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STUDIO COMPARATIVO DELLA CAPACITA DISCRIMINANTE DEI MARCATORI RAPD, AFLP E SSR E LA LORO EFFICACIA NELLO STABILIRE LA RELAZIONE GENETICA NELLOLIVO FERNANDO.

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1 STUDIO COMPARATIVO DELLA CAPACITA DISCRIMINANTE DEI MARCATORI RAPD, AFLP E SSR E LA LORO EFFICACIA NELLO STABILIRE LA RELAZIONE GENETICA NELLOLIVO FERNANDO DI BENIGNO CORSO DI BIOTECNOLOGIE E BIODIVERSITA VEGETALI UNIVERSITA DI ANCONA FACOLTA DI AGRARIA

2 STUDIO COMPARATIVO DELLA CAPACITA DISCRIMINANTE DEI MARCATORI RAPD, AFLP E SSR E LA LORO EFFICACIA NELLO STABILIRE LA RELAZIONE GENETICA NELLOLIVO A.Belaj – Z. Satovic – G. Cipriani – L. Baldoni R. Testolin – L. Rallo – I. Trujillo 14 Ottobre 2002 Theor. Appl. Genet. (2003) 107:

3 Lolivo (Olea europea L.) è una specie subtropicale tipica del bacino del Mediterraneo, dove rappresenta la coltivazione più importante per la produzione di olio destinato all uso alimentare. La grande diversità nell olivo e la presenza di casi di omonimia e sinonimia accentua il bisogno di trovare metodi efficienti e rapidi in grado di discriminare le varie cv. Un grande aiuto a questo scopo è stato dato dallo sviluppo dei marcatori molecolari i quali hanno creato nuove opportunità nello studio della caratterizzazione e della biodiversità genetica. Una migliore comprensione dell efficienza dei marcatori molecolari è considerato un passaggio prioritario nella caratterizzazione del germorplasma dell olivo e un prerequisito per migliorare i programmi di miglioramento genetico. Introduzione

4 Scopo della ricerca 1.Comparare la capacità discriminante e le informazioni ottenute con i marcatori AFLP, RAPD e SSR per lidentificazione del genotipo e lanalisi della diversità genetica 2. Determinare la similarità genetica stimata e la relazione genetica tra 32 Cv di olivo principalmente coltivate in determinate zone dell ITALIA e della SPAGNA 3. Confrontare i pattern di variabilità ottenuti con ogni marcatore

5 Materiali e metodi Tutti i campioni di olivo analizzati sono stati prelevati dal World Olive Germoplasm Bank of the Centro de Investigaciòn y Formaciòn Agraria (CIFA) Alameda del Obispo in Cordoba -Spain-

6 Cultivar analizzate e loro distribuzione geografica SPAGNA AlfaraESTArbequinaESTBicalSUD-ESTBlanquetaEST CastellanaCENTRO Changlot Real ESTCornicabraCENTROEmpeltreEST FargaEST Gordal Sevillana SUD-OVESTHojiblancaSUD-OVEST Lchìin de Granada SUD-OVEST Lechìn de Sevilla SUD-OVEST Manzanilla Cacerena CENTRO Manzanilla de Sevilla SUD-OVESTMorrutEST PicualSUD-OVESTPicudoSUD-OVESTSevillencaEST Verdial de Badajoz CENTRO VillalongaEST Verdial de Huevar SUD-OVEST

7 Cultivar analizzate e loro distribuzione geografica Ascolana tenera CENTROCaroleaSUD-OVEST CellinaSUD-ESTCoratinaSUD-EST FrantoioCENTRO-NORDItranaCENTRO LeccinoCENTRO Leccio del Corno CENTRO MoraioloCENTRORosciolaCENTRO ITALIA

8 MARCATORI RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism) SSR (Single Sequence Repeat)

9 RAPD

10 VANTAGGISVANTAGGI Semplici e velociRiproducibilità nulla NeutraliDominante Piccole quantità di DNA Problemi di comigrazione Primers facilmente disponibili in commercioRAPD Caratteristiche dei marcatori RAPD Sono stati usati 21 primer diversi, provenienti da kits in commercio. Tutte le analisi sono state ripetute 3 volte usando vari lotti di AmpliTaq polimerasi, i prodotti della PCR sono stati separati su gel di poliacrilamide e visualizzati con la tecnica silver staining.

