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IMMUNOBLOTTING Pag. 322 par. 7.6.

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1 IMMUNOBLOTTING Pag. 322 par. 7.6

2 si devono bloccare questi siti con BSA o dry Milk (latte in polvere)
Blocking molti siti di legame della membrana (di nitrocellulosa o PVDF) rimangono liberi da proteine dopo il trasferimento quindi si devono bloccare questi siti con BSA o dry Milk (latte in polvere) prima dell’incubazione con anticorpi La BSA e’ generalmente piu’ purificata del latte in polvere ma contiene epitopi identici, quindi ha meno capacità “bloccante” rispetto al latte Il latte tuttavia non e’ raccomandato se si usano anticorpi che riconoscono carboidrati.

3 Il detergente non ionico
Tween-20 (stringenza dell’ ibridazione) Il TWEEN nel buffer di incubazione con l’anticorpo serve per interferire con il legame aspecifico dell’anticorpo alla membrana Un effetto indesiderato e’ che il Tween interferisce anche con il legame tra antigene e anticorpo e puo’ causare la dissociazione delle proteine dal filtro. Quindi la concentrazione di Tween deve essere attentamente calibrata e dipende dalla forza dell’ interazione tra ligando e anticorpo

4 Immuno-blotting : Fluoroforo o HRP o AF Anticorpo secondario
Proteina legata alla membrana Anticorpo primario Membrana Anticorpo secondario Fluoroforo o HRP o AF Coniugato a: Immuno-blotting : separazione del campione tramite PAGE (Poliacrilammide gel elettroforesi) Western blotting: trasferimento delle proteine separate elettroforeticamente su membrana “BLOCKING”: bloccaggio dei siti aspecifici Rivelazione con anticorpi: primari (che riconoscono e legano recognize la proteina specifica di interesse) e secondari

5 Perché nell’immunodetection si usa un anticorpo secondario?
Proteina legata alla membrana Anticorpo primario Membrana Anticorpo secondario Fluoroforo o HRP o AF Coniugato a: L’anticorpo secondario riconosce specificamente le IgG del primario ed è coniugato con composti che ne permettono la evidenziazione

6 Fluoroforo o HRP o AF Anticorpo primario Anticorpo secondario
L’ anticorpo secondario può essere coniugato a: Fluoroforo o HRP o AF Anticorpo secondario Coniugato a: . Anticorpo primario Membrana Anticorpo secondario -fluorofori, - colloidi d’oro -radioisotopi o, piu’ comunemente, ad un enzima (es. Fosfatasi alcalina AF o perossidasi di rafano HRP)

7 (Enhanced Chemioluminescence System)
ECL (Enhanced Chemioluminescence System) P M E B R A N Ab primario Ab secondario coniugato ad HRP Substrato ECL Luce emessa X-Ray film CCD camera Rivelazione: La perossidasi di rafano (HRP) in presenza di perossido di idrogeno ossida il suo substrato, il luminolo, con concomitante emissione di luce 10 volte piu’ sensibile di un metodo colorimetrico

8 Colorazione delle proteine su carta
Ponceau S

9 Colorazione delle proteine trasferite su carta con
Ponceau S e’ un metodo rapido e reversibile di colorazione delle proteine dopo trasferimento su carta. meno sensibile del Comassie ma NON interferisce con le procedure di immuno-detection Ponceau S C22H12N4O13S4.Na4                                                       Ponceau S Staining Solution :(0.1%(w/v) Ponceau S in 5%(v/v) acetic acid)

10 ECL detection su membrana NC Gel SDS-PAGE colorato con CBB
Es. Colorazione su membrana: Es. Colorazione su gel: ECL detection su membrana NC Gel SDS-PAGE colorato con CBB Sec4GFP MW Sec4 Membrana colorata con PonceauS

11 Altri tipi di elettroforesi:
One Dimensional (1D) Protein Electrophoresis Separation: Isoelectric focusing (IEF) (par ) 2D PAGE pag 385 paragrafo 8.5.1

12 Isoelectric focusing (IEF) Cioè al loro Punto isoelettrico
IEF e un metodo per separare le proteine secondo il loro punto isoelettrico In un gradiente di pH e in presenza di un campo elettrico le proteina migreranno fino a raggiungere il punto nel gradiente dove la loro carica e’ nulla: Cioè al loro Punto isoelettrico

13 Gli anfoliti coprono diversi di pH (es.pH 3-10 o pH7-8)
IEF impiega gel orizzontali su piastre di vetro o fogli di plastica e percentuali di acrilammide e agarasio che permettono la libera mobilità dela molecole Gli anfoliti coprono diversi di pH (es.pH 3-10 o pH7-8) Il range di pH va scelto in dipendenza dei pI delle proteine di interesse Per creare i gradienti nel gel si usano anfoliti = miscele complesse di di acidi poliammino-policarbossilici sintetici

