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1 Marcatori molecolari Caratteristiche e applicazioni Luca Gianfranceschi e Rosanna Marino.

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Presentazione sul tema: "1 Marcatori molecolari Caratteristiche e applicazioni Luca Gianfranceschi e Rosanna Marino."— Transcript della presentazione:

1 1 Marcatori molecolari Caratteristiche e applicazioni Luca Gianfranceschi e Rosanna Marino

2 2 I marcatori molecolari Strumento per lanalisi genetica Strumento non oggetto di studio Molecolari biologia molecolare Analisi genetica studio delle differenze genetiche Marcatori approccio indiretto

3 3 Alcune definizioni Marcatore genetico:Locus genico che identifica univocamente una regione cromosomica Mappa genetica:Definisce le RELAZIONI LINEARI tra marcatori molecolari E IL RISULTATO DELLANALISI GENETICA Distanza genetica:Stima della distanza esistente tra due marcatori calcolata sulla frequenza di ricombinazione - Si esprime in Centimorgan (cM) - 1cM = 1 ricombinante / 100 prodotti meiotici Polimorfismo:Presenza di varianti alleliche per un dato gene o marcatore Polimorfismo molecolare: Differenze evidenziabili a livello di DNA

4 4 I marcatori molecolari sono UNIVERSALI

5 5 I marcatori molecolari sono EREDITABILI

6 6 I marcatori genetici Marcatori morfologici Problemi:1) non sono molto numerosi 2) dipendono dalla specie (ploidia ecc.) Marcatori molecolari Identificano polimorfismo a livello di DNA Offrono la possibilità di coprire tutto il genoma Sono applicabili universalmente

7 7 Marcatore genetico ideale Non influenzato dallambiente Neutrale Stabile Facile da monitorare Numeroso Codominante Polimorfico Presente in qualsiasi tessuto Indipendente da sesso ed età Analisi automatizzabile N.B. Peccato che non ci sia !!

8 8 Tecniche per la produzione di marcatori molecolari Ibridazione molecolare Southern blot es. RFLP Amplificazione del DNA PCR (Polymerase Chain Reaction) RAPD, SSR o STR Approcci misti Digestione enzimatica e amplificazione CAPS, AFLP

9 9 I marcatori RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

10 10 La reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction - PCR ) Inventata da Kary Mullis nel 1985 Gli è valsa il Nobel nel 1993 Fondamenti: Conoscenze sulla replicazione del DNA - DNA polimerasi Sintesi in vitro di DNA a sequenza specifica - Oligonucleotidi Biologia dei batteri estremofili - DNA polimerasi Taq ricavata da Thermus aquaticus

11 11 I marcatori RAPD (Random Amplified Polymorfic DNA) Basati su PCR Non sono necessari dati di sequenza Automatizzabili Oligonucleotidi (primer) sono corti e di sequenza casuale Temperatura di annealing è bassa: 37°C Richiedono poco DNA di partenza La tecnica è facile Problemi Scarsa ripetibilità Non sono locus-specifici Non sono esportabili Difficilmente confrontabili tra mappe e tra genotipi Sono marcatori dominanti

12 12 Analisi RAPD di 9 varietà di ciliegio 2000 bp 1500 bp 500 bp I campioni 1 e 3 provengono dalla stessa varietà, così come i campioni 2 e 6; nella corsia 9 è stato usato DNA di amareno M M

13 13 I microsatelliti o SSR (Simple Sequence Repeat)

14 14 I microsatelliti o SSR (Simple Sequence Repeat) Individuo 1 Individuo 2 Individuo 3 Individuo 4 Individuo 5 Individuo

15 15 Analisi SSR di alcuni individui di una popolazione naturale Quanti alleli distinguete negli individui di questa popolazione? Individui della popolazione

16 16 La tecnica degli AFLP

17 17 Esempio di gel AFLP

18 18 Analisi multiplex di marcatori

19 19 Che cosè uno SNP ? E una differenza, o polimorfismo, di un singolo nucleotide nella sequenza di DNA esistente in alcuni individui della stessa specie. Il loro numero varia notevolmente a seconda della specie In uomo cè in media uno SNP ogni 300 nucleotidi Che cosè uno SNP ? E una differenza, o polimorfismo, di un singolo nucleotide nella sequenza di DNA esistente in alcuni individui della stessa specie. Il loro numero varia notevolmente a seconda della specie In uomo cè in media uno SNP ogni 300 nucleotidi...C C A T T G A C......C C G T T G A C... …G G T A A C T G... …G G C A A C T G... Gli SNP (single nucleotide polymorphism)

20 20 Perché utilizzare gli SNPs Sono la base molecolare della maggior parte delle differenze tra individui Possono contribuire alla suscettibilità a malattie e alladattabilità delle specie Sono presenti in un elevato numero e sono distribuiti lungo tutto il genoma

21 21 Impieghi dei marcatori molecolari Analisi di paternità Diagnosi di anomalie genetiche Analisi forensi Identificazione di QTL e geni utili Miglioramento delle specie vegetali ed animali Studio della struttura, evoluzione e biodiversità delle popolazioni Studi di epidemiologia Tracciabilità dei prodotti animali e/o dei GMO Conservazione della natura Studi di filogenesi ed evoluzione

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24 24 Programma di queste esercitazioni LUNEDÌ Introduzione sui marcatori molecolari e loro usi Estrazione del vostro DNA dalle cellule della mucosa boccale MARTEDÌ Spiegazione teorica sulla PCR e sulluso che ne faremo Amplificazione specifica di tre sequenze del vostro genoma 1. Marcatore altamente polimorfico D1S80 sul cromosoma 1 2. Marcatore Y-GATA-A7.2 sul cromosoma Y 3. Marcatore HUAMEL sul gene dellamelogenina sulla regione omologa dei cromosomi X e Y Preparazione dei gel di agarosio MERCOLEDÌ Elettroforesi dei prodotti di PCR sul gel di agarosio Protocollo semplificato per lestrazione di DNA da Kiwi Analisi e discussione dei risultati ottenuti


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