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Elettroforesi di Acidi Nucleici Southern e Northern Blot Corso di Biologia Molecolare IIa.a. 2006-2007 Corso di Biologia Molecolare IIa.a. 2006-2007 Ubaldo.

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Presentazione sul tema: "Elettroforesi di Acidi Nucleici Southern e Northern Blot Corso di Biologia Molecolare IIa.a. 2006-2007 Corso di Biologia Molecolare IIa.a. 2006-2007 Ubaldo."— Transcript della presentazione:

1 Elettroforesi di Acidi Nucleici Southern e Northern Blot Corso di Biologia Molecolare IIa.a Corso di Biologia Molecolare IIa.a Ubaldo Gioia

2 ELETTROFORESI SU GEL Permette la separazione di frammenti di DNA/RNA da una miscela complessa E una tecnica fondamentale per: lanalisi (elettroforesi analitica ) lanalisi (elettroforesi analitica ) la purificazione degli acidi nucleici (elettroforesi preparativa ) la purificazione degli acidi nucleici (elettroforesi preparativa )

3 - + RNA e DNA sono carichi negativamente catodo anodo

4 Effetto setaccio in un gel uniforme - +

5 ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO Lagarosio è un polisaccaride costituito da residui alternati di D- galattosio e 3,6-anidro-L-galattosio.

6 ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO Consente la separazioni di molecole di grandi dimensioni: kb Concentrazione di agarosio Risoluzione 0.8% : 0.5 – 20 kb 0.8% : 0.5 – 20 kb 2% : 0.1 – 3 kb 2% : 0.1 – 3 kb

7 Come si prepara un gel dagarosio Alla soluzione dagarosio si aggiunge Etidio Bromuro (EtBr) Si scioglie lagarosio in polvere in una soluzione tampone a 100°C

8 100V0,2A tampone elettroforetico generatore di corrente Polo + Polo - gel di agarosio 1.2% scatola elettroforetica ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO

9 100V0,2A Polo + Polo - Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene glicerolo, Blu di bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità diversa. ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO

10 100V0,2A Polo + Polo - ON Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene glicerolo, Blu di bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità diversa. ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO

11 100V0,2A Polo + Polo - ON Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene glicerolo, Blu di bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità diversa. ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO

12 Etidio Bromuro (EtBr) : colorante fluorescente assorbe la luce UV a 300 nm dando colore giallo-arancio E utile sia per visualizzare, sia per quantificare il campione: lintensità della fluorescenza è, infatti, proporzionale alla quantità del campione.

13 Per frammenti lineari di DNA e/o RNA la distanza di migrazione è inversamente proporzionale alle dimensioni della molecola (ovvero alla sua lunghezza in basi)

14 Conoscendo la distanza di migrazione di frammenti di dimensione nota (M) posso interpolare la lunghezza delle molecole A e B Dai Geni ai Genomi -EdiSES- A = 2.5 kb B = 6 kb

15 Non tutte le molecole di DNA sono lineari (es.: plasmidi batterici) Sebbene le due forme abbiano le stesse dimensioni, esse migreranno in maniera differente plasmide circolare rilassato nick plasmide superavvolto migra più lentamente rispetto ad un DNA lineare o superavvolto della stessa massa pBR322 pBR322 pBR322 dopo digestione plasmide linearizzato

16 Gli acidi nucleici a singolo filamento (come lRNA) tendono a formare complesse strutture secondarie, pertanto la loro corsa elettroforetica è fortemente influenzata dal modo in cui si ripiegano. NB LRNA prima di essere separato per elettroforesi deve essere prima denaturato, al fine di mantenere le molecole in forma lineare NB ELETTROFORESI IN CONDIZIONI DENATURANTI Agenti denaturanti comunemente usati: calore, formaldeide, formammide, urea

17 Separazione in gel dagarosio di molecole di RNA in condizioni denaturanti 28S (3400 nt) 18S (1800 nt) Per ottenere una buona separazione dei pesi molecolari durante la corsa nel gel, lRNA deve essere denaturato, ossia le molecole devono essere liberate sia da appaiamenti con altre molecole sia da strutture secondarie intramolecolari. La denaturazione si ottiene scottando (90-95°C) il campione e aggiungendo formaldeide al gel. Anche il loading dye contribuisce alla denaturazione poichè contiene formaldeide e formammide.

18 Separazione di frammenti minori di 1 kb Separazione di frammenti minori di 1 kb Permette di separare frammenti che differiscono di una sola base (determinazione della sequenza del DNA) Permette di separare frammenti che differiscono di una sola base (determinazione della sequenza del DNA) Separazione di frammenti minori di 1 kb Separazione di frammenti minori di 1 kb Permette di separare frammenti che differiscono di una sola base (determinazione della sequenza del DNA) Permette di separare frammenti che differiscono di una sola base (determinazione della sequenza del DNA) ELETTROFORESI IN GEL DI POLIACRILAMMIDE (PAGE)

19 Formazione di un gel di poliacrilammide

20 acrilamide/bis acrilamide 29:1 (6-15%)+ 7M Urea Spessore del gel 0,4-1,5 mm Il gel è composto da acrilamide e bis acrilamide in un rapporto caratteristico 29:1 che determina lo spessore dei pori. Esso inoltre contiene urea che funziona da denaturante. ELETTROFORESI IN GEL DI POLIACRILAMMIDE (PAGE) Risoluzione: nt

21 Polo + Polo V22 mA

22 1000V22 mA ON Polo + Polo - 5.8S L (circa 150 nt) 5S (circa 120 nt) pre-tRNAs/ tRNAs (circa 80 nt) 5.8S S Separazione di RNA totale dopo PAGE 6%

23 1000V22 mA RNAcircolare

24 RIASSUMENDO

25 Blotting di Acidi Nucleici: Southern e Northern Blot 1.Elettroforesi su gel 2.Trasferimento (blotting) su membrana 3.Ibridazione con una sonda marcata radioattivamente Permettono di studiare: Struttura ed organizzazione del genoma Struttura ed organizzazione del genoma Regolazione dellespressione genica Regolazione dellespressione genica


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