Sequenziamento enzimatico del DNA (Sanger)

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1 Sequenziamento enzimatico del DNA (Sanger)
T G C A

2 5’ 3’ TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’

3 TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
5’ 3’ AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’

4 TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
5’ 3’ AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’ TTACGTAACGTCA 5’ 3’

5 TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
5’ 3’ AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’ TTACGTAACGTCA

6 TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
5’ 3’ AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’ TTACGTAACGTCA dATP dCTP dGTP dTTP + DNA Polimerasi

7 TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
5’ 3’ AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’ TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT

8 TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
5’ 3’ AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’ TTACGTAACGTCA dA dC dG dT + DNA Polimerasi ddATP ddCTP ddGTP ddTTP dATP dCTP dGTP dTTP + DNA Polimerasi

9 TTACGTAACGTCAG 14 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGA 15 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGAA 16 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGAAC 17 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGAACG 18 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGAACGT 19 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGAACGTC 20 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA

10 - Elettroforesi Laser Fluorimetro +

11 A C G T - Elettroforesi Lettura G Laser Fluorimetro +

12 A C G T - Elettroforesi Lettura GAAC Laser Fluorimetro +

13 Elettroferogramma

14 Sequenziamento enzimatico del DNA (Sanger)
T G C A

15

16 Metodi di marcatura degli acidi nucleici

17 Traccianti utilizzati
Nucleotidi marcati con isotopi radioattivi

18 Traccianti utilizzati
Nucleotidi marcati con sostanze non radioattive

19 Traccianti utilizzati
Nucleotidi marcati con sostanze non radioattive Fluorocromi (marcatura diretta) Enzimi (perossidasi, fosfatasi alcalina) Digossigenina (riconosciuta da anticorpi specifici marcati con fluorocromi o enzimi) Biotina (riconosciuta da avidina marcata con fluorocromi o enzimi)

20 Traccianti utilizzati
Fluorocromi

21 Strategie di marcatura
Marcatura delle estremità mediante polinucleotide chinasi

22 Strategie di marcatura
Sintesi di DNA mediante random priming

23 Strategie di marcatura
Nick Translation 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ DNAsi I E. Coli Pol I Attività esonucleasica 5’-3’ + nucleotidi marcati Attività polimerasica 5’-3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’

24 Strategie di marcatura
PCR 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ Vantaggi: elevata attività specifica, necessarie poche molecole di stampo

25 Strategie di marcatura
Sintesi di RNA antisenso mediante RNA polimerasi

26 Strategie di marcatura
Sintesi di cDNA mediante transcrittasi inversa

27 Tecniche di rivelazione degli acidi nucleici basate su ibridazione dopo separazione elettroforetica mediante gel di agarosio. Il Southern blot analizza il DNA, il Northern blot l’RNA.

28 Strategia generale

29 Altra forma di ibridazione su membrana: il dot blot (sia con campioni di RNA che di DNA)
1 1 2 3 4 2 5 6 7 8 3 9 10 11 12 4 13 14 15 16 Dot blot

30 Preparazione dei campioni prima della corsa elettroforetica
Nel southern blot il DNA (sia genomico che plasmidico) viene digerito con enzimi di restrizione. Nel northern l’RNA deve essere denaturato. Si può usare RNA totale o RNA messaggero purificato (PolyA+)

31 Cella elettroforetica per gel di agarosio

32 - + DNA genomico RNA totale mRNA M E6 E4 28S 18S DNA satellite 7S 10 9
5 4 3 18S 2 DNA satellite 1 7S +

33 Trasferimento capillare da gel di agarosio

34 Trasferimento elettrico da gel di agarosio

35 Membrana dopo trasferimento

36 Marcatura della sonda tramite
random priming

37 SOUTHERN BLOT

38 RFLP= restriction fragment length polymorphism

39 Individuazione diretta di mutazioni patogene tramite
identificazione di RFLP In rari casi la mutazione patogena può abolire o creare un sito di restrizione

40 I polimorfismi delle VNTR (Variable number of Tandem Repeat)
-DNA genomico viene digerito con enzimi ben conservati che Fiancheggiano uno specifico locus VNTR. -Lo schema di RFLP non dipende da RSP, bensì da numero di volte un cui una unità è ripetuta in tandem -sonda: sequenza unica del locus

41 DNA FINGERPRINT (impronta digitale del DNA)
-Se il locus VNTR fa parte di una famiglia di DNA ripetitivo, si può usare come sonda una unità ripetuta, al posto di una seq unica del locus -Si produce uno schema polimorfico complesso che permette di discriminare tra due individui qualsiasi che non siano gemelli identici