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GLICOGENOSI TIPO 2: STUDI SU NUOVI APPROCCI TERAPEUTICI Giancarlo Parenti.

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Presentazione sul tema: "GLICOGENOSI TIPO 2: STUDI SU NUOVI APPROCCI TERAPEUTICI Giancarlo Parenti."— Transcript della presentazione:

1 GLICOGENOSI TIPO 2: STUDI SU NUOVI APPROCCI TERAPEUTICI Giancarlo Parenti

2 Glicogenosi 2 (Malattia di Pompe) Frequenza: 1: Deficit enzimatico: -glucosidasi acida (GAA)

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6 Autophagy Phagocytosis Exocytosis Autophagosome exocytosis endocytosis Primary lysosomes Secondary lysosomes Residual bodies Early endosome Late endosome Endoplasmic reticulum Golgi apparatus

7 Autophagy Phagocytosis Exocytosis Autophagosome exocytosis endocytosis Primary lysosomes Secondary lysosomes Residual bodies Early endosome Late endosome Endoplasmic reticulum Golgi apparatus

8 Autophagy Phagocytosis Exocytosis Autophagosome exocytosis endocytosis Primary lysosomes Secondary lysosomes Residual bodies Early endosome Late endosome Endoplasmic reticulum Golgi apparatus

9 Glicogenosi 2 (Malattia di Pompe) Frequenza: 1: Deficit enzimatico: -glucosidasi acida (GAA) Difetto molecolare: mutazioni del gene GAA Eterogeneità genetica: 272 mutazioni del gene GAA finora descritte (http://www.pompecenter.nl) mutazione

10 Glicogenosi 2 (Malattia di Pompe) Frequenza: 1: Deficit enzimatico: -glucosidasi acida (GAA) Difetto molecolare: mutazioni del gene GAA Accumulo generalizzato di glicogeno, più accentuato in: cuore muscolo scheletrico fegato

11 Malattia di Pompe Frequenza: 1: Deficit enzimatico: -glucosidasi acida (GAA) Difetto molecolare: mutazioni del gene GAA Accumulo generalizzato di glicogeno, più accentuato in: cuore muscolo scheletrico fegato

12 Malattia di Pompe Frequenza: 1: Deficit enzimatico: -glucosidasi acida (GAA) Difetto molecolare: mutazioni del gene GAA Accumulo generalizzato di glicogeno, più accentuato in: cuore muscolo scheletrico fegato

13 Malattia di Pompe Variabilità clinica: Primi segni Età, anni Supporto ventilatorio Deficit motori, Sedia a rotelle Esordio precoce: classica infantile, non classica Esordio tardivo:seconda infanzia, giovanile, adulta exitusPrimi segni Età, mesi112

14 Recombinant human -glucosidase from rabbit milk in Pompe patients Hannerieke Van den Hout, Arnold JJ Reuser, Arnold G Vulto, M Christa Loonen, Adri Cromme-Dijkhuis, Ans T Van der Ploeg THE LANCET. Vol 356. July 29, 2000 Malattia di Pompe Terapia enzimatica sostitutiva therapy (weeks) LVMI (g/m 2 )

15 Terapia enzimatica sostitutiva nella malattia di Pompe problemi Effetto variabile nelle forme tardive Scarsa efficacia sulle fibre muscolari tipo II In modelli animali sono richieste dosi molto alte (100 mg/kg/infusione) negli stati avanzati di malattia

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17 Per funzionare un enzima deve avere una struttura (folding) corretta Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici

18 Un enzima deve maturare correttamente

19 Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici Un enzima deve funzionare nel posto giusto

20 Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici Gli chaperones migliorano il folding di un enzima mutato Gli chaperones migliorano la maturazione dellenzima Gli chaperones migliorano il traffico dellenzima verso la sede corretta

21 Il miglioramento del folding, della maturazione e del trafficking si traducono in un aumento dellattività residua Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici

22 N-butyl deoxynojirimycin (NB-DNJ) Deoxynojirimycin (DNJ) Both compounds are inhibitors of glycosidases and glycosyltransferases NB-DNJ is used as substrate reducing agent in Gaucher disease IC 50 for -glucosidase 0.38 M (DNJ) and 1.9 M (NB-DNJ) (Andersson et al, 2004) OH CH 2 OH OH NH CH 3 OH CH 2 OH OH N

23 Pazienti studiati Ptfenotipomutazione DNA mutazione proteina 1Infantile non-classico (INC) 1655 C>T L552P 2Infantile non-classico (INC) 1655 C>T c.-35C>A L552P Splicing anomalo 3Giovanile (J)1655 C>T 1333G>C L552P A445P 4Giovanile(J)1645G>C c.692+1G>C G549R Splicing anomalo 5Giovanile(J)1064T>C L355P 6Giovanile(J)c.-45T>G unknown Splicing anomalo sconosciuta 7Infantile classico (IC) 1124G>T R375L 8Infantile classico (IC) n.a.n.a

24 Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici Attività

25 2 GAA activity (nmoles 4-MU liberated/mg protein/hr) GAA activity in fibroblasts from Pompe patients untreated Control values Patient Phenotype Genotype 1 INC L552P 2 INC L552P abn splic 3 J L552P A445P 4 J G549R abn splic 5 J L355P 8 IC n.a. 6 J abn splic unknown 7 IC R375L

26 GAA activity in fibroblasts from Pompe patients Patient Phenotype Genotype 1 INC L552P 2 INC L552P abn splic 3 J L552P A445P 4 J G549R abn splic 5 J L355P 8 IC n.a. 6 J abn splic unknown 7 IC R375L + NB-DNJ + DNJ untreated Control values GAA activity (nmoles 4-MU liberated/mg protein/hr) 3 1 4

