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Risposta Adattativa Indotta da Esposizioni a Radiofrequenza in Linfociti Umani Coltivati in vitro Anna Sannino 1, Olga Zeni 1, Stefania Romeo 1, Rita Massa.

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1 Risposta Adattativa Indotta da Esposizioni a Radiofrequenza in Linfociti Umani Coltivati in vitro Anna Sannino 1, Olga Zeni 1, Stefania Romeo 1, Rita Massa 1,2, Vijayalaxmi 3, Maria Rosaria Scarfì 1 1 ICEmB c/o CNR, IREA - Via Diocleziano, 328 – Napoli; 2 ICEmB c/o Università Federico II, Dipartimento di Scienze Fisiche, CMSA, Via Cintia, Napoli; 3 University of Texas, Department of Pathology, Health Science Centre, San Antonio, TX 78229, USA Pisa, maggio 2012

2 RISPOSTA ADATTATIVA Capacità di una dose estremamente bassa di un agente mutageno fisico o chimico (dose adattante) di ridurre leffetto di un successivo trattamento a dosi maggiori dello stesso agente o di un agente diverso (dose challenge) Agenti induttori – radiazioni ionizzanti & mutageni chimici Endpoints Ben documentata in radiobiologia in vitro & in vivo E. Coli, cellule di mammifero e vegetali, roditori, lavoratori Pisa, maggio 2012

3 FATTORI CHE INFLUENZANO LA ARMECCANISMI SUGGERITI Dose usata per ladattamento (AD) Dose rate (RI) Intervallo di tempo tra la AD e la CD Fase del ciclo cellulare in cui viene data la AD Dose usata per ladattamento (AD) Dose rate (RI) Intervallo di tempo tra la AD e la CD Fase del ciclo cellulare in cui viene data la AD Efficiente riparo del DNA Regolazione del ciclo cellulare Induzione di apoptosi Efficiente detossificazione dei radicali liberi Efficiente riparo del DNA Regolazione del ciclo cellulare Induzione di apoptosi Efficiente detossificazione dei radicali liberi Fenomeno eterogeneo – il 75% della popolazione esibisce RA, (tratti costituzionali e non fenomeni fisiologici transitori) NON cè un meccanismo di azione universalmente riconosciuto Pisa, maggio 2012 RISPOSTA ADATTATIVA

4 La maggior parte della letteratura indica che Esposizioni a RF non sono in grado di indurre danno diretto al DNA in vitro La possibilità che esposizioni a RF inducano danno al DNA è stata ampiamente valutata a causa della correlazione diretta tra effetti genotossici e cancerogenesi Meltz ML, Bioelectromagnetics Suppl. 6: S196 - S213 (2003) Vijayalaxmi and Obe, Radiat Res 162: 481 – 496 (2004) Verschaeve L. Toxicol. Appl.Pharmacol. 207: S336 – S341 (2005) Moulder et al., Int J Radiat Biol. 81: (2005) Vijayalaxmi and Prihoda, Radiat Res, 169: 561 – 574 (2008) Juutilainen et al., ICNIRP 16/2009: 103 – 118 (2009) Meltz ML, Bioelectromagnetics Suppl. 6: S196 - S213 (2003) Vijayalaxmi and Obe, Radiat Res 162: 481 – 496 (2004) Verschaeve L. Toxicol. Appl.Pharmacol. 207: S336 – S341 (2005) Moulder et al., Int J Radiat Biol. 81: (2005) Vijayalaxmi and Prihoda, Radiat Res, 169: 561 – 574 (2008) Juutilainen et al., ICNIRP 16/2009: 103 – 118 (2009) Radiofrequenze e danno al DNA Pisa, maggio 2012

