti diversi è statisticamente improbabile perché richiederebbe due tempi di eluizione uguali in due colonne aventi fasi stazionarie diverse. Bisogna anche sottolineare che soluti appartenenti alla stessa classe chimica formano, nello spazio bidimensionale, dei pattern caratteristici che aumentano il potere di identificazione dei componenti. Giorgio Bonaga

65 GC vs. 2D GC 2D GC HEART- CUT GC a 5b 5c 5d 10a 10b 10c a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14a 2b3b4b5b6b9b10b11b12b13b 3c4c5c10c11c12c 4d11d GC MONODIMENSIONALE 2D GC COMPREHENSIVE GC Giorgio Bonaga

66 ecc., ecc.

67 Cè una grande differenza nel numero di picchi che si possono separare con la Conventional GC e con la GC Comprehensive GC Comprehensive GC - I^ colonna : numero picchi (n)= 1100 II^ colonna: numero picchi (n)= 35 TOTALE (n x n)= Conventional GC - I^ colonna: numero picchi (n)= 1100 II^ colonna: numero picchi (n)= 1100 TOTALE (n+n)= 2200

68 VANTAGGI DELLA COMPREHENSIVE GC Comprehensive GC ha una capacità di separazione notevolmente più elevata della Conventional GC; Comprehensive GC ha una sensibilità più elevata della Conventional GC perché la forma dei picchi è decisimente più stretta; Comprehensive GC permette una migliore identificazione dei picchi perché leluizione è caratterizzata da due tempi di ritenzione; Comprehensive GC è compatibile con i sistemi di iniezione e con le tecniche di campionamento della GC Conventional GC; Comprehensive GC riduce la fase preparativa di campioni complessi: la capacità separativa è così elevata che consente di eliminare le interferenze critiche che si verificano nella Conventional GC.

69 MODULAZIONE … … … … … … … … … … … … … … … TRASFORMAZIONE I^ dimensione II^ dimensione COMPREHENSIVE GC 3 CROMATOGRAMMA 2D (alla fine della II^ colonnna) CROMATOGRAMMA 1D (alla fine della I^ colonnna) CROMATOGRAMMA 2D DOPO ALLINEAMENTO

70 ANALISI DEI COMPOSTI ORGANICI VOLATILI (VOCs) I^ DIMENSIONE 1 clorobenzene 2 1,1,1,2-tetracloroetano 3 etilbenzene 4 p - + m -xylene 5 bromoformio 6 stirene 7 o -xilene 8 1,1,2,2-tetracloroetano 9 1,2,3-tricloropropano 10 isopropilbenzene 11 bromobenzene 12 2-clorotoluene 13 n -propilbenzene 14 4-clorotoluene 15 impurity 16 1,3,5-trimetilbenzene 17 terz -butilbenzene 18 1,2,4-trimetilbenzene 19 1,3-diclorobenzene 20 sec -butilbenzene 21 1,4-diclorobenzene 22 p-isopropiltoluene 23 1,2-diclorobenzene 24 n -butilbenzene

71 isopropilbenzene - p - + m - cymene indano - 1,2,3-trimetilbenzene n -nonano - olefine paraffine cromatogramma ricostruito 1^ dimensione punti di ebollizione polarità 1^ dimensione 2^ dimensione Giorgio Bonaga mono-aromatici 1,2,4-trimetilbenzene iso -butilbenzene terz -butilbenzene

72 DERIVATIZZAZIONI IN GC In gascromatografia le derivatizzazioni vengono impiegate per due motivi: 1. abbassare i punti di ebollizione dei soluti in modo da effettuare le analisi a temperature inferiori (con maggiore stabilità dei campioni, maggiore durata della colonna, maggiore disponibilità di fasi stazionarie stabili) 2. aumentare la sensibilità del detector Il principio base è di convertire i gruppi funzionali capaci di deprotonarsi (idrossiderivati, mercaptani, acidi carbossilici, ammine, ammidi, ossime, ecc.), che per questo conferiscono ai composti bassa volatilità ed alta polarità, in derivati più volatili e termicamente stabili. Le reazioni si fanno in piccole fiale ( microvial ) nelle quali al campione da derivatizzare (R-H) si aggiunge la soluzione del derivatizzante (D-X). R -H+ D - X Giorgio Bonaga

73 SILANIZZAZIONE È la reazione di composti deprotonabili con sostituenti polialchilsilanizzanti. GRUPPI TRIMETILSIL SILANIZZABILI DERIVATI - OH-O-TMS -SH -S-TMS -COOH -COO-TMS -POH -PO-TMS -SOH -SO-TMS -NOH -NO-TMS -BOH -BO-TMS -NH 2 -HN-TMS -NH -N-TMS -CONH 2 -COHN-TMS -CH 2 =C=O -CH=C=O-TMS R -H + Cl - Si (CH 3 ) 3 Giorgio Bonaga

74 I più comuni agenti trimetilsilanizzanti sono: La reazione di sililazione viene fatta in presenza di un solvente polare (piridina, N,N-dimetilformammide, acetonitrile, tetraidrofurano) ad una temperatura che varia da 30 a 140°C a seconda del gruppo funzionale da derivatizzare e per un tempo variabile da alcuni minuti a ore. Il sostituente trimetilsilil- aggiunge alla molecola 73 (-1) Dalton. trimetilclorosilano (TMCS) N-trimetilsililimidazolo (TMSIM) N-metil-N-trimetilsililtrifluoroacetammide (TSTFA) esametildisilazano (HMDS) N-metil-N-trimetilsililacetammide (MSTA) Giorgio Bonaga

75 ESTERIFICAZIONE Principalmente è la conversione degli acidi carbossilici nei corrispondenti esteri per reazione con un eccesso di alcol (metanolo, etanolo, propanolo), riscaldando a riflusso e in presenza di un catalizzatore (HCl, H 2 SO 4, SO 2 Cl 2, BCl 3 ). Gli alchil-esteri hanno punti di ebollizione inferiori agli acidi di partenza e hanno minori interazioni con le fasi stazionarie polari. Il sostituente metilico, etilico e propilico aggiungono alla molecola 15 (-1), 29 (-1), 43 (-1) Dalton. H+ HO - R O R – C O - Un sostituente molto utile per la sensibilità dellECD è il C 6 F 5 - (pentafluorofenil-) che viene introdotto con numerosi reagenti (pentafluorobenzaldeide, alcol pentafluorobenzilico, ecc.). Il sostituente pentafluorofenil- aggiunge alla molecola 167 (-1) Dalton. Giorgio Bonaga

76 ALCHILAZIONE È una reazione che impiega un bromuro o uno ioduro (di metile, etile, propile o butile) per trasferire un gruppo alchilico su un eteroatomo (O, N, S, ecc.), a temperatura ambiente e in presenza di un catalizzatore (Ag 2 O). I gruppi alcolici vengono alchilati lentamente e con reazioni non quantitative. I sostituenti alchilici aggiungono alla molecola rispettivamente 15 (-1), 29 (-1), 43 (-1), 57 (-1) Dalton. H + CH 3 - I H R – N Giorgio Bonaga

77 ACILAZIONE È una reazione che impiega un cloruro acilico (R-COCl) per trasferire un gruppo acile (R-C=O) su un eteroatomo (O, N, S, ecc.). Il sostituente acetile aggiunge alla molecola 43 (-1) Dalton. +Cl - H O C CH 3 O R – C N H Giorgio Bonaga


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