11 AFLP

12 AFLP VANTAGGISVANTAGGI Rileva molti Loci per gel Marcatori dominanti ALTA RIPRODUCIBILITA USO DI SOSTANZE RADIOATTIVE* AMPIO SPETTRO DAPPLICAZIONE Facili da utilizzare(Sono in vendita kit ready to use) Applicabile a specie diverse Interpretazione delle bande non sempre semplice Costi accettabili ALTO POLIMORFISMO *In alcuni casi si usa la tecnica della fluorescenza o del silver staining Caratteristiche dei marcatori AFLP Sono stati usati 5 combinazioni di primer con tre nucleotidi selettivi, 4 MseI (M-CAC M-CAA M-CGT M-CTT) e tre EcoRI (E-AGC E-ACT E-AAC)

13 SSR Struttura dei microsatelliti Fra i meccanismi di origine dei microsatelliti cè anche lo Slippage replication

14 SSR Problematica principale

15 Amplify repeat region by polymerase chain reaction Number of repeats is highly variable among individuals Microsatelliti ( S imple S equence R epeats) = Repeat (e.g., ga) Unique flanking regions Structure Design primers ( ) complementary to flanking regionsSSR

16 VANTAGGISVANTAGGI Distribuiti uniformemente nel genomaNecessita la preparazione di primers CodominantiSono specie-specifici RiproducibiliSi evidenziano su gel di poliacrilamide Alto poliformismo Difficoltà nell interpretazione delle bandeSSR Caratteristiche dei marcatori SSR La cv Frantoio, dalla quale sono stati isolati e sequenziati i microsatelliti, è stata usata come campione di confronto in tutti i gel. Lo scoring e la misurazione degli alleli è stata fatta utilizzando la sequenza del plasmide pUC18 come riferimento nella corsa elettroforetica su gel di poliacrilamide. Sono stati utilizzati 8 primers.

17 Marcatore Polimorfismo Codominante Costruzione dei primers Difficoltà Riproducibilità Qualità del DNA Costi Facilità di interpretazione Gel RAPD ++NN+- -+Agarosio AFLP ++NN + ++Poliacrilamide SSR +++SS Poliacrilamide Riassunto delle caratteristiche dei marcatori

18 RISULTATI LIVELLO DI POLIMORFISMO

19 RISULTATI I tre marcatori si sono verificati essere molto efficaci nel discriminare le 32 cultivar di olivo. INDICI MARCATORI RAPDAFLPSSR N° DI LOCI (N° TOT DI BANDE) % B.P ol N° TOT DI BANDE POLIMORFICHE (98) 61 BANDING PATTERNS B. PAT. / U 9,5729,2013,13 NUMERO EFFETTIVO DI PATTERNS / U 5,3927,637,58

20 RISULTATI LIVELLO DI POLIMORFISMO Il numero effettivo di patterns indica la grandezza di un popolazione ideale nella quale, date le frequenze dei pattern ottenuti, tutti gli individui possono essere distinti. Quindi con un primer RAPD si possono distinguere 6 varietà, con una sola combinazione di primer AFLP si possono distinguere 28 varietà mentre con un primer SSR si distinguono circa 8 varietà.

21 RISULTATI COMPARAZIONE DELLE INFORMAZIONI OTTENUTE CON I MARCATORI RAPD, AFLP E SSR Tre primer SSR, corrispondenti al 37,5%, generavano bande multiple dovute all amplificazione simultanea di differenti loci. Di conseguenza ogni prodotto di amplificazione (Allele) era facilmente identificabile, ma l attribuzione degli alleli ai rispettivi locus non era accertabile. Per questo motivo si sono presi in considerazione solo gli altri cinque primers a singolo locus. Questo fenomeno è relativamente comune nelle specie con una origine allopoliploide e potrebbe essere dovuto alla fusione del genoma e alla duplicazione dei cromosomi durante l evoluzione

22 RISULTATI ANALISI DEI DENDROGRAMMI Tutte tre i marcatori hanno messo in evidenza un alto grado di similarità nei dendrogrammi, sebbene ci sono state delle differenze nella posizione di alcune cv nei gruppi principali. Tutti i dendrogrammi riflettono la relazione tra le cv in dipendenza della loro area di coltivazione.