5 Group 1: "Carcinogenic to humans" There is enough evidence to conclude that it can cause cancer in humans. Group 2A: "Probably carcinogenic to humans" There is strong evidence that it can cause cancer in humans, but at present it is not conclusive. Group 2B: "Possibly carcinogenic to humans" There is some evidence that it can cause cancer in humans but at present it is far from conclusive. Group 3: "Unclassifiable as to carcinogenicity in humans" There is no evidence at present that it causes cancer in humans. Group 4: "Probably not carcinogenic to humans" There is strong evidence that it does not cause cancer in humans. Definizione IARC : Categoria di agenti per i quali cè una limitata evidenza di cancerogenesi nelluomo e una insufficiente evidenza di cancerogenesi negli animali da esperimento IARC Classification of Radiofrequency Electromagnetic Fields (IARC Monographs Series, Vol. 102) Associazione positiva per gliomi in utilizzatori di telefoni cellulari da più di 7 anni. Risultati simili per il neurinoma acustico ma su un numero minore di casi Pisa, maggio 2012

6 La maggior parte degli studi in letteratura è stata eseguita impiegando radiazioni ionizzanti come AD e/o CD per indurre RA Campi a RF per determinare se radiazioni non ionizzanti sono in grado di indurre risposta adattativa in linfociti umani da sangue periferico Induzione di AR valutata come danno al DNA applicando il test del micronucleo (MN) col blocco della citodieresi nel nostro laboratorio Pisa, maggio 2012

7 S phase anaphase Cyt-B MICRONUCLEUS ASSAY Pisa, maggio 2012

8 Protocollo Sperimentale Frequenza di MN su 2000 cellule/trattamento t=0t=24ht=48ht=72h PHACyt-BCD-MMC Cell harvest t=44h S phase RF 20h in fase S Colture da 3 ml (sangue periferico da donatori sani) Controllo Controllo 1 ng/ml MMC a 24h (AD) 1 ng/ml MMC a 24h (AD) 100 ng/ml MMC a 48h (CD) 100 ng/ml MMC a 48h (CD) ng/ml MMC (AD+CD) ng/ml MMC (AD+CD) Controllo Controllo 1 ng/ml MMC a 24h (AD) 1 ng/ml MMC a 24h (AD) 100 ng/ml MMC a 48h (CD) 100 ng/ml MMC a 48h (CD) ng/ml MMC (AD+CD) ng/ml MMC (AD+CD) Sham Sham RF (AD) RF (AD) Sham + MMC (100 ng/ml) (CD) Sham + MMC (100 ng/ml) (CD) RF + MMC (100 ng/ml) (AD+CD) RF + MMC (100 ng/ml) (AD+CD) Sham Sham RF (AD) RF (AD) Sham + MMC (100 ng/ml) (CD) Sham + MMC (100 ng/ml) (CD) RF + MMC (100 ng/ml) (AD+CD) RF + MMC (100 ng/ml) (AD+CD) Esposizioni a RF (20 h) come dose adattante (AD) MMC (100 ng/ml) come dose challenge (CD) Controlli positivi: colture trattate con MMC sia come AD (1 ng/ml) sia come CD (100 ng/ml) Pisa, maggio 2012

9 Analisi dei risultati *danno atteso (MN) nei trattamenti combinati (AD + CD) calcolato come la somma di MN nei due trattamenti individuali meno il numero di MN nelle colture non trattate (controllo) % Decremento del danno al DNA [(danno atteso* – danno osservato)/atteso] x 100 Analisi Statistica La significatività statistica della riduzione del danno osservato rispetto a quello atteso è stata calcolata per ogni soggetto esaminato col test z a coppie; nellinsieme i trattamenti sono stati analizzati col t di Student per dati appaiati Pisa, maggio 2012

