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L.S. in Scienze e tecnologie alimentari Anno Accademico 2008/2009 Corso integrato: Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU) Modulo:

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1 L.S. in Scienze e tecnologie alimentari Anno Accademico 2008/2009 Corso integrato: Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU) Modulo: Chimica analitica strumentale (4 CFU) Giorgio Bonaga GASCROMATOGRAFIA (GC) (CAS-3a) Giorgio Bonaga

2 GASCROMATOGRAFIA (GC) fase mobile: gas I composti da separare (liquidi, solidi, gas) devono essere gas o resi gassosi. Lo stato di gas si ottiene riscaldando le sostanze nel momento dellintroduzione nello strumento e mantenendo il sistema a temperatura elevata (solo la temperatura della colonna può essere programmata con gradiente termico). CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE GAS-LIQUIDO (GLC) fase stazionaria: liquido su solido inerte o sulle pareti della colonna CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO GAS-SOLIDO (GSC) fase stazionaria: solido adsorbente CROMATOGRAFIA A FLUIDO SUPERCRITICO (SFC) fase stazionaria: fluido supercritico Giorgio Bonaga

3 Le soluzioni di campione vengono iniettate in un sistema la cui pressione interna non è molto diversa dalla pressione atmosferica. Nella GC la fase mobile è un gas che non compete con la fase stazionaria, ma che ha semplicemente il compito di trasportare ( carrier gas ) i soluti allestremità della colonna. La migrazione differenziale di soluti diversi è dovuta alle diverse interazioni soluto/fase stazionaria, ovvero alle diverse costanti di equilibrio termodinamico K d di soluti differenti. Lo strumento della gascromatografia è il gascromatografo (Martin e Synge, 1941), le cui parti essenziali sono: 1. bombola del gas inerte con riduttore di pressione a due stadi, regolatore del flusso di gas, rotametro (misuratore del flusso in entrata), separatore di flusso, flussimetro (misuratore del flusso in uscita); 2. iniettore del campione (injector); 3. colonna cromatografica alloggiata nel fornetto (oven) dello strumento; 4. rivelatore (detector). Giorgio Bonaga

4 Carrier gas: He, Ar, N 2, H 2, CO 2 riduttore regolatore del flusso rotametro B separatore del flusso injector colonna GASCROMATOGRAFO detector flussimetro OVEN colonna Giorgio Bonaga

5 CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE GAS-LIQUIDO (GLC o GC) È ancora oggi la cromatografia più importante perché è quella che consente il maggior numero di applicazioni, specialmente nel settore dellanalisi degli alimenti, con una facile ottimizzazione delle condizioni operative. La separazione dei soluti è dovuta alla loro migrazione differenziale lungo la colonna per effetto delle differenti interazioni con la fase stazionaria (un liquido immobilizzato su un supporto solido inerte o sulle pareti della colonna). La fase mobile è solo un trasportatore ( carrier gas ), essa non partecipa al processo di ripartizione. Ogni fase stazionaria liquida ha caratteristiche chimico-fisiche proprie, tra le quali la pressione (o tensione) di vapore. Nella GC, tenendo conto che la fase mobile non partecipa alla partizione, lunico parametro che può modificare lequilibrio (ovvero la costante termodinamica K d che lo descrive) è la temperatura. Un incremento di temperatura aumenta in modo esponenziale la tensione (pressione) di vapore degli analiti e di conseguenza un loro più rapido passaggio nella fase mobile. Leffetto finale è la riduzione del loro tempo di ritenzione (un incremento di circa 30°C produce il dimezzamento del t R ). Giorgio Bonaga

6 PRESSIONE DI VAPORE Tensione di vapore P vapore Allequilibrio è costante il rapporto tra il numero di molecole che dallo stato liquido passano alla stato gassoso e il numero di molecole che dallo stato gassoso passano allo stato liquido Giorgio Bonaga