23 Per lanalisi della similarità è stato applicato il coefficiente di Dice, sia per ogni singolo marcatore che per tutti e tre insieme. Le cultivars sono state raggruppate attraverso lanalisi cluster usando il metodo UPGMA acronimo di Unweighted Pair Group MethodRISULTATI

24 UPGMA Unweighted Pair Group Method Esempio di costruzione di un albero filogenetico con il metodo UPGMA

25 UPGMA Unweighted Pair Group Method Esempio di costruzione di un albero filogenetico con il metodo UPGMA

26 UPGMA Unweighted Pair Group Method Esempio di costruzione di un albero filogenetico con il metodo UPGMA

27 UPGMA Unweighted Pair Group Method Esempio di costruzione di un albero filogenetico con il metodo UPGMA

28 UPGMA Unweighted Pair Group Method Esempio di costruzione di un albero filogenetico con il metodo UPGMA

29 RISULTATI SIMILARITA E RELAZIONE GENETICA PARAMETRO TIPO DI MARCATORE RAPDsAFLPsSSRs MEDIA MINIMO MASSIMO La tabella seguente riassume la similarità genetica calcolata a due a due per tutte le 32 cv di olivo per ogni marcatore. La similarità genetica è espressa come Coefficiente di Dice.

30 DENDROGRAMMA AFLP

31 1° GRUPPO In questo gruppo sono presenti 13 cv Spagnole e 5 Italiane. Delle 18 cv Spagnole 8 provengono dal Sud-Ovest e dal Centro, mentre altre 4 cv (Alfafara, Blanqueta, Changlot Real, Castellana) provengono dallEst. Le 5 cv Italiane sono raggruppate in differenti sottogruppi in accordo alla loro distribuzione geografica. Nel dendrogramma generato dagli AFLP si possono osservare 2 gruppi principali, ai quali si affiancano le cv Bical e Castellana raggruppate separatamente ad una distanza inferiore dello 0.65

32 DENDROGRAMMA AFLP 2° GRUPPO Nel dendrogramma generato dagli AFLP si possono osservare 2 gruppi principali, ai quali si affiancano le cv Bical e Castellana raggruppate separatamente ad una distanza inferiore dello 0.65 Questo gruppo include 5 cvs Spagnole provenienti dall Est insieme a Lechin de Sevilla e Picual entrambi diffuse nel Sud. Insieme alle cvs Spagnole sono presenti in questo gruppo le cvs Coratina, Frantoio, Cellina, Leccino e Leccio del Corno di origine Italiana.

33 DENDROGRAMMA RAPD

34 Il dendrogramma ottenuto con i RAPD risulta essere molto simile a quello ottenuto con gli AFLP ma con alcune eccezioni, come ad esempio la cv Blanqueta situata nel gruppo 2 invece che nel gruppo 1 come nel dendrogramma AFLP. Ai livelli dei sottogruppi sono state mantenute alcune associazioni in entrambi i marcatori come, ad esempio, il caso delle cvs Changlot Real, Lechìn de Granada, Verdial de Bedajoz, Moraiolo, Rosciolo e Farga. Inoltre il dendrogramma mette in evidenza un alta similarità tra le cvs provenienti dalla stessa area o nelle vicinanze più di quanto lo faccia gli altri due marcatori.

35 DENDROGRAMMA SSR

36 Il dendrogramma ottenuto con gli SSR ha evidenziato delle differenze a livello dei sottogruppi. La differenza che più risulta è la discriminazione delle cvs Cellina e Frantoio da parte degli SSR. Cosa che non erano stati in grado di fare gli altri due marcatori. Inoltre le cvs Lechìn de Granada, Moraiolo, e Rosciola hanno formato un gruppo separato insieme alla cv Arbequina seppur mantenendo la stessa relazione genetica fra loro come nei casi degli altri due marcatori.

37 DENDROGRAMMA AFLP+RAPD+SSR

38 Il dendrogramma generale è stato costruito mettendo insieme i dati provenienti dai tre marcatori. Esso è risultato molto simile a quelli ottenuti con ogni singolo marcatore. Comunque ci sono alcune differenze che portano ad una migliore rappresentazione della relazione fra le cvs in accordo con la loro area geografica di coltivazione.

39 CONCLUSIONI Tra le cvs analizzate non è stata riscontrata una differenziazione tra i due paesi (Italia e Spagna), forse dovuta allo scambio reciproco di materiale genetico. La struttura della diversità genetica comparata con le origini geografiche riflette un processo di selezione multilocale nellolivo, una limitata diffusione delle cvs allinfuori della loro area di coltivazione e un possibile scambio di materiale vegetale nel corso degli anni.

