La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

Struttura terziaria del DNA. Molte molecole naturali di DNA sono circolari, senza code 3 o 5 libere. La maggior parte del DNA circolare naturale é superavvolto.

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "Struttura terziaria del DNA. Molte molecole naturali di DNA sono circolari, senza code 3 o 5 libere. La maggior parte del DNA circolare naturale é superavvolto."— Transcript della presentazione:

1 Struttura terziaria del DNA

2 Molte molecole naturali di DNA sono circolari, senza code 3 o 5 libere. La maggior parte del DNA circolare naturale é superavvolto. Il tipo di struttura tridimensionale che coinvolge unorganizzazione di ordine superiore degli elementi, come il superavvolgimento, è detta struttura terziaria.

3 The shape and the dynamic of a DNA chain is strongly affected not only by the sequence but also by topological constrictions

4 In virus capsid-highly packed Bustamante Lab. Berkeley Steve Harvey Lab. 10 m long linear DNA is packed in a nm size box

5 In bacteria (see DNA supercoiling)

6 A T T A G C C G G C TATA T A G C C G G C T A A T Packaging DNA Histone proteins Histone octamer B DNA Helix 2 nm

7 A T T A G C C G G C TATA T A G C C G G C T A A T Packaging DNA Histone proteins B DNA Helix Histone octamer 2 nm

8 A T T A G C C G G C TATA T A G C C G G C T A A T Packaging DNA Histone proteins Histone octomer Nucleosome 11 nm B DNA Helix 2 nm

9 Modello Jmol Nucleosome.pdb

10 Packaging DNA A T T A G C C G G C T A A T

11 Packaging DNA A T T A G C C G G C T A A T

12 Packaging DNA A T T A G C C G G C T A A T Protein scaffold 11 nm Beads on a string 30 nm Tight helical fiber Looped Domains 200 nm

13 Packaging DNA G C A T Protein scaffold Metaphase Chromosome 700 nm 11 nm 30 nm 200 nm 2 nm Looped Domains Nucleosomes B DNA Helix Tight helical fiber

14 Cenni sulla topologia del DNA Il DNA può essere superavvolto: lasse dellelica del DNA può essere, in natura, avvolto a sua volta in unelica stabile. Per essere stabile, il DNA deve formare un dominio topologico chiuso, ad esempio il DNA deve essere covalentemente chiuso:circolare. DNA circolare rilassatosuperavv. solenoidalesuperavv. plectonemico Il DNA superavvolto può essere di tipo solenoidale o plectonemico (intrecciato)

15 How do we describe the topology of ccDNA? Linking Number If the ends of the double helix are brought together, the # of times W passes around C is a Topological constant, which cannot be changed without cutting the strands. This number is called LINKING NUMBER Pulling the two strands apart without nicking them, the number of crossings does not change

16 Il numero di Linking Definizione: È il numero di volte che una catena di DNA è connessa ad unaltra in modo tale che se voglio disconnetterle devo rompere un legame covalente. Da una proiezione (come quelle sopra) si ottiene L k sommando algebricamente il numero degli incroci (con il loro segno) e dividendo per 2. La somma algebrica serve a contare in modo appropriato gli incroci veri e distinguerli dalle sovrapposizioni della proiezione

17 With six positive crossings and two negative crossings, these curves have linking number two. Computing the linking number

18 Il numero di Linking L k0 = 20

19 Il numero di Linking di due curve nello spazio è: indipendente dalla proiezione scelta (è una proprietà topologica delle curve e non della proiezione spaziale scelta); Invariante per deformazioni continue delle curve, a meno che una delle curve non sia tagliata: è definito solo per DNA covalentemente chiusi. Lk è invariante se le due curve sono costrette su un piano o superavvolte nello spazio; Lk è sempre intero, siccome due curve possono essere connesse luna allaltra solo un numero intero di volte; Il segno di Lk cambia se lorientazione di una delle curve è invertita; loperazione di riflessione rispetto ad un piano di simmetria genera due curve con Lk invertito di segno

