La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

Cosa sono e cosa servono gli allergeni e gli epitopi ricombinanti nella diagnosi di allergia alimentare Dott. Alberto Martelli Melloni Pediatria Milano.

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "Cosa sono e cosa servono gli allergeni e gli epitopi ricombinanti nella diagnosi di allergia alimentare Dott. Alberto Martelli Melloni Pediatria Milano."— Transcript della presentazione:

1 Cosa sono e cosa servono gli allergeni e gli epitopi ricombinanti nella diagnosi di allergia alimentare Dott. Alberto Martelli Melloni Pediatria Milano Milano 1 Febbraio 2008

2

3 Variabilità degli estratti per prick e RAST Estratti di fonti diverse, pur se definiti allo stesso modo possono contenere miscele di proteine qualitativamente e quantitativamente molto diverse tra loro, il che ovviamente condiziona molto lesito dei test Grier TJ et al. Allergy Asthma Proc 2002;23: Dolen WK. Ann Allergy Asthma Immunol 1995;75:81-2.

4 Come si ottengono gli allergeni? Lestrazione e la purificazione Gli allergeni possono essere proteine solubili e glicoproteine. Le strategie utilizzate per la loro purificazione sono le stesse di quelle adottate per la purificazione delle proteine in generale. Il primo passo consiste nell'estrarre dal materiale grezzo la massima quantità di allergene, con la minima degradazione o denaturazione possibile. Scheurer S. Clin Exp Allergy 2006;36:

5 L'identificazione e la caratterizzazione degli allergeni avviene per mezzo di tecniche immunochimiche, biochimiche e di biologia molecolare. I metodi più comunemente usati sono: - la immunoelettroforesi migrazione elettroforetica con Ab specifici - la SDS - PAGE (sodium dodecyl sulphate - polyacrylamide gel electrophoresis): peso molecolare -l'isoelettrofocalizzazione (IEF), in associazione con tecniche di immunoblotting: punto isoelettrico (è il valore di pH al quale una molecola non reca alcuna carica elettrica netta). -Per alcune limitazioni di queste tecniche, spesso si rende necessario l'impiego contemporaneo di più metodi per poter giungere a risultati definitivi. Tecniche per identificazione dellallergene

6 SDS page

7 Isoelettrofocalizzazione

8 Libraries di un DNA complementare Il principio della clonazione molecolare è basato sulla preparazione o l'isolamento del DNA che codifica il polipeptide rilevante per inserirlo in un plasmide o in un vettore batteriofagico, che può essere successivamente utilizzato per infettare un microrganismo come l'Escherichia coli. Il plasmide o il batteriofago si moltiplicano all'interno dell'Escherichia coli producendo colonie trasformate (nel caso del plasmide) o placche (nel caso del batteriofago). Braren I, et al. Clin Chem 2007;53:

9 284 aminoacidi del Pen a 1 Reese G, et al. Clin Exp Allergy 2006;36:

10

11 Analisi spettroscopica

12 Cos è un epitopo? Lepitopo, o determinante, é la componente strutturale dellallergene responsabile dellinterazione specifica con lanticorpo IgE.

13 Sampson HA. J Allergy Clin Immunol 2004;113: Gli epitopi lineari e conformazionali

14 Siero albumina bovina

15 Epitopi della siero albumina bovina Restani P. Allergy 2004;59 Suppl 78:21-4

16 Come possiamo utilizzare queste informazioni nella diagnostica ? Diagnosi primaria di allergia alimentare Precoce predizione della persistenza dellallergia alimentare Predizione di reazione severa al Tpo Determinazione delle cross-reattività

17 Harwanegg C. et al. Clin Exp Allergy 2003;33:7-13. La tecnica dei microarray

18 Diagnosi di sensibilizzazione Hiller R, et al. FASEB J. 2002;16:414-6.

19 r Dau c , r Dau c e r Dau c 4 erano clonati attraverso E. Coli. Erano valutati i sieri di 40 pazienti allergici alla carota con challenge positivo 98% dei pazienti allergici alla carota erano positivi ad almeno un ricombinante 98 % rDau c % rDau c % to rDau c 4 Ballmer-Weber BK. Clin Exp Allergy 2005; 35:970–8 Allergia alla carota

20

21 Allergeni testati Performance del test The physicians viewpointThe patients viewpointThe studyTest outcome interpretation Sen (%;CI)Spe (%;CI) PPV (%) NPV (%) LR+ (P) LR- (P) Pre-test odds (P)Post-test odds (P) P(T+)P(T- ) CM SPT97.91 ( ) ( ) sp IgE Ab100 ( ) 80 ( ) nBos d462.5 ( ) 86 ( ) nBos d ( ) 86 ( ) nBos d ( ) 88 ( ) Fiocchi A. data on file I test con lallergene naturale purificato