7 RELAZIONE TEMPERATURA/ENERGIA CINETICA E c media (t 1 )E c media (t 2 ) E c > forze intermolecolari del liquido t1t1 t2t2 frazione di molecole Giorgio Bonaga liquido PRESSIONE DI VAPORE (mm/Hg) 0°C20°C30°C etere etilico etanolo acqua51832

8 RELAZIONE TEMPERATURA/PRESSIONE DI VAPORE Tensione di vapore millibar t (°C) ,0 24,0 12,0 6,0 3,0 1,5 Giorgio Bonaga

9 RELAZIONE TEMPERATURA/TEMPO DI RITENZIONE t R = 4 t R = 2 t t + 30°C Giorgio Bonaga

10 ALLARGAMENTO DEI PICCHI IN GC Lallargamento dei picchi è governato dallaltezza equivalente del piatto teorico (HETP), tenuto conto che alcuni termini dellespressione vanno modificati sulla base delle specificità della GC: Q U d liq 2 2 d p. 2 v v dp2dp2 HETP = v Inglobando tutte le costanti caratteristiche di una determinata colonna e di una determinata fase stazionaria (d p,,, d c, Q, U, d liq, D liq ) ed anche di un determinato gas (D gas ) nelle costanti A, B e C, lequazione può essere scritta nella versione di Van Deemter, che correla queste costanti alla velocità lineare media di flusso del gas di trasporto ( v ): HETP = A + B + C. v Verranno discussi più avanti i profili di questa equazione in relazione al tipo di colonna GC utilizzata. v DmDm D gas DmDm dc2dc2 D liq DsDs Giorgio Bonaga

11 LE VARIABILI DELLA GC Nellanalisi gascromatografica, analogamente alle altre tecniche analitiche, si deve operare una scelta delle variabili del sistema, sulla base delle caratteristiche della miscela che bisogna analizzare. Nella gascromatografia di ripartizione le variabili sono: 1. TIPO DI COLONNA (impaccata o capillare) 2. FASE STAZIONARIA (supporto solido inerte e liquido di partizione) 3. FASE MOBILE (tipo di gas e velocità di flusso) 4. TEMPERATURA (isoterma o programmata) 5. INIETTORE (on column, split/splitless) 6. RIVELATORE (FID, TCD, ECD, NPD) Gli argomenti verranno trattati in riferimento alla gascromatografia tradizionale, perchè gli ultimi sviluppi di questa tecnica (Fast GC, Ultra Fast GC e 2DGC) verranno illustrati separatamente. Giorgio Bonaga

12 1. TIPO DI COLONNA La classificazione fondamentale delle colonne per GC è: 1. COLONNE IMPACCATE (Packed Colum): sono tubi di acciaio inossidabile, rame o vetro che vengono riempiti con una fase stazionaria costituita da a) supporto solido (di diversa composizione e granulometria, opportunamente trattato) sul quale si deposita b) film del liquido di partizione (liquido alle temperature di esercizio). 2. COLONNE CAPILLARI (Open Tubular): sono tubi di vetro o di silice fusa, con a) film di liquido di partizione supportato su b 1 ) parete interna della colonna (WCOT = Wall Coated Open Tubular), b 2 ) strato poroso sulla parete interna della colonna (SCOT = Support Coated Open Tubular), b 3 ) parete interna della colonna resa porosa (PLOT = Porous Layer Open Tubular) 3. COLONNE MEGABORE (Open Tubular): la loro efficienza è intermedia tra quella delle impaccate e quella delle capillari. Hanno elevata capacità (quantità iniettabile fino a 3 l) e compatibilità con tutti i tipi di iniettori GC. Giorgio Bonaga

13 colonne capillari di silice fusa capillary fused silica column colonne impaccate di vetro packed glass column Giorgio Bonaga

14 WCOT SCOT PLOT IMPACCATA strato porososilice liquido di partizione Open Tubular vetro fase stazionaria (supporo+liquido) Giorgio Bonaga