20 L k0 = T w0 Il numero di Linking del DNA rilassato Lk° è N/h, dove N è il numero delle basi e h le basi/spira,

21 Si comprende che il processo di introdurre superavvolgimenti in una molecola di DNA (svolgimento o sovravvolgimento dellelica destrogira prima della chiusura di una molecola lineare in una circolare) riduce o aumenta il numero di giri delica intrappolati dalla chiusura e risulta in un cambiamento del numero Lk delle specie circolari. Se Lk° corrisponde (allincirca) al topoisomero con minori costrizioni possibili rispetto allo stato lineare, il topoisomero circolare rilassato, allora la variazione da Lk° è una misura del superavvolgimento. Lk= Lk–Lk° è la differenza di linking o deficit di linking, che può essere positivo o negativo. Nel DNA naturale, Lk<0, essendo questo sottoavvolto rispetto al DNA lineare. Più precisamente, Lk° è N/h, dove N è il numero delle basi e h le basi/spira, e può essere un numero non intero. E il caso di chiusura rilassata ideale, che spesso non si può ottenere (spesso i topoisomeri più rilassati hanno Lk= ±0.5 o simile.) Lk° non è un vero numero di linking (che deve essere intero), ma uno stato di riferimento (il numero di linking più prossimo è spesso chiamato Lk m ). Lintroduzione del superavvolgimento equivale allaggiunta di uno stress torsionale, tanto maggiore quanto corta è la molecola: Lk è spesso normalizzata per Lk°: = (Lk–Lk°)/Lk° detto differenza di linking specifica (densità di superavv.) Nel DNA naturale, = –0.06, in media.

22 Generalmente, il Tw può essere definito tramite vettori ruotanti che puntino da una curva C 1 allaltra C 2. Per due curve che si avvolgono lungo un asse rettilineo, Tw è pari allangolo di rotazione dei vettori diviso per 2π. Il caso di una curva circolare planare è analogo. Più in generale, qualora le curve non siano lineari o planari, e sia definibile la superficie di un nastro che le collega, In generale il Tw può non essere intero e cambia a seguito di deformazioni della curva C 1 o della superficie che collega C 1 a C 2. Il numero di Twist del DNA È il numero di volte che una catena si avvolge sullaltra. questo numero è positivo se lelica è destrogira, negativo se è levogira. Il Twist (Tw) non è necessariamente un numero intero, e nella maggior parte dei casi non lo è. In genere la lunghezza del DNA ed il suo passo in soluzione permettono di definire Tw=lunghezza(bp)/passo(bp/spira)

23 Il numero di Writhe È il numero di volte che lasse dellelica si avvolge su se stesso nello spazio. Il writhe (Wr) dipende solamente dalla traiettoria dellasse della doppia elica nello spazio, non dal fatto che il DNA abbia 2 eliche avvolte luna sullaltra. Wr non ha necessariamente un valore intero. Se la traiettoria del DNA giace su un piano, Wr è sempre 0. Wr=0 anche se la traiettoria del DNA giace su una superficie sferica. Come mostrato in una delle diapositive precedenti, il DNA può avvolgersi nello spazio in due modi, essenzialmente: se si avvolge attorno a se stesso lo fa generalmente nel modo plectonemico (intrecciato), se si avvolge intorno ad un oggetto, lo fa in modo solenoidale. In soluzione il writhe isomerizza tra le due forme.

24 Il legame tra Tw, Wr e Lk La relazione fondamentale che lega i tre descrittori del superavvolgimento è: Lk=Tw+Wr Che lega una proprietà topologica, il linking (intero), con due proprietà geometriche, il twisting ed il writhing (interi o frazionari). Per ogni valore di Lk, esiste una distribuzione di forme allequilibrio che ripartiscono il Tw ed il Wr in modo differente. Nelle forme a basso Wr (in valore assoluto), la tensione torsionale è principalmente a carico del twist dellelica (lelica è sotto tensione, con un numero diverso di basi/spira rispetto allo stesso DNA lineare in soluzione); nelle forme ad alto Wr, la tensione torsionale è scaricata grazie al superavvolgimento dellasse dellelica, mentre localmente il DNA non è alterato.

25 Il superavvolgimento negativo (ottenuto mediante legame in forma di superelica sinistrorsa con le proteine) è un modo per immagazzinare tensione elastica che può essere spesa per svolgere un certo numero di spire delica, processo necessario per il funzionamento degli enzimi che interagiscono con una catena del DNA alla volta (le polimerasi, ad esempio.

26 Supercoiling e trascrizione Durante la trascrizione, il complesso RNAPol-RNAnascente rappresenta un oggetto molto grande, probabilmente anche associato ad altre parti della cellula, per cui praticamente stazionario. Il DNA deve muoversi relativamente alla polimerasi, passandogli attraverso. Ci deve essere un moto rotatorio relativo tra DNA e RNAPol; Il moto in avanti causerebbe un accumulo di twist di fronte alla proteina ed un deficit alle spalle. Questo dovrebbe, di conseguenza, manifestarsi come un superavvolgimento positivo di fronte ed uno negativo alle spalle della polimerasi. Siccome la trascrizione non rompe le catene di DNA, la tensione non può scaricarsi da sola. Se il meccanismo avviene in un plasmide libero in soluzione, supercoiling positivo e negativo possono ricombinarsi per annullarsi (per visualizzarlo, Liu e Wang misero in soluzione una topoisomerasi in grado di rilassare istantaneamente solo il superavvolgimento negativo...)