14 Isoelectric focusing of proteins (IEF)
Utile per separare proteine con differenti modificazioni (es. Fosforilazioni) o isoenzimi Creazione di un gradiente di pH usando anfoliti . Nessun voltaggio applicato Gli anfoliti e le proteine si muovono quando la corrente e’ applicata secondo la loro carica C. Al pH isolelettrico le proteine sono “focused” cioè ferme

15 PROTEOMICA

16 L'elettroforesi bidimensionale (2D-Gels)
ID=IEF. Le proteine vengono assorbite su strisce di gel secchi che hanno gradienti di pH immobilizzati. Una volta idratate e applicato il campo elettrico le proteine acide che si trovano sul lato alcalino del gel dissoceranno e saranno caricate negativamente. A causa del campo elettrico queste proteine migreranno al polo positivo (il lato acido del gel). . 2D=SDS-PAGE 2D ID pH 2 pH 11 I E F 2D: SDS-PAGE Gel figure from

17 (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight)
The MALDI-ToF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight) MALDI ToF permette l’ analisi rapida di proteine digerite purificate da spots ottenuti da gel 2D or possibilmente 1D gel, by peptide mass fingerprinting. Parent masses of whole intact proteins can also be measured. Questo strumento è anche eccellente per determinare modificazioni che cambiano la massa o lo stato di carica di proteine note. Es. di uno strumento di Maldi-Tof in commercio

18 Spettrometria di Massa MS-MALDI TOF
-Le molecole di campione sono convertite in ioni gassosi -gli ioni sono poi accellerati in un campo elettrico o magnatico o viene misurato il TOF di ioni di massa diversa in una data distanza - separati da un’analizzatore di massa-carica (m/z) -il rivelatore detrmina il rapporto massa/carica di ogni specie ionizzata Analisi dati Sistema ad alto vuoto entrata sorgete di ioni Analizza-tore di massa rivelatore MALDI TOF TOF=Time of Flight Tempo impiegato da ioni di massa diversa per percorrere un data distanza MALDI-TOF (Ionizzazione per desorbimento laser assistito da una matrice) Time of flight) mass spectometer

19 MALDI, spettrometria di massa TOF e MALDI-TOF
2D PAGE pag 385 paragrafo 8.5.1 MALDI, spettrometria di massa TOF e MALDI-TOF Pag paragrafo 9.3.7

20 Elettroforasi capillare
L’elettroforesi capillare e’ usata per la separazione analitica delle proteine, aminoacidi, peptidi e frammenti di DNA dati catodo anodo tempo A S O B N Z Elettroforasi capillare Fonte di luce rivelatore

21 CE: Elettroforesi capillare,
TIPI di ELETTROFORESI CAPILLARE CE: Elettroforesi capillare, CZE: elettroforesi capillare in soluzione libera HPCE: elettroforesi capillare zonale

22 Elettroforasi capillare
dati catodo anodo tempo A S O B N Z Elettroforasi capillare Fonte di luce rivelatore Alto voltaggio (typicamente 10-30kV) capillare sottile (25-100mm). Le estremità del capillare sono immerse nel serbatoi riempiti con l’elettrolita. Gli elettrodi sono fatti di platino e sono anche inseriti nei serbatoi con l’elettrolita. Il campione (nanomoli) viene inniettato a una estremità nel capillare. Generalmente un rivelatore ad assorbanza UV si trova alla estremità opposta del capillare.Il rivelatore genera un grafico in funzione del tempo Vantaggi: nanolitri di campione sono sufficienti e l’analisi è effettuata in tempo reale con alta sensibilità (fentomoli 10-15)

23 Tecniche cromatografiche
Nella cromatografia si definisce : una fase mobile (liquida o gassosa che fluisce sopra o attraversa una fase stazionaria (un solido, un gel, un liquido o una miscela solido liquido immobilizzata). I composti che devono essere separati si devono distribuire tra fase mobile e stazionaria in modo che abbiano diversi coefficienti di distribuzione

24 Cromatografia su colonna.
La fase stazionaria è attaccata ad una matrice (un supporto inerte e insolubile) impaccata in una colonna la fase mobile passa attraverso la colonna per gravità o usando un sistema di pompaggio oppure un gas sotto pressione.

