STUDI SU NUOVI APPROCCI TERAPEUTICI

Presentazione sul tema: "STUDI SU NUOVI APPROCCI TERAPEUTICI"— Transcript della presentazione:

1 STUDI SU NUOVI APPROCCI TERAPEUTICI
GLICOGENOSI TIPO 2: STUDI SU NUOVI APPROCCI TERAPEUTICI Giancarlo Parenti

2 Glicogenosi 2 (Malattia di Pompe)
Frequenza: 1: Deficit enzimatico: -glucosidasi acida (GAA)

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6 Endoplasmic reticulum
Autophagy Golgi apparatus Autophagosome Phagocytosis Primary lysosomes exocytosis Secondary lysosomes Exocytosis Late endosome Residual bodies endocytosis Early endosome

7 Endoplasmic reticulum
Autophagy Golgi apparatus Autophagosome Phagocytosis Primary lysosomes exocytosis Secondary lysosomes Exocytosis Late endosome Residual bodies endocytosis Early endosome

8 Endoplasmic reticulum
Autophagy Golgi apparatus Autophagosome Phagocytosis Primary lysosomes exocytosis Secondary lysosomes Exocytosis Late endosome Residual bodies endocytosis Early endosome

9 Glicogenosi 2 (Malattia di Pompe)
Frequenza: 1: Deficit enzimatico: -glucosidasi acida (GAA) Difetto molecolare: mutazioni del gene GAA Eterogeneità genetica: 272 mutazioni del gene GAA finora descritte ( mutazione

10 Glicogenosi 2 (Malattia di Pompe)
Frequenza: 1: Deficit enzimatico: -glucosidasi acida (GAA) Difetto molecolare: mutazioni del gene GAA Accumulo generalizzato di glicogeno, più accentuato in: cuore muscolo scheletrico fegato

11 Malattia di Pompe Frequenza: 1: 40.000
Deficit enzimatico: -glucosidasi acida (GAA) Difetto molecolare: mutazioni del gene GAA Accumulo generalizzato di glicogeno, più accentuato in: cuore muscolo scheletrico fegato

12 Malattia di Pompe Frequenza: 1: 40.000
Deficit enzimatico: -glucosidasi acida (GAA) Difetto molecolare: mutazioni del gene GAA Accumulo generalizzato di glicogeno, più accentuato in: cuore muscolo scheletrico fegato

13 Malattia di Pompe Variabilità clinica:
Esordio precoce: classica infantile, non classica Esordio tardivo: seconda infanzia, giovanile, adulta Primi segni exitus 1 Età, mesi 12 Deficit motori, Sedia a rotelle Supporto ventilatorio Primi segni 10 Età, anni 20 30

14 Malattia di Pompe Terapia enzimatica sostitutiva
Recombinant human a-glucosidase from rabbit milk in Pompe patients Hannerieke Van den Hout, Arnold JJ Reuser, Arnold G Vulto, M Christa Loonen, Adri Cromme-Dijkhuis, Ans T Van der Ploeg THE LANCET . Vol July 29, 2000 therapy (weeks) 200 400 600 800 LVMI (g/m2) 6 12 18 24 36 32

15 Terapia enzimatica sostitutiva nella
malattia di Pompe problemi Effetto variabile nelle forme tardive Scarsa efficacia sulle fibre muscolari tipo II In modelli animali sono richieste dosi molto alte (100 mg/kg/infusione) negli stati avanzati di malattia

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17 Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici
Per funzionare un enzima deve avere una struttura (“folding”) corretta

18 Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici
Un enzima deve maturare correttamente

19 Endoplasmic reticulum
Autophagy Phagocytosis Exocytosis Autophagosome exocytosis endocytosis Primary lysosomes Secondary Residual bodies Early endosome Late Endoplasmic reticulum Golgi apparatus Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici Un enzima deve funzionare nel posto giusto

20 Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici
Gli chaperones migliorano il “folding” di un enzima mutato Gli chaperones migliorano la maturazione dell’enzima Gli chaperones migliorano il traffico dell’enzima verso la sede corretta