40 CONCLUSIONI I tre marcatori hanno discriminato i genotipi molto efficacemente ma solo gli SSR sono riusciti a fare una distinzione fra le cvs Frantoio e Cellina. Gli SSR hanno evidenziato un alto livello di polimorfismo il quale era atteso in quanto il meccanismo che origina i polimorfismi in questi marcatori (Slippage Replication) è molto frequente. La natura codominante di questo marcatore permette la scoperta di un alto numero di alleli per locus e di conseguenza ad un alto livello di eterozigosità attesa.

41 CONCLUSIONI Il relativamente alto valore di P (Numero effettivo di pattern/U) per tutti i marcatori usati da un idea di quella che può essere la loro capacità discriminante quando nelle analisi si usano un numero abbastanza alto di campioni. Il risultato di P più alto è stato ottenuto con gli AFLP, probabilmente dovuto all alto numero di loci (Bande) amplificati in ogni esperimento. Lalto criterio di conservazione usato per la selezione dei polimorfismi può aver ridotto il valore reale di P ottenuto per i RAPD.

42 CONCLUSIONI COMPARAZIONE DELLE INFORMAZIONI OTTENUTE CON I TRE MARCATORI

43 CONCLUSIONI Lutilità di un marcatore sta nellequilibrio tra il livello di polimorfismo che può mettere in evidenza e la sua capacità di identificare polimorfismi multipli. (Powell et al. 1996) In quest analisi è stato adoperato un indice che riassume la citazione sopra riportata, questindice è il Marker Index (MI). Infatti esso è composto da due parti: MI = E x H ep Dove: E= Nu x β = N° di loci polimorfici per unità di saggio H ep =Eterozigosità attesa dei loci polimorfici

44 CONCLUSIONI Gli AFLP hanno un MI molto elevato, ma come si vede in tabella è dovuto allalto valore di E. In altre parole lelevato valore di MI dipende più dallalto numero di alleli (Bande polimorfiche) ottenuti in ogni profilo che per leterozigosità allelica trovata tra le cvs analizzate. INDICERAPDAFLP*SSR** H ep 0,350,310,42 E5,1952,201,00 MI1,7916,260,42

45 CONCLUSIONI **Tre primer SSR, corrispondenti al 37,5%, generavano bande multiple dovute all amplificazione simultanea di differenti loci. Di conseguenza ogni prodotto di amplificazione (Allele) era facilmente identificabile, ma l attribuzione degli alleli ai rispettivi locus non era accertabile. Per questo motivo si sono presi in considerazione solo gli altri cinque primers a singolo locus. Questo fenomeno è relativamente comune nelle specie con una origine allopoliploide e potrebbe essere dovuto alla fusione del genoma e alla duplicazione dei cromosomi durante l evoluzione *Per il calcolo degli indici riguardanti i marcatori AFLP sono state prese in considerazione solo 98 bande polimorfiche ben definite.

46 CONCLUSIONI SSR 1. Basso Marker Index 2. Alta eterozigosità attesa 3. Media capacità discriminante 4. Medio numero di patterns effettivi

47 AFLP 1. Alto Marker Index 2. Alta capacità discriminate 3. Alto numero di patterns effettivi 4. Bassa eterozigosità attesaCONCLUSIONI

48 RAPD 1. Medio Marker Index 2. Bassa eterozigosità attesa 3. Bassa capacità discriminante 4. Basso numero effettivo di patternsCONCLUSIONI

49 CONCLUSIONI Questi risultati insieme a altre considerazioni di natura pratica ed economica, devono essere prese in considerazione quando si sceglie un marcatore per un applicazione specifica. Nel nostro caso tutte e tre i marcatori si sono dimostrati molto efficienti nel mettere in evidenza la diversità nellolivo, ma considerando la scarsa riproducibilità degli RAPD e lalta efficienza degli SSR e degli AFLP limita luso dei RAPD in analisi di questo tipo. Comunque rimangono una valida alternativa quando le possibilità economiche sono limitate..

50 CONCLUSIONI SIA I MARCATORI RAPD CHE AFLP SONO MOLTO EFFICIENTI NELLO STABILIRE LA SIMILARITA GENETICA NELL OLIVO, MENTRE LA NATURA CODIMINANTE DEGLI SSR SARA PIU INDICATO PER STUDI DI SEGREGAZIONE E MAPPATURA DELL OLIVO.


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