15 GC-impaccataGC-capillare 3,0 mm (i.d.) 0,25-0,53 mm (i.d.) 0,1-25 m (f.t.) Giorgio Bonaga CARATTERISTICHE CAPILLARI MEGABOREIMPACCATE WCOTSCOTPLOT diametro interno (mm) 0,32-0,53 0,533-6 piatti teorici/m lunghezza massima (m) piatti teorici totali (N) fase liquida (%) spessore fase liquida ( m) 0,1-0, granulometria supporto (mesh) flusso medio (ml/min) 0,5-5, ,3-4, velocità lineare media (cm/s)

16 PERCENTUALE DI CARICO E RAPPORTO 1. COLONNE IMPACCATE Il rapporto tra la massa del liquido di partizione e la massa totale della fase stazionaria (supporto solido + liquido di partizione) espresso in percentuale (ossia la concentrazione percentuale in peso) è la: % di carico = massa liquido di partizione massa fase stazionaria ESEMPIO Una colonna è stata impaccata con 1,5 g di liquido di partizione e 48,5 g di supporto solido, la percentuale di carico è 1,5/50 = 3% 2. COLONNE CAPILLARI Il rapporto tra il diametro interno della colonna capillare e lo spessore del liquido di partizione è espresso dallequazione: rapporto = i.d. = i.r. 4 f.t. 2 f.t. dove: i.d. = diametro interno della colonna (in mm) i.r. = raggio interno della colonna (= i.d./2) f.t. = film thickness (in m) Giorgio Bonaga

17 rapporto = i.d. = i.r. 4 f.t. 2 f.t. film thickness in m (f.t.) diametro interno in mm (i.d.) Giorgio Bonaga

18 mol wt soluti da separare gas, solventi, idrocarburi a bassa massa molecolare, alogenati volatili campo delle applicazioni più comuni Idrocarburi ad alta massa molecolare, cere, prodotti petroliferi Maggiore è il valore del rapporto minore è la frazione di tempo che i soluti trascorrono nel liquido di partizione, ossia minori sono i loro t R. Il rapporto è utile: 1. per scegliere la colonna idonea alla soluzione di soluti da separare; 2. per confrontare le separazioni fatte con colonne di differente diametro (se hanno lo stesso, le separazioni risulteranno fondamentalmente uguali). ESEMPIO 0,53 mm i.d./0,1 m f.t. 0,53 mm i.d./0,4 m f.t. 0,32 mm i.d./7,0 m f.t. 0,32 mm i.d./0,8 m f.t. Giorgio Bonaga

19 EQUAZIONE DI VAN DEEMTER Il trasferimento dellequazione di Van Deemter alle colonne GC deve tenere conto delle specificità delle colonne: 1. le colonne impaccate sono riempite con un supporto inerte ricoperto dal liquido di partizione. Rispetto lHETP questo sistema mostra: un maggior effetto eddy per la tortuosità dei percorsi; una minore diffusione longitudinale per la resistenza offerta dalle particelle di fase stazionaria (fattore di ostruzione = 0,6); maggiori trasferimenti di massa nella fase mobile per effetto della maggior dimensione delle particelle di fase stazionaria; maggiore trasferimento di massa nella fase stazionaria e maggiore resistenza al trasferimento di massa tra le due fasi (elevato loading ). 2. le colonne capillari sono open tubular, con film di liquido di partizione depositato sulle pareti della colonna o su strati porosi aderenti alle pareti della colonna. Rispetto lHETP questo sistema mostra: la mancanza dell effetto eddy ; una maggiore diffusione longitudinale per la minore resistenza offerta dallo strato di fase stazionaria sulle pareti della colonna (fattore di ostruzione = 1,0); minore resistenza al trasferimento di massa tra il film del liquido di partizione e la fase mobile gassosa (basso loading ). Giorgio Bonaga

20 Queste considerazioni spiegano il diverso andamento grafico delle equazioni di Van Deemter: B / v C. v v A B / v v HETP = A + B/ v + C. v HETP = B/ v + C. v COLONNE IMPACCATE COLONNE CAPILLARI HETP Giorgio Bonaga