21 Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici
Il miglioramento del “folding”, della maturazione e del “trafficking” si traducono in un aumento dell’attività residua

22 Deoxynojirimycin (DNJ)
Both compounds are inhibitors of glycosidases and glycosyltransferases NB-DNJ is used as substrate reducing agent in Gaucher disease IC50 for a-glucosidase 0.38 mM (DNJ) and 1.9 mM (NB-DNJ) (Andersson et al, 2004) OH CH2OH NH Deoxynojirimycin (DNJ) CH3 OH CH2OH N N-butyl deoxynojirimycin (NB-DNJ)

23 Pazienti studiati Pt fenotipo mutazione mutazione proteina DNA 1
Infantile non-classico (INC) 1655 C>T L552P 2 c.-35C>A Splicing anomalo 3 Giovanile (J) 1333G>C A445P 4 Giovanile(J) 1645G>C c.692+1G>C G549R 5 1064T>C L355P 6 c.-45T>G unknown sconosciuta 7 Infantile classico (IC) 1124G>T R375L 8 n.a. n.a

24 Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici
Attività

25 GAA activity in fibroblasts from Pompe patients GAA activity
untreated Control values 4 3 (nmoles 4-MU liberated/mg protein/hr) GAA activity 2 1 Patient Phenotype Genotype 1 INC L552P 2 INC L552P abn splic 3 J L552P A445P 4 J G549R abn splic 5 J L355P 6 J abn splic unknown 7 IC R375L 8 IC n.a.

26 GAA activity in fibroblasts from Pompe patients GAA activity
+ NB-DNJ + DNJ untreated Control values 4 3 (nmoles 4-MU liberated/mg protein/hr) GAA activity 2 1 Patient Phenotype Genotype 1 INC L552P 2 INC L552P abn splic 3 J L552P A445P 4 J G549R abn splic 5 J L355P 6 J abn splic unknown 7 IC R375L 8 IC n.a.

27 GAA activity in fibroblasts from Pompe patients GAA activity
+ NB-DNJ + DNJ untreated Control values 4 p<0.001 3 p<0.004 (nmoles 4-MU liberated/mg protein/hr) GAA activity p<0.019 p<0.002 p<0.001 2 p<0.002 p<0.008 1 p<0.010 Patient Phenotype Genotype 1 INC L552P 2 INC L552P abn splic 3 J L552P A445P 4 J G549R abn splic 5 J L355P 6 J abn splic unknown 7 IC R375L 8 IC n.a.

28 Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici
Maturazione

29 Western blot analysis - + - +
fibroblasts Patient 1 4 7 contr Phenotype NCI J CI Genotype L552P/L552P G549R/ abn splicing R375L/R375L NB-DNJ - + 110 kDa 70-76 kDa -actin 110 kDa 70-76 kDa -actin 95 kDa HEK293T 293 w.t. L552P G549R A445P R375L NB-DNJ - +

30 Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici
“Trafficking”

31 GAA a m. di Pompe b m. di Pompe + chaperone c normale

32 GAA LAMP2 a d m. di Pompe b e m. di Pompe + chaperone c f normale

33 a d g b e h c f i GAA LAMP2 Merge m. di Pompe m. di Pompe + chaperone
normale

34 Stimolazione enzimatica della GAA con chaperones
Sommario Mutazione Fenotipo Aumento attivita’ Effetto sulla maturazione L552P intermedio + G549R lieve A445P severo - L355P R375L S529V lieve + E521K severo - M519T Y455F lieve + P545L intermedio

35 Stimolazione enzimatica della GAA con chaperones
Sommario Pazienti studiati 21

36 Stimolazione enzimatica della GAA con chaperones
Sommario Pazienti studiati Aumento attivita’ % Nessun aumento 21 5 23.8 16 76.2

37 Conclusioni Due farmaci (DNJ e NB-DNJ) migliorano l’attività enzimatica della GAA Per il momento sono disponibili solo dati in vitro, cioè in cellule di laboratorio L’effetto positivo dei farmaci si osserva solo in cellule di pazienti con specifiche mutazioni del gene GAA Questi risultati potrebbero indicare un possibile trattamento alternativo alla terapia enzimatica sostitutiva almeno in alcuni pazienti