10 Attività sperimentale Pisa, maggio 2012 I° studio – I° studio – valutazione dellinduzione di RA in seguito a esposizioni a 900 MHz, GSM, SAR 1.25 W/kg in fase S del ciclo cellulare II° studio – II° studio – ruolo della dalla fase del ciclo cellulare dellinduzione di Risposta Adattativa da RF III° studio – III° studio – valutazione della dipendenza dai parametri elettromagnetici nellinduzione di RA da RF IV° studio – IV° studio – valutazione della dipendenza dal meccanismo di azione dellagente challenge nellinduzione di RA da RF In corso di svolgimento – In corso di svolgimento – valutazione della dipendenza dal tipo cellulare e meccanismo di azione coinvolto nella RA da RF

11 Applicatore: Wire Patch Cells 900 MHz (GSM), SAR medio 1.25 W/kg Due piastre parallele, cortocircuitate agli angoli da quattro cilindri Piccole dimensioni (15x15x3cm) Alloggiamento in incubatori standard per colture cellulari (controllo delle condizioni ambientali) Per evitare interferenze radiative con il sistema di controllo elettronico dellincubatore, le WPC sono ospitate in gabbie schermanti rivestite da pannelli assorbenti Esposizioni simultanee di 4 Petri ( 3.5 cm) nelle stesse condizioni di esposizione I° studio Pisa, maggio 2012

12 Sistema di esposizione Sistema a due canali, controllato da remoto per il monitoraggio delle potenze nelle WPCs per garantire la procedura in cieco Due spiraline sulle facce esterne delle WPC con acqua circolante a 36.8 °C per garantire nelle Petri esposte °C T° misurata in colture dummy durante le 20 h di esposizione INCUBATOR VSWR METER 1 SIGNAL GENERATOR 1 SIGNAL GENERATOR 2 AMPLIFIER 1 AMPLIFIER 2 VSWR METER 2 Feedback Net power (?) FIBER OPTIC THERMOMETER Pisa, maggio 2012 I° studio

13 Dosimetria Dosimetria numerica – Computer Simulation Technology (CST) (tecnica dellintegrazione finita) per determinare i valori di SAR e la distribuzione nel campione 4 Petri ( 3.5 cm) Caratteristiche dei materiali: sangue = 61; =1.54 S/m; terreno: = 61; =1.54 S/m Altezza della miscela 3 mm Risoluzione del modello: 1 mm size cells Dosimetria sperimentale - 4 Petri con 3 ml di terreno posizionate come per la simulazione. Misure di temperatura in cinque punti per ogni Petri. SAR medio valutato per ogni Petri Efficienza media della WPC: 0.35 W/kg/W ± 28% tra le misure Set up del sistema di esposizione e dosimetria approvati dalla FDA (progetto CRADA, in collaborazione con lENEA – Casaccia) Scarfì et al., Rad. Res. 165, (2006) Pisa, maggio 2012 I° studio

14 *P< h di esposizione a RF nella fase S/G 2 del ciclo cellulare inducono un significativo decremento del danno al DNA indotto da MMC (AR) Pisa, maggio 2012 RISULTATI I° studio Lentità della RA variava tra i donatori (decremento di danno al DNA compreso tra 35-56%)

15 I linfociti di tutti i donatori esaminati hanno una frequenza di MN simile nelle colture esposte e sham-esposte (p=0.453) Pisa, maggio 2012 RISULTATI I° studio Lesposizione a RF non induce effetti genotossici

16 assenza di effetti genotossici e citotossici in linfociti umani Produzione di un trigger in grado di indurre RA: protezione da un successivo trattamento con una dose challenge di un agente genotossico (MMC) 20h di esposizione (900 MHz, GSM, SAR 1.25 W/kg) Pisa, maggio 2012 I° studio

17 Scopo Confermare le osservazioni precedenti su un maggior numero di individui verificare linduzione di RA in differenti fasi del ciclo cellulare Pisa, maggio 2012 II° studio 6-8 h h dopo 45 h mitogeno Ciclo cellulare in linfociti umani Preston et al., Mut Res 189: (1987) Bender et al., Mut Res 196: 103–159 (1988)

