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Università degli Studi di Torino Corso di Laurea Specialistica Biotecnologie Mediche Immunologia Molecolare Genuardi Elisa Emoglobinuria Parossistica Notturna.

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Presentazione sul tema: "Università degli Studi di Torino Corso di Laurea Specialistica Biotecnologie Mediche Immunologia Molecolare Genuardi Elisa Emoglobinuria Parossistica Notturna."— Transcript della presentazione:

1 Università degli Studi di Torino Corso di Laurea Specialistica Biotecnologie Mediche Immunologia Molecolare Genuardi Elisa Emoglobinuria Parossistica Notturna 22 novembre 2007

2 LEmoglobinuria Parossistica Notturna (PNH) è una rara patologia acquisita caratterizzata da unespansione clonale non maligna di una o più cellule staminali ematopoietiche, causata da mutazioni somatiche a livello del gene PIGA sul cromosoma Xp22 [2]

3 …Un po di Storia… 1866: Sir William Gull descrisse il caso di un giovane paziente con ematinuria 1882: Strubin, riconobbe Hb come pigmento delle urine nei casi descritti 1928: Enneking conia il nome di Emoglobinuria Parossistica Notturna 1930: Ham osserva che i globuli rossi nella PNH sono sensibili alla lisi mediata dal complemento 1956: deficit di AChE negli eritrociti di pz con PNH : identificazione delle proteine transmenbrana mancanti nei globuli rossi si pz con PNH con un ruolo nella lisi complemento-mediata 1993: Kinoshita isola il gene PIG A come responsabile delle caratteristiche molecolari dellEMOGLOBINURIA PAROSSISTICA NOTTURNA

4 …PIG A e biosintesi delle GPI anchor proteins… …PIG A e biosintesi delle GPI anchor proteins… PIG A [5]

5 …le Conseguenze…. [5]

6 CD59 CD55 …CD 55 e CD 59…

7 Azione su C3-C5 convertasi inibisce MAC inibisce MAC Azione su C3-C5 convertasi Microvescicolazione complessi MAC e lisi cellule piastrine Deficit u-PAR INIBIZIONE ATTIVITA FIBRINOLITICA e INDOTTA ESPRESSIONE ATTIVITA PROTROMBINICA [6]

8 …Caratteristiche Cliniche… Emoglobinuria Trombosi Anemia Disfagia Dolori addominali Spasmi esofagei Impotenza maschile

9 …Diagnosi… TEST DI HAM studia la sensibilità delle emazie al complemento in mezzo acido a ph 6.5 e a 37°C TEST AL SACCAROSIO studia lanomala sensibilità al complemento delle emazie in un mezzo a debole forza ionica LIMITI Non sensibile No quantificativo Falsi negativi Adattata da Pasquinelli F.Diagnostiche e Tecniche di Laboratorio

10 CITOFLUORIMETRIA Permette la quantificazionePermette la quantificazione Tecnica sensibile (minimo 0,003% cells GPI -AP-)Tecnica sensibile (minimo 0,003% cells GPI -AP-) Utilizzo di MoAb che riconoscono GPI anchor proteins (anti-CD55 e anti CD 59) e Moab verso marker specifici delle linee cellulariUtilizzo di MoAb che riconoscono GPI anchor proteins (anti-CD55 e anti CD 59) e Moab verso marker specifici delle linee cellulari [8]

11 FLAER (Fluorescently Labelled Inactive variant of the Protein Aerolysin) Identifica, in base alla % cloni PNH, pazienti a rischio di trombosiIdentifica, in base alla % cloni PNH, pazienti a rischio di trombosi La % di granulociti è indice di dolori addominali, grado di emolisi, spasmi orofagei e disfunzioni erettili.La % di granulociti è indice di dolori addominali, grado di emolisi, spasmi orofagei e disfunzioni erettili. Alta affinità e specificità per lancora delle GPI-APsAlta affinità e specificità per lancora delle GPI-APs [6]

12 …MOSAICISMO CELLULARE SOMATICO… [2]

13 …MOISACISMO CELLULARE SOMATICO… Osservato con test di sensibilità alla lisi complemento-mediata e confermato con esperimenti di citofluorimetria e FLAER Pazienti con PNH possono presentare 3 popolazioni di GR: PNH I normali, GPI-APs presenti PNH II deficit parziale di GPI-APs PNH III deficit totale La gravità della patologia è molto influenzata dalla percentuale di cellule appartenenti alle 3 popolazioni!! [1]

14 ???MOSAICISMO CELLULARE SOMATICO???? Xp22 Gene PIG A(6 esoni) Esone 1 molto corto, non è tradotto Esone 2 codifica per gran parte del trascritto Proteina di 54 kD, 484 aa con una sequenza idrofobica di 27 aa nei pressi del C- terminale Modelli in vivo: KO Pig A letale a livello embrionale KO condizionali emolisi intravascolare (conferma aspetti clinici) [1] [9]

15 Donne e uomini: stessa frequenza di PNH HSC XX Inattivazione X HSC XY Mutazioni somatiche su PIG A PNH

16 … Le Mutazioni … 1995 Bessler et al analizzano il cDNA di PIG A in quattro linee cellulari GPI-AP- La perdita del trascritto funzionante è dovuta a exon skipping dellesone 2 INSERZIONI E DELEZIONI: Mutazioni missense (cambio aa)Mutazioni missense (cambio aa) Mutazioni nonsense (stop codon prematuro)Mutazioni nonsense (stop codon prematuro) Mutazioni su siti di splicing (lunghezza mRNA e stabilità)Mutazioni su siti di splicing (lunghezza mRNA e stabilità) DELEZIONE regione promoter (CAAT motifs), esone 1 e parte dellintrone 1 determina una diminuita ma non assente espressione delle GPI-APs [10]