21 2. FASE STAZIONARIA a) SUPPORTO INERTE PER COLONNE IMPACCATE Ha la funzione di garantire al liquido di partizione la maggior superficie di contatto con la fase mobile. Il supporto ideale è costituito da particelle sferiche uniformi, inerti, con buona resistenza meccanica, con unarea specifica di 1 m 2 /g. In realtà di impiegano materiali diversi: gel di silice (da terra di diatomee ) allumina carbone e carbone grafitato setacci molecolari (zeoliti) polimeri e copolimeri organici solidi porosi (resine) allumina carbone zeoliti resinediatomee gel di silice Giorgio Bonaga

22 COMPOSIZIONE CHIMICA DI SUPPORTI A BASE DI SILICATI COMPONENTE Firebrick C22 Celite 545 Chromosorb P Chromosorb W SiO 2 89,789,989,291,2 Al 2 O 3 5,13,65,14,1 Fe 2 O 3 1,61,71,51,1 TiO 2 0,3 Cao1,31,80,90,7 Mgo0,90,71,00,7 COMPOSIZIONE CHIMICA DI SUPPORTI A BASE DI RESINE RESINACOMPOSIZIONE Porapak Aetilvinilbenzene/divinilbenzene Porapak Npolivinilpirrolidone Porapak Pstirene/divinilbenzene Porapak Tetilenglicoledimetacrilato Chromosorb Tpolitetrafluoroetilene Giorgio Bonaga

23 etilvinilbenzene divinilbenzene polivinilpirrolidone stirene divinilbenzene Porapak A Porapak N Porapak P etilenglicoldimetacrilato politetrafluoroetilene Porapak T Chromosorb T n m n n n nm Giorgio Bonaga

24 TRATTAMENTO DEL SUPPORTO Il materiale a base di silicati (scheletri di diatomee) viene sottoposto ad una procedura di ottimizzazione (la sua funzione infatti è di alloggiare il liquido di partizione, ma non produrre fenomeni di adsorbimento o di interazione con i soluti) che prevede i seguenti passaggi: inattivazione (trattamento con HCl a riflusso seguito da calcinazione per trasformare i gruppi silanolici in gruppi silossanici e per eliminare sostanze con elevata tensione di vapore); fusione con NaCO 3 (per garantire una cottura che produca mattonelle); triturazione (per ottenere materiale polverulento); setacciamento (per selezionare il supporto in base alla granulometria) inerzializzazione (per convertire i gruppi silanolici residui nei corrispondenti derivati) Giorgio Bonaga

25 INATTIVAZIONE Il trattamento con HCl a riflusso trasforma i gruppi silanolici superficiali in gruppi silossanici, mentre con la calcinazione si ottiene la rottura dei ponti silossanici preesistenti con un aumento della porosità del supporto. La superficie porosa del supporto consente una migliore adesione del liquido di partizione. Sono le condizioni del trattamento idrotermico (concentrazione di HCl e temperatura della calcinazione), unitamente alla composizione chimica del silicato, che determinano le proprietà dei supporti ( densità libera, densità impaccata, area superficiale, pH ). gruppo silossanico gruppo silanolico HC l T (°C) poro Giorgio Bonaga

26 SETACCIAMENTO Si impiegano dei setacci con un diverso numero di maglie per unità di superficie: lunità di misura è il mesh = numero di maglie/inch 2 ( 1 pollice = 2,54 cm). Lindicazione mesh caratterizza quelle particelle che passano attraverso le maglie del setaccio a 60 mesh, ma vengono trattenute dal setaccio a 80 mesh. E così via. ~ m 100 mesh 80mesh Giorgio Bonaga ~ m 80 mesh 60 mesh

27 INERZIALIZZAZIONE (FUNZIONALIZZAZIONE) Consiste nella silanizzazione dei gruppi silanolici (-Si-OH) residui con agenti sililanti, ovvero in grado di trasformare gli –OH liberi dei gruppi silanolici nei corrispondenti trimetilsilil-derivati (-OTMS). trimetilclorosilanoesametildisilazano (TMCS) (HMDSA) + + HCl sito attivo verso sito inerte i soluti (- OTMS).. Giorgio Bonaga


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