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IMMUNOBLOTTING Pag. 322 par. 7.6. Blocking molti siti di legame della membrana (di nitrocellulosa o PVDF) rimangono liberi da proteine dopo il trasferimento.

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1 IMMUNOBLOTTING Pag. 322 par. 7.6

2 Blocking molti siti di legame della membrana (di nitrocellulosa o PVDF) rimangono liberi da proteine dopo il trasferimento quindi si devono bloccare questi siti con BSA o dry Milk (latte in polvere) prima dellincubazione con anticorpi La BSA e generalmente piu purificata del latte in polvere ma contiene epitopi identici, quindi ha meno capacità bloccante rispetto al latte Il latte tuttavia non e raccomandato se si usano anticorpi che riconoscono carboidrati.

3 (stringenza dell ibridazione) Il TWEEN nel buffer di incubazione con lanticorpo serve per interferire con il legame aspecifico dellanticorpo alla membrana Un effetto indesiderato e che il Tween interferisce anche con il legame tra antigene e anticorpo e puo causare la dissociazione delle proteine dal filtro. Il detergente non ionico Tween-20 Quindi la concentrazione di Tween deve essere attentamente calibrata e dipende dalla forza dell interazione tra ligando e anticorpo

4 Immuno-blotting : 1.separazione del campione tramite PAGE (Poliacrilammide gel elettroforesi) 2. Western blotting: trasferimento delle proteine separate elettroforeticamente su membrana 3.BLOCKING : bloccaggio dei siti aspecifici 4.Rivelazione con anticorpi : primari (che riconoscono e legano recognize la proteina specifica di interesse) e secondari Proteina legata alla membrana Anticorpo primario Membrana Anticorpo secondario Fluoroforo o HRP o AF Anticorpo secondario Coniugato a:

5 Perché nellimmunodetection si usa un anticorpo secondario? Lanticorpo secondario riconosce specificamente le IgG del primario ed è coniugato con composti che ne permettono la evidenziazione Proteina legata alla membrana Anticorpo primario Membrana Anticorpo secondario Fluoroforo o HRP o AF Anticorpo secondario Coniugato a:

6 . -fluorofori, - colloidi doro -radioisotopi o, piu comunemente, ad un enzima (es. Fosfatasi alcalina AF o perossidasi di rafano HRP) L anticorpo secondario può essere coniugato a: Anticorpo primario Membrana Anticorpo secondario Fluoroforo o HRP o AF Anticorpo secondario Coniugato a:

7 La perossidasi di rafano (HRP) in presenza di perossido di idrogeno ossida il suo substrato, il luminolo, con concomitante emissione di luce ECL (Enhanced Chemioluminescence System) 10 volte piu sensibile di un metodo colorimetrico P MEMBRANAMEMBRANA Ab primario Ab secondario coniugato ad HRP Substrato ECL Luce emessa X-Ray film CCD camera Rivelazione:

8 Colorazione delle proteine su carta Ponceau S

9 C 22 H 12 N 4 O 13 S 4. Na 4 e un metodo rapido e reversibile di colorazione delle proteine dopo trasferimento su carta. meno sensibile del Comassie ma NON interferisce con le procedure di immuno-detection Ponceau S Staining Solution :(0.1%(w/v) Ponceau S in 5%(v/v) acetic acid) Colorazione delle proteine trasferite su carta con Ponceau S

10 ECL detection su membrana NC Gel SDS-PAGE colorato con CBB Membrana colorata con PonceauS Es. Colorazione su gel: Es. Colorazione su membrana: MW 1 2 Sec4 Sec4GFP

11 One Dimensional (1D) Protein Electrophoresis Separation: Isoelectric focusing (IEF) (par ) Altri tipi di elettroforesi: 2D PAGE pag 385 paragrafo 8.5.1

12 In un gradiente di pH e in presenza di un campo elettrico le proteina migreranno fino a raggiungere il punto nel gradiente dove la loro carica e nulla: Cioè al loro Punto isoelettrico Isoelectric focusing (IEF) IEF e un metodo per separare le proteine secondo il loro punto isoelettrico

13 IEF impiega gel orizzontali su piastre di vetro o fogli di plastica e percentuali di acrilammide e agarasio che permettono la libera mobilità dela molecole Per creare i gradienti nel gel si usano anfoliti = miscele complesse di di acidi poliammino-policarbossilici sintetici Gli anfoliti coprono diversi di pH (es.pH 3-10 o pH7-8) Il range di pH va scelto in dipendenza dei pI delle proteine di interesse