17 2005 Hu et al. osservano mutazioni a livello di PIG A anche in cellule di sani Policlonali Avvengono su cellule che non si autorinnovano [11]

18 Molti studi clinici individuano in pazienti con patologie ematologiche una percentuale di cellule GPI-APs - ANEMIA APLASTICA MIELODISPLASIE PNH P.S: anche i sani hanno mutazioni somatiche in PIG A

19 HSC Antigene self ??? GPI-AP??? Riconosciuto come non self REAZIONE AUTOIMMUNITARIA HSC PIG A mut ESCAPE ALLA REAZIONE IMMUNITARIA Ma Deficit di GPI-APs EMOLISI e PNH!!!!

20 … DUE REQUISITI… Presenza di mutazioni a livello di PIG APresenza di mutazioni a livello di PIG A Presenza di un microambiente idoneo, da cui le cellule GPI-APs – possono trarre un vantaggio selettivo alla crescita ( escape alla reazione autoimmunitaria)Presenza di un microambiente idoneo, da cui le cellule GPI-APs – possono trarre un vantaggio selettivo alla crescita ( escape alla reazione autoimmunitaria) Nei pazienti con PNH le mutazioni a carico del gene PIG A sono CLONALI ( colpiscono la stessa regione del gene)Nei pazienti con PNH le mutazioni a carico del gene PIG A sono CLONALI ( colpiscono la stessa regione del gene) Il clone che trae maggior vantaggio alla crescita dal microambiente autoimmune, prolifera senza limiti per ripristinare una normale emopoiesi Telomere Restriction Fragments di pz con PNH è molto più corto rispetto ai sani evidenza di una spiccata proliferazione A livello periferico si riflette la mancanza delle GPI-APs IL CLONE PNH NON È UNO STATO PRELEUCEMICO!!!

21 La PNH è una rara patologia acquisita caratterizzata da unespansione clonale non maligna di una o più cellule staminali ematopoietiche Sono affetti da PNH persone nel Nord America e Europa OccidentaleSono affetti da PNH persone nel Nord America e Europa Occidentale Età di insorgenza: anni (10% dei casi insorge a 21 anni o meno)Età di insorgenza: anni (10% dei casi insorge a 21 anni o meno) 50% dei pz muore per trombosi, infezioni (America – Europa occidentale) o neoplasie ematologiche (Asia e paesi Orientali)50% dei pz muore per trombosi, infezioni (America – Europa occidentale) o neoplasie ematologiche (Asia e paesi Orientali) Sopravvivenza stimata 10 anniSopravvivenza stimata 10 anni … un po di dati… Terapia mirata ad ogni singola caratteristica clinicaTerapia mirata ad ogni singola caratteristica clinica Classical PNH PNH associata a bone marrow failure Subclinical PNH (nessun segno clinico di emolisi)

22 …TERAPIA… CORTICOSTEROIDI emolisi cronica ANDROGENI in possibile combinazione con STEROIDI inibizione del complemento SOMMINISTRAZIONE FERRO e FOLATI/TRASFUSIONI anemia (attenzione alle patologie da sovraccarico di ferro e incompatibilità sistema ABO) WARFARINA trombosi Ma il futuro è…. ECULIZUMAB (against complement C5)

23 1.Parker C.J., The pathophysiology of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, Experimental Hematology 35, 523(2007) 2.Luzzatto L., Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: an acquired genetic disease with somatic-cell mosaicism, Current Opinion in Genetics & Development 16,317(2006) 3.Boccuni P. et al, Glycosyl phosphatidylinositol (GPI)-anchored molecules and the pathogenesis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, Critical Reviews in Oncology:Hematology 33, 25 (2000) 4.Dacie J.V., Lewis S.M.,Paroxymal Nocturnal Haemoglobinuria: clinical manifestations, haematology, and nature of disease, Ser.Haemat vol V,3 (1972) 5.Meletis J., Terpos E.,Recent insights into the pathophysiology of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, Med Sci Monit, 9(7),161 (2003) 6.Savage W.,Bodsky R.A., New insight into paroxymal nocturnal haemoglobinuria, Haematology, 12(5),371(2007) 7.Moyo V.M. et al, Natural history of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria using modern diagnostic assays, British Journal of Haematology, 126, 133 (2004) 8.Richards S.J. et al, Recent advances in the diagnosis, monitoring, and management of patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, Cytometry Part B (Clinical Cytometry), 72B,291(2007) 9.Rosse W.F., Ware R.E., The molecular basis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, Blood, No 9, Vol 86, 3277(1995) 10.Bessler M. et al, Paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH) is caused by somatic mutations in the PIG-A gene, The EMBO Journal, vol. 13, 110(1994) 11.Hu R. et al, PIG-A mutations in normal hematopoiesis, Blood, n°10, vol105, 3848(2005) …References…

24 11. Johnson R.J., Hillmen P., Paroxymal nocturnal haemoglobinuria: naturegene therapy, J Clin Pathol: Mol Pathol, 55,145 (2002) 12. Parker C. et al, Diagnosis and management of paroxymal nocturnal haemoglobinuria, Blood, n°12, volume 106, 3699 (2005) 13.Karadimitris A. et al, Severe telomere shortening in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria affects both GPI and GPI hematopoiesis, Blood, n°13, volume 102, 514 (2003) 14.Parker J. et al, Eculizumab, Nature Review-Drug Discovery, 6,515 (2007)


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