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Dottorato in Medicina materno-infantile, pediatria dello sviluppo e delleducazione, perinatologia (XXI ciclo, 3° anno) Università degli Studi di Trieste.

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1 Dottorato in Medicina materno-infantile, pediatria dello sviluppo e delleducazione, perinatologia (XXI ciclo, 3° anno) Università degli Studi di Trieste BURLO GAROFOLO Istituto di ricovero e cura a carattere scientifico Dipartimento di Scienze della Riproduzione e dello Sviluppo Dott. Vecchiet Monica GLUTINE E CELIACHIA

2 LA MALATTIA CELIACA autoimmunitàtTg CD 0.5-1% della popolazione dietaglutine genetica HLA-DQ2 HLA-DQ8 cellule T agenti infettivi

3 PROTEINE DEI CEREALI ALBUMINEacqua GLOBULINEsali PROLAMINEalcol GLUTENINEacidi SOLUBILITÀ FUNZIONE Riserva Strutturali e metaboliche Protettive

4 ANTICORPI : phage display DNA da linfociti B intestinali VH VL CH1 CH2 CH3 CH2 CH3 CH1 CL costruzione dellAb in forma di scFv display sulla superficie del fago selezione su Ag di interesse recupero degli Ab specifici contro lAg di interesse È possibile ricreare lintero repertorio anticorpale di un individuo mediante il trasferimento di alcuni geni del suo sistema immunitario in un batterio e la successiva espressione degli Ab in fusione con proteine fagiche

5 ANTIGENE - GLUTINE METODO di SILANO Glut Glia GT Glut Glutalch Glia F Glia MW KDa (The Journal of Biological Chemistry, 1967, 242(3), ) (Nahrung Food, 1999, 43(3), ) (Ferrante, Masci et al., 2006, 6(6), )

6 Anticorpo - scFv 1 Glut Glut alch Glia F Glia GT MW KDa Le condizioni denaturanti dellSDS-PAGE modificano lepitopo riconosciuto modificano lepitopo riconosciuto dal frammento anticorpale ? Glia F Glia GT Lepitopo si trova su aggregati di gliadine?

7 Anticorpo - scFv 2 Glut Glut alch Glia F Glia GT KDa pH 10pH 3 MW + Glut KDa MW + Glut pH 10pH KDa I dimensione II dimensione

8 SEQUENZIAMENTO PROTEICO Centro di Spettrometria di Massa Proteomica e Biomolecolare dellIstituto di Scienze dellAlimentazione-CNR di Avellino Start–EndObservedMr(expt)Mr(calc)DeltaMissSequence 68– R.TPFPQTR.G 75– R.GEQHSSCQTVQHQCCR.Q 91– R.QLVQIPEaAR.C 103– K.AIQSVEEAIIQQQPQQQWNEPQQEAHLK.S 134 – R.MSLQTLPSMCNIYVPVQCQQQQQLGR.Q Start-EndObservedMr(expt)Mr(calc)DeltaMissSequence L.WLATMKTMF.I L.ALAASTAIAQL.E F.GQCQHHQQL.G F.GQCQHHQQLGQQQL.L F.GQCQHHQQLGQQQLL.D W.NEPQQEAHL.K Y.VPVQCQQQQQL.G L.GRQQQQQL.Q L.GRQQQQQLQEQL.K L.GRQQQQQLQEQLKPCATF.L L.QEQLKPCATF.L digestione con tripsina digestione con chimotripsina riduzione, alchilazione e digestione con endopeptidasi

9 spot ALTO (35.2 KDa) WLATMKTMF LWLATMKTMF ALAAS ILALLALAAS TAIAQL TAIAQLETIC GQCQHH SQGFGQCQHH QQLGQQQLL QQLGQQQLLD 51QMKPCVAFVQ TTPF HQCSPVRTTPFPQTRGEQHSSCQTVQHQCCRQLVQIPEQAR AIQSVEEA 101CKAIQSVEEAIIQQQPQQQW NEPQQEAHLK MSLQTLP SMRMSLQTLP SMCNIYVPVQ CQQQQQLGRQ 151CQQQQQLGRQQQQQLQEQLK PCATF PCATFLQHQCRPMTVPFPHTPVQKPTSCQN 201VQSQCLAASTDPRAIPLPSHS aa identificati in seguito a digestione con tripsina aa identificati in seguito a digestione con chimotripsina aa sovrapponibili dalle due digestioni gi/ LMW-GS del Triticum aestivum PM 25.9 KDa e P.I. 8.4

10 CARATTERISTICHE DI gi/ LWLATMKTMF ILALLALAAS TAIAQLETIC C SQGFGQCQHHQQLGQQQLLD C 51QMKPCVAFVQ C HQCSPVRTTPFPQTRGEQHSS CCC CQTVQHQCCRQLVQIPEQAR C 101CKAIQSVEEAIIQQQPQQQWNEPQQEAHLKSMRMSLQTLP C SMCNIYVPVQ C 151CQQQQQLGRQQQQQLQEQLK CC PCATFLQHQCRPMTVPFPHT C PVQKPTSCQN C 201VQSQCLAASTDPRAIPLPSHS propeptide propeptide di 25 aa, invece di 20 LETMET - inizio della proteina con LET, invece di MET - no peptidi che attivano i linfociti T intestinali Glia α-2PQPQLPYPQ Glia α-9PFPQPQLPY Glia α-20FRPQQPYPQ Glia α-QGSFQPSQQ Glia γ2FPQQPQQPF Glia γ1PQQSFPQQQ Glia γ30IIQPQQPAQ Glt-156FSQQQQSPF Glt-17FSQQQQQPL GltQGYYPTSPQ Glu-5QLPQQPQQF 14 cisteine cisteine invece di 8

11 CONCLUSIONI In base alle informazioni ottenute dalle sequenze, si può iniziare a chiarire la tipologia delle proteine implicate nella risposta immunogenica della CD Probabilmente dovremmo considerare tutto il gruppo delle prolamine tra le proteine immunogene della CD e non solo la gliadina Dai risultati di immunoblotting si evidenzia il riconoscimento delle glutenine

12 LAVORO IN CORSO Clonazione della proteina gi/ per per verificare il suo coinvolgimento nella CD


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