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La Real Time PCR Evoluzione di una tecnica che ha rivoluzionato la biologia molecolare Corso di laurea in Biotecnologie Biotecnoogie Diagnostiche Francesca.

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Presentazione sul tema: "La Real Time PCR Evoluzione di una tecnica che ha rivoluzionato la biologia molecolare Corso di laurea in Biotecnologie Biotecnoogie Diagnostiche Francesca."— Transcript della presentazione:

1 La Real Time PCR Evoluzione di una tecnica che ha rivoluzionato la biologia molecolare Corso di laurea in Biotecnologie Biotecnoogie Diagnostiche Francesca Schena

2 Un po di storia Kary Mullis ideò la PCR 1993 premio Nobel Test ad alta: SENSIBILITA SPECIFICITA

3 LA END-POINT PCR LIMITI: Poca precisione Bassa risoluzione No automazione Prodotti a basso p.m. Bromuro di etidio non è quantitativo ed è mutageno Risultati non numerici

4 Fasi di PCR in scala logaritmica QUANTIFICAZIONE NON E PRECISA A PLATEAU MA LO E NELLA FASE ESPONENZIALE

5 In una PCR con misurazione end-point (gel di agarosio) la quantità di ampliconi rilevato non è proporzionale alla quantità di target iniziale In una PCR Real Time il numero di cicli necessario per raggiungere una certa quantità di ampliconi è proporzionale alla quantità di target iniziale

6 Come funziona la Real Time? UTILIZZA DIVERSE SONDE INTERNE AL TARGET MARCATE A FLUORESCENZA CHE VENGONO RILEVATE DAI TERMOCICLATORI (FLUORIMETRI) DURANTE LA REAZIONE

7 Vantaggi della PCR Real Time Si evitano le contaminazioni date dalla manipolazione del campione Si riduce il tempo dellesperimento Si ha una quantificazione del prodotto in tempo reale

8 La quantificazione del prodotto QUANTIFICAZIONE ASSOLUTA tramite curve standard a concentrazione nota QUANTIFICAZIONE RELATIVA tramite curve standard di un gene calibratore

9 SYBER GREEN

10 Non sono richieste sonde specifiche* Non sono richieste sonde specifiche * Generale screening di trascritti prima di passare alle sonde* Generale screening di trascritti prima di passare alle sonde *Metodiche di pcr già collaudate in assenza di prodotti aspecifici, dimeri di primers ecc.*Metodiche di pcr già collaudate in assenza di prodotti aspecifici, dimeri di primers ecc. Genotipizzazione* Genotipizzazione * Multiplex* Multiplex * Amplificazione di trascritti poco espressi* Amplificazione di trascritti poco espressi * Detection di un basso livello di patogeni* Detection di un basso livello di patogeni Perchè non scegliere SYBER Green Perchè scegliere SYBER Green

11 Extension NON DETECTED EMISSION Annealing AMPLICON EXCITATION NON DETECTED EMISSION Extension AMPLICON EXCITATION REPORTERQUENCHERTAQ POLYMERASEPHOSPHATE Le sonde TaqMan

12 NON DETECTED EMISSION Extension5-3 Exonuclease AMPLICON Annealing AMPLICON EXCITATION DETECTED EMISSION REPORTERQUENCHERTAQ POLYMERASEPHOSPHATE Le sonde TaqMan

13 VantaggiTaqman AFFIDABILITA SICUREZZA SEMPLICITA PRODUTTIVITA SvantaggiTaqman COSTO ELEVATO PROBLEMI DI ACCUMULO

14 MULTIPLEX SMART CYCLER Quattro canali ottici per la rilevazione della fluorescenza Possibile utilizzo di SYBR® Green, FAM, ROX, Cy3, Cy5, Texas Red, TET, Scorpion e Amplifluor primer

15 NON FLUORESCENT QUENCHER REPORTER A target-specific loop B stem (5-6 complementary bases) C fluorophore EXCITATION Quenching EXCITATION DETECTED EMISSION AMPLICON Annealing Molecular Beacon Molecular Beacon SI UTILIZZANO DI PREFERENZA CON LAPPARECCHIATURA NULISENS EASYQ

16 Vantaggi INNOVAZIONE: prima utilizzata per il monitoraggio di paziente HIV positivo approvata dalla FDA SEMPLICITA per linterfaccia Windows che consente una facile interpretazione dei dati Svantaggi Massima precisione solo con RNA ottenuti da estrattori automatici Complessità della metodica

17 Fluorescein (donor)LC RED640/705 (acceptor) Phosphate AMPLICON EXCITATION NON DETECTED EMISSION EXCITATION FRET DETECTED EMISSION Annealing 1-5nt AMPLICON Sonde Fret

18 Genotipizzazione tramite la curva di melting AMPLICON 136V V AMPLICON WT A Sonda = 136 V V A

19 Sonde fret e LIGHT CYCLER Ottimo in diagnostica Perchè molto veloce!!

20 TermociclatoreTipo di sonda +- ABI PRISM 7700 Non versatile Set-up Ingombrante produttivo Syber green Economico Versatile Metodica collaudata Aspecificità Multiplex Tipizzazione Taqman/ Affidabile semplice Costoso Smart Cycler Set-up piccolo e pratico Taqman Syber green Molecular beacon Multiplex Veloce (8 min) Flessibile Diagnostica Protocollo rigido Ricerca Nuclisens EasyQ Molecular beacon Tipizzazione Diagnostica Metodica complessa Light Cycler Fret Syber green Tipizzazione Veloce Diagnostica Costoso Non per grossi volumi LightCycler Roche 7700 Applied Biosystems

21 Applicazioni Quantificazione virale Quantificazione dellespressione genica Quantificazione del danno al DNA Controllo di qualita Efficacia e monitoraggio di una terapia Detection di patogeni Genotyping


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