22 Sampson HA. J Allergy Clin Immunol 2004;113: Precoce predizione della persistenza dellallergia alimentare

23 Ovomucoide ed epitopi lineari Ovomucoide è una proteina glicosilata composta da 186 aminoacidi (Gal d 1.1, 1.2 e 1.3). I 3 domini dellovomucoide erano isolati e valutati con sieri di pazienti allergici alluovo. Una protratta allergia alluovo è associata alla presenza di significative quantità di IgE anti epitopi lineari (sequenziali) mentre le forme a rapida tolleranza erano associate ad IgE verso epitopi conformazionali. Cooke SK, et al. J Immunol 1997;159:

24 Più lunga tolleranza alluovo se IgE per lineari 2/3 degli allergici alluovo sono tolleranti nei primi 5 anni di vita - Si è valutato il legame delle IgE di bambini con allergia alluovo, transitoria o persistente, rispetto agli epitopi conformazionali o sequenziali (lineari) di ovomucoide, ovoalbumina, ovotransferrina. -I bambini con protratta allergia alluovo presentano IgE elevate contro epitopi sequenziali dellovomucoide e dellovoalbumina (P < 0.01). -La presenza sierica di IgE diretti contro epitopi lineari dellovomucoide dovrebbero essere usati come strumento per identificare i casi a più lenta risoluzione. Järvinen KM, et al. Allergy 2007;62:

25 IgE contro epitopi lineari dellovomucoide

26 Beyer K, et al. J Allergy Clin Immunol 2005;116: Le IgE leganti peptidi per il latte vaccino

27 Beyer K, et al. J Allergy Clin Immunol 2005;116: Cosa accade per i singoli peptidi?

28

29 MAL D 1= difensina (termolabile) MAL D 2 = poco importante allergologicamente MAL D 3 = Lipid Transfer Protein (termostabile) MAL D 4 = bet v2= può dare SOA Predizione di reazione severa al Tpo

30 La peluria della pesca è ricca di LTP Allergia a LTP comune nellarea mediterranea ma assente nei Paesi nordici. Le pesche sono il principale agente sensibilizzante a LTP Gli allergici a LTP della pesca spesso tollerano altre Rosacee e sono cuti e RAST negativi alle loro LTP La peluria della pesca contiene elevate quantità di LTP che esiste anche nella buccia La peluria della pesca induce la sensibilizzazione a LTP La peluria viene eliminata durante il trattamento della pesca mediterranea prima di andare a mercati lontani La rimozione sistematica della peluria diminuisce lallergenicità della pesca. Asero R, et al. Allerg Immunol (Paris). 2006;38:

31 Cross-sensibilizzazione: presenza di IgE che reagiscono con proteine di origine differente portatrici di epitopi simili od identici Cross-reattività: reazione clinica ad agenti diversi, alimentari e/o inalanti, dovuta a cross- sensibilizzazione. Predizione della cross-reattività: le definizioni Brusic V. et al. Allergy 2003;58:1083–1092

32 CMA BA 100% 13-20% Frequenza di BA in CMA Martelli A. et al. Ann Allergy Asthma Immunol 2002;89(6 Suppl 1):38-43.

33 La monosensibilizzazione é rara Beyer K. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2003;3:

34 Probabilità di reazione ad alimenti cross reattivi Sicherer SH. J Allergy Clin Immunol 2001;108:881-90

35

36

37 I limiti del test… Non è stata ancora segnalata la sensibilità e la specificità del test per singola molecola allergenica. Pochissimi lavori che esprimano la riproducibilità del test. A seconda della fase solida che lega lallergene risultati possono essere differenti Difficile predizione della reazione clinica Pertanto impossibile per ora collocarlo nelliter diagnostico

38 A cosa servono? Diagnosi primaria di allergia alimentare - Precoce predizione della persistenza dellallergia alimentare +/ - Predizione di reazione severa al Tpo - /+ Determinazione delle cross-reattività +

39 Cosa speriamo di aspettarci Una specifica identificazione delle molecole allergeniche per il bambino allergico La riscrittura della storia naturale di alcune allergie alimentari in base alle molecole allergeniche coinvolte. Lo studio di sottogruppi, per le singole allergie alimentari, che potrebbero avere corrispondenza al test di provocazione orale La possibilità di utilizzare un vaccino sub-linguale specifico per desensibilizzare il bambino (esperienza in Spagna dellLTP nello studio EXPO) Informazioni ulteriori per le cross-reattività Sapere se cè corrispondenza fra tipo di patologia allergica espressa e la presenza di reattività a particolari molecole allergeniche.

40 Sarà così lo scenario futuro? Harwanegg C. et al. Clin Exp Allergy 2003;33:7-13.

41 Conclusioni Il test permette di acquisire informazioni sempre più complete e dettagliate, ma anche di sempre più difficile interpretazione. Tali esami devono essere considerati come test di 3° livello, da effettuarsi per approfondire la diagnostica di particolari sottogruppi di bambini già sottoposti ai test classici. Molta strada va percorsa per conoscere vantaggi e limiti delle nuove tecnologie, definirne uso ed abuso, e arrivare infine a tracciare adeguate linee-guida per il loro impiego clinico.

42

43

44


Scaricare ppt "Cosa sono e cosa servono gli allergeni e gli epitopi ricombinanti nella diagnosi di allergia alimentare Dott. Alberto Martelli Melloni Pediatria Milano."

Presentazioni simili


Annunci Google