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GLUTINE E CELIACHIA Dottorato in

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Presentazione sul tema: "GLUTINE E CELIACHIA Dottorato in"— Transcript della presentazione:

1 GLUTINE E CELIACHIA Dottorato in
Medicina materno-infantile, pediatria dello sviluppo e dell’educazione, perinatologia (XXI ciclo, 3° anno) GLUTINE E CELIACHIA Università degli Studi di Trieste BURLO GAROFOLO Istituto di ricovero e cura a carattere scientifico Dipartimento di Scienze della Riproduzione e dello Sviluppo Dott. Vecchiet Monica

2 LA MALATTIA CELIACA CD autoimmunità tTg dieta glutine genetica
HLA-DQ2 HLA-DQ8 CD 0.5-1% della popolazione cellule T agenti infettivi

3 Strutturali e metaboliche
PROTEINE DEI CEREALI SOLUBILITÀ ALBUMINE acqua GLOBULINE sali PROLAMINE alcol GLUTENINE acidi FUNZIONE Riserva Strutturali e metaboliche Protettive

4 ANTICORPI : phage display
VH VL CH1 CH2 CH3 CL costruzione dell’Ab in forma di scFv display sulla superficie del fago DNA da linfociti B intestinali È possibile ricreare l’intero repertorio anticorpale di un individuo mediante il trasferimento di alcuni geni del suo sistema immunitario in un batterio e la successiva espressione degli Ab in fusione con proteine fagiche recupero degli Ab specifici contro l’Ag di interesse selezione su Ag di interesse

5 ANTIGENE - GLUTINE (The Journal of Biological Chemistry, 1967, 242(3), ) (Nahrung Food, 1999, 43(3), ) (Ferrante, Masci et al., 2006, 6(6), ) 115.5 64.2 48.8 37.1 25.9 19.4 82.2 Glut’ Glia GT Glut Glut’alch Glut alch Glia F Glia’ MW KDa METODO di SILANO

6 Anticorpo - scFv 1 Le condizioni denaturanti dell’SDS-PAGE
Glut Glut alch Glia F Glia GT MW 64.2 48.8 37.1 82.2 115.5 KDa Le condizioni denaturanti dell’SDS-PAGE modificano l’epitopo riconosciuto dal frammento anticorpale? Glia F Glia GT L’epitopo si trova su aggregati di gliadine?

7 Anticorpo - scFv 2 Glut Glut alch Glia F Glia GT 35.2 22.4 KDa 115.5
82.2 64.2 48.8 37.1 MW + Glut pH 10 pH 3 25.9 19.4 KDa I dimensione II dimensione pH 10 pH 3 MW + Glut KDa 181.8 155.5 64.2 37.1 25.9 19.4 82.2 48.8

8 SEQUENZIAMENTO PROTEICO
Centro di Spettrometria di Massa Proteomica e Biomolecolare dell’Istituto di Scienze dell’Alimentazione-CNR di Avellino riduzione, alchilazione e digestione con endopeptidasi Start End Observed Mr(expt) Mr(calc) Delta Miss Sequence 68 74 0.0132 R.TPFPQTR.G 75 90 0.0228 R.GEQHSSCQTVQHQCCR.Q 91 100 0.0063 R.QLVQIPEaAR.C 103 130 K.AIQSVEEAIIQQQPQQQWNEPQQEAHLK.S 134 159 0.0207 R.MSLQTLPSMCNIYVPVQCQQQQQLGR.Q digestione con tripsina Start - End Observed Mr(expt) Mr(calc) Delta Miss Sequence 2 10 L.WLATMKTMF.I 16 26 1 L.ALAASTAIAQL.E 35 43 0.0139 F.GQCQHHQQL.G 48 0.0026 F.GQCQHHQQLGQQQL.L 49 0.0085 F.GQCQHHQQLGQQQLL.D 121 129 0.0241 W.NEPQQEAHL.K 147 157 Y.VPVQCQQQQQL.G 158 165 0.0027 L.GRQQQQQL.Q 169 0.0088 L.GRQQQQQLQEQL.K 175 L.GRQQQQQLQEQLKPCATF.L 166 L.QEQLKPCATF.L digestione con chimotripsina

9 spot ALTO (35.2 KDa) gi/ LMW-GS del Triticum aestivum PM 25.9 KDa e P.I. 8.4 LWLATMKTMF ILALLALAAS TAIAQLETIC SQGFGQCQHH QQLGQQQLLD 51 QMKPCVAFVQ HQCSPVRTTPF PQTRGEQHSS CQTVQHQCCR QLVQIPEQAR 101 CKAIQSVEEA IIQQQPQQQW NEPQQEAHLK SMRMSLQTLP SMCNIYVPVQ 151 CQQQQQLGRQ QQQQLQEQLK PCATFLQHQC RPMTVPFPHT PVQKPTSCQN 201 VQSQCLAAS TDPRAIPLPS HS aa identificati in seguito a digestione con tripsina aa identificati in seguito a digestione con chimotripsina aa sovrapponibili dalle due digestioni

10 CARATTERISTICHE DI gi/32400760
LWLATMKTMF ILALLALAAS TAIAQLETIC SQGFGQCQHH QQLGQQQLLD 51 QMKPCVAFVQ HQCSPVRTTPF PQTRGEQHSS CQTVQHQCCR QLVQIPEQAR 101 CKAIQSVEEA IIQQQPQQQW NEPQQEAHLK SMRMSLQTLP SMCNIYVPVQ 151 CQQQQQLGRQ QQQQLQEQLK PCATFLQHQC RPMTVPFPHT PVQKPTSCQN 201 VQSQCLAAS TDPRAIPLPS HS - propeptide di 25 aa, invece di 20 - inizio della proteina con LET, invece di MET Glia α-2 PQPQLPYPQ Glia α-9 PFPQPQLPY Glia α-20 FRPQQPYPQ Glia α- QGSFQPSQQ Glia γ2 FPQQPQQPF Glia γ1 PQQSFPQQQ Glia γ30 IIQPQQPAQ Glt-156 FSQQQQSPF Glt-17 FSQQQQQPL Glt QGYYPTSPQ Glu-5 QLPQQPQQF - 14 cisteine invece di 8 - no peptidi che attivano i linfociti T intestinali

11 CONCLUSIONI In base alle informazioni ottenute dalle sequenze,
si può iniziare a chiarire la tipologia delle proteine implicate nella risposta immunogenica della CD Probabilmente dovremmo considerare tutto il gruppo delle prolamine tra le proteine immunogene della CD e non solo la gliadina Dai risultati di immunoblotting si evidenzia il riconoscimento delle glutenine

12 LAVORO IN CORSO Clonazione della proteina gi/32400760
per verificare il suo coinvolgimento nella CD


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