18 in G 0 : prima della stimolazione con mitogeno in G 1 : da 4 a 24 h dopo la stimolazione in fase S: da 24 a 44 h dopo la stimolazione (= studio I) 20 h di esposizionet=0t=4ht=24ht=48ht=72hPHACyt-BCD-MMC Cell harvest G 1 phase t=44h S phase RF RF G0 phase RF (900 MHz, GSM, average SAR 1.25 W/kg) Pisa, maggio 2012 II° studio

19 RISULTATI Esposizioni a RF in fase S inducono un significativo decremento del danno al DNA indotto da MMC (AR) Validazione dei risultati precedenti su un maggior numero di individui Pisa, maggio 2012 II° studio

20 Esposizioni a RF in fase G 0 o G 1 non proteggono da un successivo trattamento genotossico Pisa, maggio 2012 II° studio RISULTATI

21 Significativo decremento del danno indotto da MMC (adattamento) in cellule esposte a RF in fase S (24-44h) Nessun effetto della RF in fase G 0 (prima della stimolazione) o G 1 (da 4 a 24 h dalla stimolazione) Nessun effetto della sola esposizione a RF Conferma delle osservazioni precedenti su un maggior numero di individui Relazione tra la fase del ciclo cellulare in cui avviene lesposizione e linduzione di RA Pisa, maggio 2012 II° studio

22 Estendere la caratterizzazione della RA indotta da RF in linfociti umani valutando linduzione delladattamento in differenti condizioni di esposizione (frequenza, modulazione, SAR) AD: 20 h RF in fase S; CD: 100 ng/ml MMC a 48 h f = 1950 MHz; UMTS; SAR: 1.25, 0.6, 0.3, 0.15 W/kg AD: 20 h RF in fase S; CD: 100 ng/ml MMC a 48 h f = 1950 MHz; UMTS; SAR: 1.25, 0.6, 0.3, 0.15 W/kg Pisa, maggio 2012 III° studio Scopo

23 Sistema di esposizione e dosimetria Guida donda cortocircuitata alloggiata in un incubatore a CO 2 per colture cellulari Modulazione WCDMA, in accordo con le specifiche 3GPP (cinque canali di dati + un canale di controllo) In condizioni di campo elettrico parallelo, elevata efficienza (fino a 80 %) e limitata disuniformità di SAR (meno del 30 %) Pisa, maggio 2012 III° studio 0.6 W/kg 0.15 W/kg 1.25 W/kg 0.3 W/kg Inserendo 4 Petri (colture da 3ml), si ottiene un SAR più elevato nelle posizioni centrali rispetto alle posizioni esterne e, fissando opportunamente la distanza il centro dei campioni si ottiene un rapporto di 1:4 tra i valori di SAR interno ed esterno

24 Misure a intervalli di 5 sec La variazione di T° non ha mai superato laccuratezza dello strumento (± 0.3 °C). Cinque misure indipendenti Ulteriori misure di T° a intervalli regolari durante la fase sperimentale Controllo della Temperatura Sham esposizioni in un applicatore identico, alloggiato nello stesso incubatore, ma senza segnale Sham esposizioni in un applicatore identico, alloggiato nello stesso incubatore, ma senza segnale Esperimenti preliminari per monitorare landamento della T° durante le 20 h di esposizione al SAR maggiore (1.25 W/kg) mediante un termometro a fibra ottica inserito in orizzontale nella coltura Pisa, maggio 2012 III° studio

25 Lentità delladattamento variava al variare degli otto donatori esaminati Nessun effetto della sola RF RF data come AD induce un significativo decremento del danno indotto da MMC (AR) solo con 0,3 W/kg *P< % -52% Pisa, maggio 2012 III° studio RISULTATI

26 20h di esposizione a RF (1950 MHz, modulazione UMTS) nessun effetto della sola RF; induzione di AR – protezione da un successivo trattamento con MMC; effetto dipendente dal SAR; effetto simile a quello osservato in linfociti esposti a 900 MHz (GSM) Pisa, maggio 2012 III° studio