27 In modo simile si possono formare le giunzioni di Holliday Sequenze palindromiche possono estrudere strutture cruciformi

28 Anche la formazione di cruciformi è un modo per scaricare la tensione del superavvolgimento del DNA (in modo quantitativamente diverso dalla formazione del Z–DNA.) Anche questo tipo di transizione si può studiare con le elettroforesi bidimensionali. Il grado di svolgimento è pari al numero di giri delica che subiscono lestrusione del cruciforme, poiché nel cruciforme le catene non sono avvolte una rispetto allaltra.

29 Come posso determinare il superavvolgimento?

30 Leffetto degli intercalanti: Un intercalante contiene una struttura planare aromatica, usualmente policiclica, che si può inserire tra due coppie di basi del DNA. Questo causa uno svolgimento locale dellelica, che risulta in un incremento del numero di basi per spira (helical repeat) quindi una diminuzione del twist. Ad esempio, il Bromuro di etidio lega fortemente il DNA a doppia catena (ed ha un grande incremento della fluorescenza quando è legato) ed il legame di ogni molecola di etidio causa uno svolgimento locale di 26°. Bromuro di etidio Clorochina Dallequazione generale Lk= Tw + Wr, un decremento del Tw corrisponde ad un incremento del Wr, per cui un aumento della quantità di etidio nel DNA corrisponderà ad una transizione verso valori sempre più positivi di Wr. Si noti che la concentrazione di 1µg/ml utilizzata abitualmente per la gel elettroforesi satura completamente il DNA di etidio.

31 Leffetto del bromuro di etidio sul DNA superavvolto +EthBr Topoisomerasi I –EthBr Le topoisomerasi sono enzimi che agiscono sullo stato topologico del DNA, tagliandolo e ricucendolo. La Topoisomerasi I, ad esempio, rilassa il DNA superavvolto (riduzione del Wr). Wr<0 Wr=0 Wr>0 Wr=0Wr>0Wr=0Wr<0

32 La misura sperimentale del superavvolgimento: Sono svariati i metodi che possono dare informazioni sul DNA superavvolto, i metodi più diretti sono losservazione microscopica, con particolare riguardo ai metodi che possono dare informazioni tridimensionali (AFM, CryoEM). Le prime osservazioni al microscopio elettronico risalgono al lavoro di Vinograd del 1963, lanno a cui si fa risalire la scoperta del DNA circolare (avvenuta grazie a studi di velocità di sedimentazione di DNA di polyoma virus) e del superavvolgimento del DNA. Dalle osservazioni microscopiche si nota molto bene il fenomeno del branching per il quale la tensione elastica del superavvolgimento può dare vita a strutture plectonemiche ramificate, nello stesso modo in cui può generare strutture plectonemiche lineari.

33 Dalle osservazioni al microscopio, congiunte a quelle biochimiche si è giunti alla conclusione che il Lk si ripartisce per circa il 70% in writhing e per il restante 30% in twisting. Questa ripartizione dipende dal rapporto tra le elasticità torsionale e flessurale del DNA: se costa molta più energia torcere il DNA che piegarlo, allora la tensione elastica del sottoavvolgimento si scarica soprattutto sul writhe, che consente di recuperare una torsione di equilibrio; viceversa, se costa molta più energia piegare il DNA piuttosto che torcerlo, la tensione dellavvolgimento si localizzerà prevalentemente a livello di twisting, senza aumentare il writhing (che comporta una piegatura più accentuata di sezioni del DNA). Si può prevedere che sezioni del DNA che possono assumere forme curvate, siano più facilmente localizzate nei loop delle forme intrecciate, piuttosto che nei pressi degli incroci, dove il DNA è più dritto. Si può comunque prevedere che la barriera energetica per linterconversione sia piuttosto bassa, probabilmente sotto kT, per cui possa facilmente avvenire uno slittamento del DNA che, associato al branching consentirà ad un tratto di DNA di essere presente alternativamente in zone di loop o di incrocio. Un campione di DNA superavvolto al microscopio: nella maggioranza delle preparazioni sono compresenti molecole superavvolte, molecole circolari nicked che restano rilassate e molecole lineari (la frazione di queste ultime forme aumenta se il campione viene maltrattato perché il DNA sotto tensione di superavvolgimento è fragile e basta anche un solo nick per permettergli di rilassare il superavvolgimento).