27 GAA activity in fibroblasts from Pompe patients Patient Phenotype Genotype 1 INC L552P 2 INC L552P abn splic 3 J L552P A445P 4 J G549R abn splic 5 J L355P 8 IC n.a. 6 J abn splic unknown 7 IC R375L + NB-DNJ + DNJ untreated Control values GAA activity (nmoles 4-MU liberated/mg protein/hr) p<0.001 p<0.004 p<0.019 p<0.002 p<0.010 p<0.002 p<0.008

28 Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici Maturazione

29 Patient147contr PhenotypeNCIJCI Genotype L552P/L552PG549R/ abn splicing R375L/R375L NB-DNJ kDa kDa - actin Western blot analysis fibroblasts 110 kDa kDa -actin 95 kDa HEK293T 293w.t.L552PG549RA445PR375L NB-DNJ

30 Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici Trafficking

31 a b c m. di Pompe normale GAA m. di Pompe + chaperone

32 a b c d e f m. di Pompe normale GAALAMP2 m. di Pompe + chaperone

33 a b c d e f g h i m. di Pompe normale GAALAMP2Merge m. di Pompe + chaperone

34 Stimolazione enzimatica della GAA con chaperones Sommario MutazioneFenotipo Aumento attivita Effetto sulla maturazione L552Pintermedio ++ G549Rlieve ++ A445Psevero -+ L355Psevero -- R375Lsevero -- Y455Flieve ++ P545Lintermedio ++ S529Vlieve ++ E521Ksevero -- M519Tsevero -+

35 Pazienti studiati 21 Stimolazione enzimatica della GAA con chaperones Sommario

36 Pazienti studiati Aumento attivita % Nessun aumento % Stimolazione enzimatica della GAA con chaperones Sommario

37 Conclusioni Due farmaci (DNJ e NB-DNJ) migliorano lattività enzimatica della GAA Per il momento sono disponibili solo dati in vitro, cioè in cellule di laboratorio Leffetto positivo dei farmaci si osserva solo in cellule di pazienti con specifiche mutazioni del gene GAA Questi risultati potrebbero indicare un possibile trattamento alternativo alla terapia enzimatica sostitutiva almeno in alcuni pazienti

38 Programma di ricerca futuro Valutazione in vivo Identificazione di mutazioni responsive al trattamento con chaperones Uso combinato di terapia enzimatica sostitutiva e chaperones

39 Alfredo Zuppaldi Rosaria Tuzzi Katia Porto Generoso Andria Giancarlo Parenti Francesca Donaudy Barbara Rossi Monica Cardone Ida Annunziata Germana Meroni Andrea Ballabio Giancarlo Parenti

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42 e.v.w.t.Am 10 Am 03 Am 04 Am 05 Am 06 Am 07 Am 08 Am GAA activity (nmoles 4-MU liberated/mg protein/hr) untreated + DNJ Mutations expressed at the Dept of Pediatrics - Tigem

43 Pharmacological enhancement of mutated -Glucosidase in fibroblasts from Patients with Pompe Disease Expression of single mutations in HEK293T kDa intracellular membrane bound 110 kDa secreted kDa 70 kDa active site Glycosylation sites aa position at exon boundaries 76 kDa

44 S529V Glycosylation sites aa position at exon boundaries G549R L552P Imino sugar treatment in Pompe disease Summary P549L Y455F

45 Catalytic site red non-responsive mutations green responsive mutations GAA model structure FUGUE Sequence-structure homology recognition / SWISS MODEL

46 Lysosomal storage diseases in which pharmacological chaperone effects have been demonstrated DiseaseEnzyme deficiencyReference Fabry disease -galactosidase A Fan et al, 1999 Asano et al, 2000 Frustaci et al, 2001 G M1 gangliosidosis -galactosidase Matsuda et al, 2003 G M2 gangliosidosis -hexosaminidase Tropak et al, 2004 Gaucher disease -glucosidase Sawkar et al, 2005

47 ERT (20 mg/kg/week) in a Pompe KO mouse Raben et al, 2003 GAA activity (nmol/mg/hr) % normalGlycogen clearance % Muscle0.7 +/ Heart3.8 +/ Liver /

48 GAA activity (nmol/mg/hr) % normalGlycogen clearance % Muscle2.5 +/ Heart9.4 +/ Liver / ERT (100 mg/kg/week) in a Pompe KO mouse Raben et al, 2003

49 Messenger RNA ribosome Endoplasmic reticulum membrane Misfolding Correct folding and assembly lumen protein Molecular chaperones Wild type protein mutant protein 3 5 Golgi apparatus lysosome Degradation Enzyme enhancement by pharmacological chaperones

50 Endoplasmic reticulum membrane Messenger RNA ribosome Misfolding Correct folding and assembly lumen protein Molecular chaperones Wild type protein mutant protein 3 5 Golgi apparatus lysosome Golgi apparatus Degradation Pharmacological chaperone Enzyme enhancement by pharmacological chaperones

51 Range of plasma concentrations in Gaucher patients treated with NB-DNJ (Cox et al, 2000) NB-DNJ concentration ( M) Time (days) Effects of NB-DNJ concentrations and time course of GAA enhancement GAA activity (nmoles 4-MU liberated/mg protein/hr)

52 Gli chaperones migliorano il folding delle proteine Stimolazione enzimatica (enzyme enhancement) mediante chaperones farmacologici


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