14 . Isoelectric focusing of proteins (IEF) Utile per separare proteine con differenti modificazioni (es. Fosforilazioni) o isoenzimi Creazione di un gradiente di pH usando anfoliti A.Nessun voltaggio applicato B.Gli anfoliti e le proteine si muovono quando la corrente e applicata secondo la loro carica C. Al pH isolelettrico le proteine sono focused cioè ferme

15 PROTEOMICA

16 L'elettroforesi bidimensionale (2D-Gels) ID =IEF. Le proteine vengono assorbite su strisce di gel secchi che hanno gradienti di pH immobilizzati. Una volta idratate e applicato il campo elettrico le proteine acide che si trovano sul lato alcalino del gel dissoceranno e saranno caricate negativamente. A causa del campo elettrico queste proteine migreranno al polo positivo (il lato acido del gel). 2D: SDS-PAGE 2D ID pH 2 pH 11. IEFIEF Gel figure from 2D= SDS-PAGE

17 The MALDI-ToF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight) MALDI ToF permette l analisi rapida di proteine digerite purificate da spots ottenuti da gel 2D or possibilmente 1D gel, by peptide mass fingerprinting. Parent masses of whole intact proteins can also be measured. Questo strumento è anche eccellente per determinare modificazioni che cambiano la massa o lo stato di carica di proteine note. Es. di uno strumento di Maldi-Tof in commercio

18 Spettrometria di Massa MS-MALDI TOF -Le molecole di campione sono convertite in ioni gassosi -gli ioni sono poi accellerati in un campo elettrico o magnatico o viene misurato il TOF di ioni di massa diversa in una data distanza - separati da unanalizzatore di massa-carica (m/z) -il rivelatore detrmina il rapporto massa/carica di ogni specie ionizzata MALDI-TOF (Ionizzazione per desorbimento laser assistito da una matrice) Time of flight) mass spectometer Analisi dati Sistema ad alto vuoto entrata sorgete di ioni Analizza- tore di massa rivelatore MALDI TOF TOF=Time of Flight Tempo impiegato da ioni di massa diversa per percorrere un data distanza

19 MALDI, spettrometria di massa TOF e MALDI-TOF Pag paragrafo D PAGE pag 385 paragrafo 8.5.1

20 Lelettroforesi capillare e usata per la separazione analitica delle proteine, aminoacidi, peptidi e frammenti di DNA dati catodo anodo tempo ASSOBANZAASSOBANZA Elettroforasi capillare Fonte di luce rivelatore

21 CZE: elettroforesi capillare in soluzione libera HPCE: elettroforesi capillare zonale CE: Elettroforesi capillare, TIPI di ELETTROFORESI CAPILLARE

22 Le estremità del capillare sono immerse nel serbatoi riempiti con lelettrolita. Gli elettrodi sono fatti di platino e sono anche inseriti nei serbatoi con lelettrolita. Il campione (nanomoli) viene inniettato a una estremità nel capillare. Generalmente un rivelatore ad assorbanza UV si trova alla estremità opposta del capillare.Il rivelatore genera un grafico in funzione del tempo Alto voltaggio (typicamente 10-30kV) capillare sottile ( mm). Vantaggi: nanolitri di campione sono sufficienti e lanalisi è effettuata in tempo reale con alta sensibilità (fentomoli ) dati catodo anodo tempo ASSOBANZAASSOBANZA Elettroforasi capillare Fonte di luce rivelatore

23 Tecniche cromatografiche Nella cromatografia si definisce : una fase mobile (liquida o gassosa che fluisce sopra o attraversa una fase stazionaria (un solido, un gel, un liquido o una miscela solido liquido immobilizzata). I composti che devono essere separati si devono distribuire tra fase mobile e stazionaria in modo che abbiano diversi coefficienti di distribuzione

24 Cromatografia su colonna. La fase stazionaria è attaccata ad una matrice (un supporto inerte e insolubile) impaccata in una colonna la fase mobile passa attraverso la colonna per gravità o usando un sistema di pompaggio oppure un gas sotto pressione.

25 Schema di una semplice separazione in cromatografia a fase liquida Colonna contenente la fase stazionaria Caricamento del campione Aggiunta del solvente Recupero del campione La cromatografia a fase mobile liquida semplice consiste di una colonna che tiene una fase stazionaria nell'equilibrio con un solvente.