38 Programma di ricerca futuro
Identificazione di mutazioni responsive al trattamento con chaperones Uso combinato di terapia enzimatica sostitutiva e chaperones Valutazione in vivo

39 Francesca Donaudy Barbara Rossi Monica Cardone Ida Annunziata Germana Meroni Andrea Ballabio Giancarlo Parenti Alfredo Zuppaldi Rosaria Tuzzi Katia Porto Generoso Andria Giancarlo Parenti

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42 Mutations expressed at the Dept of Pediatrics - Tigem
100 untreated + DNJ 75 (nmoles 4-MU liberated/mg protein/hr) GAA activity 50 25 e.v. w.t. Am 03 Am 04 Am 05 Am 06 Am 07 Am 08 Am 09 Am 10 552 549 529 445 375 521 519

43 aa position at exon boundaries
Pharmacological enhancement of mutated a-Glucosidase in fibroblasts from Patients with Pompe Disease Expression of single mutations in HEK293T 182 231 286 318 359 399 442 480 517 546 585 680 730 778 827 882 933 952 630 140 233 398 470 652 925 110 kDa intracellular membrane bound 110 kDa secreted 95-76 kDa 70 kDa active site Glycosylation sites aa position at exon boundaries 76 kDa

44 Imino sugar treatment in Pompe disease aa position at exon boundaries
Summary Y455F S529V G549R P549L L552P Glycosylation sites 140 233 398 470 652 882 925 182 286 359 442 517 585 680 778 882 952 aa position at exon boundaries 231 318 399 480 546 630 730 827 933

45 Catalytic site GAA model structure red non-responsive mutations
green responsive mutations Catalytic site FUGUE Sequence-structure homology recognition / SWISS MODEL

46 Lysosomal storage diseases in which pharmacological chaperone effects have been demonstrated
Enzyme deficiency Reference Fabry disease a-galactosidase A Fan et al, 1999 Asano et al, 2000 Frustaci et al, 2001 GM1 gangliosidosis b-galactosidase Matsuda et al, 2003 GM2 gangliosidosis b-hexosaminidase Tropak et al, 2004 Gaucher disease b-glucosidase Sawkar et al, 2005

47 ERT (20 mg/kg/week) in a Pompe KO mouse
Raben et al, 2003 GAA activity (nmol/mg/hr) % normal Glycogen clearance % Muscle 0.7 +/- 0.1 9.7 38 Heart 3.8 +/- 0.3 32.5 95 Liver /- 27.1 2464.0 75

48 ERT (100 mg/kg/week) in a Pompe KO mouse
Raben et al, 2003 GAA activity (nmol/mg/hr) % normal Glycogen clearance % Muscle 2.5 +/- 0.3 32.6 74 Heart 9.4 +/- 1.4 99.0 98 Liver /- 13.7 2798.0

49 Enzyme enhancement by pharmacological chaperones
Messenger RNA 3’ 5’ ribosome Endoplasmic reticulum membrane lumen Molecular chaperones protein Correct folding and assembly Misfolding Wild type protein mutant protein Golgi apparatus Degradation lysosome

50 Enzyme enhancement by pharmacological chaperones
Messenger RNA 3’ 5’ ribosome Endoplasmic reticulum membrane Pharmacological chaperone lumen Molecular chaperones protein Correct folding and assembly Misfolding Wild type protein mutant protein Golgi apparatus Golgi apparatus Degradation lysosome lysosome

51 Effects of NB-DNJ concentrations and time course of GAA enhancement
Range of plasma concentrations in Gaucher patients treated with NB-DNJ (Cox et al, 2000) 5 4 (nmoles 4-MU liberated/mg protein/hr) GAA activity 3 2 1 10 20 30 50 80 3 6 9 13 15 NB-DNJ concentration (mM) Time (days)

52 Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici
Gli chaperones migliorano il “folding” delle proteine