27 Verificare se la RA indotta da esposizioni a RF è dipendente dal meccanismo di azione con cui lagente utilizzato come challenge induce danno al DNA AD: 20 h RF in fase S; CD: 1 o 1.5 Gy RX a 48 h f = 1950 MHz; UMTS; SAR: 0.3 W/kg AD: 20 h RF in fase S; CD: 1 o 1.5 Gy RX a 48 h f = 1950 MHz; UMTS; SAR: 0.3 W/kg Pisa, maggio 2012 IV° studio Scopo MMC - induttore di crosslinks (legami crociati tra le eliche del DNA) Raggi X - induttori di rotture dirette al DNA

28 Pisa, maggio 2012 IV° studio RISULTATI Nessun effetto della sola RF Lesposizione a RF induce un significativo decremento del danno indotto da 1.5 Gy di RX Nessun effetto sul danno indotto da dosi minori (1 Gy) Risultati ottenuti da colture di linfociti da quattro donatori Progetto INFN – ARCAICA ( ) CNR – IREA & Dipartimento di Scienze Fisiche, Università Federico II (G Gialanella, GF Grossi, L Manti, P Scampoli) Manoscritto in corso di stesura

29 a.impiego di tipi cellulari differenti per valutare la RA da RF in dipendenza dal tipo cellulare (fibroblasti di roditore) b. valutazione dei meccanismi alla base della RA da RF (apoptosi, ciclo cellulare, enzimi di riparo del DNA) c. Valutazione di altre condizioni sperimentali in grado di indurre RA (durate dellesposizione, campi statici, campi ELF, ….) Pisa, maggio 2012 attività in corso

30 Pre-esposizioni di topi a 900 MHz (GSM), 120 µW/cm 2 1 h/g per 14 gg e poi a una dose letale di raggi gamma (8 Gy) inducevano un significativo incremento di sopravvivenza rispetto ad animali esposti solo ai raggi gamma. (Cao et al., 2011). Recentemente, due gruppi di ricerca indipendenti hanno riportato che pre-esposizioni a RF inducono AR in roditori esposti ad alte dosi di radiazioni ionizzanti Pisa, maggio 2012 Pre-esposizioni di topi a 900 MHz at 120 µW/cm2 per 4 h/g per 1, 3, 5, 7 e 14 gg e poi esposti a una dose acuta di raggi gamma (3 Gy) inducevano un significativo decremento del danno al DNA (comet) rispetto ad animali esposti solo ai raggi gamma. (Cao et al., 2012). Jiang B, Nie J, Zhou Z, Zhang J, Tong J, et al. (2012) Adaptive Response in Mice Exposed to 900 MHz Radiofrequency Fields: Primary DNA Damage. PLoS ONE 7(2): e doi: /journal.pone

31 Pre-esposizioni di topi (6 h/g per 5 gg) a 900 MHz (GSM, SAR 1.2 W/kg) e ratti per 6 gg e poi esposti a una dose letale di raggi gamma (8.8 Gy) inducono aumento di sopravvivenza rispetto alle esposizioni con soli raggi gamma (Mortazavi et al., 2011) Recentemente, due gruppi di ricerca indipendenti hanno riportato che pre-esposizioni a RF inducono AR in roditori esposti ad alte dosi di radiazioni ionizzanti Pisa, maggio 2012

32 CONCLUSIONI La resistenza indotta da pre-esposizioni a RF da comuni sorgenti quali i telefoni cellulari potrebbe interferire con la risposta a successivi trattamenti terapeutici La caratterizzazione di RA da RF potrebbe aprire nuove prospettive verso luso delle radiazioni non ionizzanti per la protezione delluomo dallazione genotossica di trattamenti per scopi diagnostici (rischio di trasformazione cellulare dovuto alle conseguenze di esposizioni protratte a basse dosi di RI) Pisa, maggio 2012


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