26 Le fasi stazionarie tipiche (e le loro interazioni con i soluti) sono: 1)solidi (assorbimento Es. Silice QIAprep), 2) gruppi ionici su una resina (scambio ionico), 3)liquidi su un supporto solido inerte (di ripartizione ) e 4)particelle inerti porose (size-esclusion).

27 Cromatografia di gel filtrazione Le molecole pi ù grandi del formato del poro non possono entrare nei pori ed eluiscono insieme al primo picco nel cromatogramma. Le molecole che possono entrare nei pori avranno un tempo di soggiorno medio nelle particelle che dipende dal formato e dimensione delle molecole. Le molecole differenti quindi hanno tempi totali differenti di transito attraverso la colonna. Le molecole che sono piùpiccole di il formato del poro puòentrare in tutti i pori ed hanno il tempo massimo del soggiorno sulla colonna e si eluiscono insieme come l'ultimo picco nel cromatogramma. Questo ultimo picco nel cromatogramma determina il limite totale di permeazione Campioni piccoli Campioni grandi

28 La cromatografia a fase liquida (LC) è una tecnica cromatografica analitica che è utilecromatografica per la separazione gli ioni o di molecole dissolte in un solvente.la separazione I componenti della miscela si separeranno usando queste differenze ed esse determineranno il periodo di transito dei soluti attraverso una colonna La soluzione del campione rimane a luogo in contatto con una seconda fase solida o liquida, i soluti differenti interagiranno con l'altra fase secondo le differenze nell'adsorbimento, scambio ionico, dimensione o forma.

29 La scelta tra fase mobile e stazionaria viene fatta in modo che i composti da separare abbiano diversi coefficienti di distribuzione K d K d descrive il modo in cui un composto si distribuisce tra due fasi immiscibili A e B a temperatura costante. K d =(concentrazione nella fase A/ concentrazione nella fase B)

30 Capacità di ritenzione (K) è la quantità totale di sostanza presente in una fase divisa la quantità totale presente nell altra fase In pratica Capacità di ritenzione K= K d. V A /V B K d= coefficiente di distribuzione (concentrazione relativa dellanalita tra ledue fasi) V A =volume del composto A; V B =volume del composto B

31 Tre diversi metodi di eluizione: a. semplice o progressiva; b. a stadi; c. a gradiente di potere eluente. A.Eluizione semplice la fase mobile rimane la medesima durante tutta l'eluizione e le sostanze escono dalla colonna in dipendenza dai loro coefficienti di ripartizione B. L'eluizione a stadi si utilizza quando si vogliono separare due sostanze che presentano un coefficiente di ripartizione molto diverso tra la fase fissa e la fase mobile utilizzate.

32 C. Eluizione a gradiente di potere eluente la variazione della composizione della fase mobile è progressiva, anziché brusca come nel metodo a stadi. Questo metodo di eluizione viene utilizzato soprattutto quando le sostanze che costituiscono la miscela in studio presentano valori molto diversi di coefficiente di ripartizione tra fase fissa e fase mobile.

33 I componenti che si eluiscono dalla colonna possono essere misurati da un rivelatore e/o essere raccolti per ulteriore analisi.

34 Cromatogramma e parametri che influenzano la risoluzione cromatografica

35 A 280 Volume di eluizione Vr1 Wb1 Pick1 Vr2 Wb2 Pick2 Wb1=ampiezza del picco1 Wb2=ampiezza del picco2 Vr1=il volume del picco 1 Vr2=il volume del picco 2

36 Risoluzione: è la misura della separazione relativa raggiunta tra due materiali cromatograficamente distinti R= Vr2 - Vr1 ½ (Wb2 + Wb1) Wb1=ampiezza del picco1 Wb2=ampiezza del picco2 Vr1=il volume del picco 1 Vr2=il volume del picco 2 La massima risoluzione è lo scopo primario di ogni purificazione

37 Capacità o fattore di risoluzione E la misura della ritenzione di un componente del campione da non confondere con la capacità di caricamento della colonna k k = Vr2-Vm Vm Vm= volume della fase mobile Vr2= volume di eluizione del picco 2

38 EFFICIENZA (N) E la misura dellampiezza del picco di eluizione della colonna Vr1 Wb1 Pick1 Vr2 Wb2 Pick2


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