25 Schema di una semplice separazione in cromatografia a fase liquida
Caricamento del campione Aggiunta del solvente Colonna contenente la fase stazionaria Recupero del campione Schema di una semplice separazione in cromatografia a fase liquida La cromatografia a fase mobile liquida semplice consiste di una colonna che tiene una fase stazionaria nell'equilibrio con un solvente.

26 Le fasi stazionarie tipiche (e le loro interazioni con i soluti)
sono: solidi (assorbimento Es. Silice QIAprep), gruppi ionici su una resina (scambio ionico), liquidi su un supporto solido inerte (di ripartizione ) e particelle inerti porose (size-esclusion).

27 Cromatografia di gel filtrazione
Le molecole pi ù grandi del formato del poro non possono entrare nei pori Cromatografia di gel filtrazione ed eluiscono insieme al primo picco nel cromatogramma. Le molecole che possono entrare nei pori avranno un tempo di soggiorno medio nelle particelle che dipende dal formato e dimensione delle molecole. Le molecole differenti quindi hanno tempi totali differenti di transito attraverso la colonna. Le molecole che sono pi ù piccole di il formato del poro pu ò entrare in tutti i pori ed hanno il tempo massimo del soggiorno sulla colonna e si eluiscono insieme come l'ultimo picco nel cromatogramma. Questo Campioni piccoli ultimo picco nel cromatogramma determina il limite totale di permeazione Campioni grandi

28 La cromatografia a fase liquida (LC)
è una tecnica cromatografica analitica che è utile per la separazione gli ioni o di molecole dissolte in un solvente. La soluzione del campione rimane a luogo in contatto con una seconda fase solida o liquida, i soluti differenti interagiranno con l'altra fase secondo le differenze nell'adsorbimento, scambio ionico, dimensione o forma. I componenti della miscela si separeranno usando queste differenze ed esse determineranno il periodo di transito dei soluti attraverso una colonna

29 La scelta tra fase mobile e stazionaria
viene fatta in modo che i composti da separare abbiano diversi coefficienti di distribuzione Kd Kd descrive il modo in cui un composto si distribuisce tra due fasi immiscibili A e B a temperatura costante. Kd =(concentrazione nella fase A/ concentrazione nella fase B)

30 Capacità di ritenzione K’= Kd . VA/VB
è la quantità totale di sostanza presente in una fase divisa la quantità totale presente nell’ altra fase In pratica Capacità di ritenzione K’= Kd . VA/VB Kd=coefficiente di distribuzione (concentrazione relativa dell’analita tra ledue fasi) VA=volume del composto A; VB=volume del composto B

31 Tre diversi metodi di eluizione:
semplice o progressiva; a stadi; a gradiente di potere eluente. Eluizione semplice la fase mobile rimane la medesima durante tutta l'eluizione e le sostanze escono dalla colonna in dipendenza dai loro coefficienti di ripartizione B. L'eluizione a stadi si utilizza quando si vogliono separare due sostanze che presentano un coefficiente di ripartizione molto diverso tra la fase fissa e la fase mobile utilizzate.

32 C. Eluizione a gradiente di potere eluente
la variazione della composizione della fase mobile è progressiva, anziché brusca come nel metodo a stadi. Questo metodo di eluizione viene utilizzato soprattutto quando le sostanze che costituiscono la miscela in studio presentano valori molto diversi di coefficiente di ripartizione tra fase fissa e fase mobile.

33 I componenti che si eluiscono dalla colonna possono
essere misurati da un rivelatore e/o essere raccolti per ulteriore analisi.

34 Cromatogramma e parametri che influenzano
la risoluzione cromatografica

35 Wb1=ampiezza del picco1 Wb2=ampiezza del picco2 Vr1=il volume del picco 1 Vr2=il volume del picco 2 A280 Volume di eluizione Vr1 Wb1 Pick1 Vr2 Wb2 Pick2

36 è la misura della separazione relativa raggiunta tra due
Risoluzione: è la misura della separazione relativa raggiunta tra due materiali cromatograficamente distinti Wb1=ampiezza del picco1 Wb2=ampiezza del picco2 Vr1=il volume del picco 1 Vr2=il volume del picco 2 R= Vr Vr1 ½ (Wb2 + Wb1) La massima risoluzione è lo scopo primario di ogni purificazione

37 Capacità o fattore di risoluzione
k E’ la misura della ritenzione di un componente del campione da non confondere con la capacità di caricamento della colonna Vm= volume della fase mobile Vr2= volume di eluizione del picco 2 k = Vr2-Vm Vm

38 EFFICIENZA (N) Pick1 E’ la misura dell’ampiezza del picco di eluizione della colonna Pick2 Vr1 Vr2 Wb1 Wb2


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