34 Un esempio sperimentale: la determinazione di Wr in microscopia Per misurare Wr i metodi di microscopia ad alta risoluzione sono tra i più utilizzati, poiché permettono di determinare direttamente la traiettoria dellasse della doppia elica del DNA nello spazio (o più spesso in un piano). Un esempio: TEM di DNA superavvolto Una immagine AFM di DNA superavvolto (molecola di pBR322, 4361 bp): lAFM ottiene direttamente informazioni tridimensionali e può determinare direttamente e semplicemente la traiettoria tridimensionale dellasse molecolare della molecola osservata, per poterne calcolare il Wr: si determina direttamente la chiralità del superavvolgimento.

35 Studio SFM della dinamica di plasmidi (dsDNA) superavvolti LAFM può osservare campioni in fluido, in modo che questi siano liberi di muoversi sulla superficie. Nella sequenza di immagini a fianco, lo stesso gruppo di molecole sono state osservate durante un lungo intervallo di tempo, in condizioni di adesione diversa sulla superficie, in modo da poterne modulare la dinamica. Si possono notare le dimensioni dei loops cambiare. Negli ultimi fotogrammi un aumento brusco della dinamica permette alle molecole di cambiare radicalmente forma.

36 Studi mediante gel-elettroforesi La mobilità elettroforetica del DNA superavvolto dipende dal grado di superavvolgimento: è facile, in opportune condizioni, distinguere i vari topoisomeri. La mobilità elettroforetica aumenta in modo monotono con laumento del valore assoluto del numero di Linking. Questo è dovuto al fatto che topoisomeri dotati di maggiore differenza di linking, hanno maggiore writhe, per cui sono più compatti. Questo è vero a meno che non avvengano transizioni conformazionali che alterino lo stress del superavvolgimento. Per i campioni di DNA superavvolto nativo di tipo circolare (plasmidi), la distribuzione di topoisomeri è spesso molto stretta ed a valori molto alti, per cui non è facile distinguere su una normale elettroforesi i vari topoisomeri che costituiscono la popolazione. Una corsa elettroforetica di DNA superavvolto con Lk variabile da 0 a 8. Ogni banda contiene DNA assolutamente uguale (stessa sequenza, lunghezza e peso molecolare) che differisce solo per Lk. OC rappresenta DNA open circular in cui le catene fosfoesteree sono state rotte almeno in un punto di una catena, per cui il DNA può rilassare, mantenendo una forma circolare. Una digestione con un enzima di restrizione avente un sito unico su questo DNA produrrebbe una sola banda in un gel elettroforetico analogo (banda che generalmente migra più velocemente di OC). pBR322 nativo Pozzetti Circolare rilassato Lineare Superavvolto

37 Gel elettroforesi + intercalanti Nel 1975, Keller introdusse un metodo nuovo per caratterizzare il Lk del DNA superavvolto: lintroduzione di una quantità variabile di bromuro di etidio nel DNA durante la corsa elettroforetica modifica lo stress del superavvolgimento, in ragione di N/360, dove è il numero di molecole di intercalante che si lega per coppia di basi, è langolo di svolgimento della doppia elica indotto dallintercalante, N è il numero di coppie di basi. Una quantità opportuna di etidio aggiunta al DNA nativo (che è molto sottoavvolto e appare come una sola banda a migrazione veloce) lo svolge parzialmente fino a portarlo in un campo in cui i vari topoisomeri hanno mobilità visibilmente dipendente dal grado di superavvolgimento. a b c Lo stesso DNA nativo di SV40 fatto migrare su tre distinti (simili) gel elettroforetici contententi 0 (a), (b), 0.06 µg/ml (c) di etidio bromuro. In (a) si notano solo la banda contenente tutti i topoisomeri, in (b) i topoisomeri sono stati separati grazie allintercalazione, in (c) una maggiore concentrazione di etidio ha rilassato tutti i topoisomeri. Se sono contenuti e risolti tutti i topoisomeri da Lk=0 a Lk nativo, uno può semplicemente contare il valore di Lk.

38 Un modo per contare ed assegnare direttamente i topoisomeri è lelettroforesi bidimensionale, la cui introduzione si deve a James Wang

39 Un esempio reale di elettroforesi bidimensionale per un campione contenente molti topoisomeri La risoluzione nella prima dimensione giunge a saturazione per topoisomeri oltre il 18-esimo.


Scaricare ppt "Struttura terziaria del DNA. Molte molecole naturali di DNA sono circolari, senza code 3 o 5 libere. La maggior parte del DNA circolare naturale é superavvolto."

Presentazioni simili


Annunci Google